原位核酸分子杂交技术

原位核酸分子杂交技术 原位核酸分子杂交技术 第一节 原位核酸分子杂交技术的发展第二节 (一)固定 (二)玻片和组织切片的处理 (三)杂交 (四)杂交后处理 (五)显示 (六)对照实验和结果的判断 第三节 原位DNA和DNA (一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA (二)生物素标记HPV-DNA探针在石蜡切片上检测HPV-DNA 第四节 RNA原位核酸杂交方法 一、基本原理 二、 RNA原位杂交中探针 (一)探针种类 (二)探针标记 (三)探针的纯化 (四)杂交前准备 (五)杂交前探针的选择 三、 cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交 (一)组织的前处理 (二)RNA探针的标记 (三)预杂交 (四)原位杂交 (五)杂交后处理 (六)杂交后显色 四、用寡核苷酸探针检测组织中的 RNA原位杂交 (一)组织的前处理 (二)杂交预处理 (三)寡核苷酸探针选择和标记 (四)预杂交 (五)杂交 (六)杂交后处理 (七)免疫检测及显色 (八)阳性信号的评定 (九)原位杂交的对照 五、用 cDNA探针检测体外培养细胞中的RNA原位杂交 (一)细胞的准备、固定和细胞的通透 (二)原位杂交 (三)杂交后洗脱 (四)免疫荧光检测 六、 RNA原位杂交现状和进展 (一)组织前处理的改进 (二)杂交的信号放大 (三)RNA原位杂交与免疫组化双重检测技术 (四)多重RNA原位杂交技术 第五节 第六节 一、杂交、免疫组织化学方法 二、免疫细胞化学 -杂交结合方法 三、对照 第七节 双重 一、放射性探针与生物素探针结合双重杂交方法 (一)一步法 (二)二步法 二、非放射性探针的双重原位杂交方法 (一)双重荧光探针原位杂交方法 (二)生物素和地高辛标记探针的双重原位杂交方法 第八节 原位杂交的 PCR增敏法 第九节 原位杂交的 CSA 第十节 一、特异性的探针试剂 二、探针标记 三、原位杂交信号的检测试剂 四、成套原位杂交检测试剂盒 五、如何选择原位杂交试剂 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交 (in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。 第一节 原位核酸分子杂交技术的发展 原位杂交 1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno Nardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。 非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2，4苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂信号。 Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶 DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同又可分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核甘酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single stranded,ssDNA)和双链DNA(Double stranded,dsDNA)之分。所以原位杂交可分为DNA-DNA，cDNA-RNA,RNA-RNA和寡核苷酸探针与DNA或RNA等杂交方式。原位杂交技术在生命科学的研究中可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展 . 第二节 原位分子杂交技术的基本方法 原位杂交技术的基本方法包括:?杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等;?杂交;?杂交后处理;?显示 (visualization):包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。 (一)固定 原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的 DNA或RNA的水平;使探针易于进入细胞或组织。 DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。 1的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。 2Bouin′s固定剂也能获得较满意的效果。 3mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1~2 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4?冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 44%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在-70?。如冰箱温度恒定，在-70?切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋 白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂:酒精/醋酸混合液、Bouin′s液、Carnoy′s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存 RNA，而且对组织结构有损伤。 戊二醛较好地保存 RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。 (二)玻片和组织切片的处理 1 玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡 24 h，清水洗净烘干， 95%酒精中浸泡24 h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150?或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。 要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾点是价廉易得，粘附效果较差。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵。一种新的粘附剂 APES粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。 2 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂 (detergent)或称清洗剂Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应填为掌握。蛋白酶K(Proteinase K)的消化作用的浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用蛋白酶K 1μg/ml(于0.1 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37?孵育15~20 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，Burns等(1987)报道应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100 μg/ml(用0.1 N HCl配)37?、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。 3 背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后 (Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐 (acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。预杂交 (Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖 (Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 在杂交后洗涤中采用低浓度的 RNA酶溶液(20μg/ml)洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA酶，减低背景染色。 4RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有 RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温 (240? )烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必需在150?左右。(三)杂交(Hybridsation) 杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能使有限的杂交液 均匀覆盖。可将复有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量 5×SSC或2×SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。 (四)杂交后处理(Post hybridisation treatment) 杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。 RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的 RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。 (五)显示(Visualization) 显示又可称为检测系统 (Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象检测仪 (computerassisted image analysis)检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图象分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。但做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的间隔时间等。如为放射自显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。 (六)对照实验和结果的判断 对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种。 1cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。 2(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。 3RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交。应用同义RNA探针(Sense probe)进行杂交。 4(空白试验)。 5 6 第三节 原位 DNA和DNA分子杂交方法 DNA探针在病毒的检测等领域中得到广泛的应用。杂交时需先在高温 80~95?短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅速置于冰上冷却。然后置于37~42?杂交过夜。 (一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法 1 (1)固定:组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚4~6 μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱 60~80? 6~8 h，使切片更紧粘贴于玻片。 (2)脱蜡:二甲苯10 min×2,自100%乙醇?和?， 95%，90%，70%，50%，30%各5 min。入PBS(含5 mmol/L MgCl2,pH7 3~7 4) 5 min×2。 (3)入0.2 mmol/L HCl 20 min以去除蛋白。 (4)50? 2×SSC,含5 mmol/L EDTA溶液中30 min。 (5)蛋白酶K(1μg/ml溶于0.1 mol/L PBS中)，37? 20~25 min。 (6)0.2 mol/L甘氨酸液:室温10 min,中止蛋白酶反应。 (7)4%多聚甲醛(PBS新鲜配制),室温20 min。 (8)PBS/5 mmol/L MgCl2漂洗10 min×2。 (9)脱水，自低浓度到高浓度至无水乙醇各3 min，空气干燥。 2 20 μl/每张切片，42?水浴半小时。 3 10~20 μl/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95? 10 min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上 1 min，再将切片置于盛有2×SSC湿盒内，42?过夜(16~18 h)。 4 (1)2×SSC液内振动移除盖片。 (2)2×SSC 55? 10 min×2。 (3)0.5×SSC 50? 5 min×2。 (4)缓冲液?(含05%封阻试剂，用缓冲液?溶解)37? 30 min。 (5)缓冲液?(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室温。 (6)酶标地高辛抗体(1?5 000，应用缓冲液?解释)37? 30 min。 (7)缓冲液? 15 min×2，室温。 (8)缓冲液?(100 mmol/L TrisHCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温，2 min。 5 (1)显色液配制:在缓冲液? 1 ml中加入45μl四氮唑蓝(NBT)，35μl X磷酸盐(5溴-4-氯-3吲哚磷酸盐(BCIP)配成。30μl/每张切片，置暗处显色(30 min到2 h。定时抽查切片，镜检其显色情况。 (2)缓冲液?(10 mmol/L TrisHCl,1 mmol/L EDTA,pH80) 10 min终止反应，用核固红或甲绿复染5 min，二甲苯透明，DPX封固，镜检。 6 (二)生物素标记HPV DNA探针在石蜡切片上检测HPV DNA的方法。 1 组织细胞原位核酸杂交主要在载玻片上进行，因此玻片的处理至关重要。载玻片 (或盖玻片)一般要经过 1 mmol/L HCl溶液或重铬酸钾硫酸溶液的浸泡，取出后充分用自来水冲洗，用双蒸水洗三遍，然后置于 60?烤箱中烤干。将烤干的玻片分别插在染色架中，置250?烤箱中烘烤 4 h，目的是去除玻片上残留的核酸酶。处理。把经过 250?烘烤过的玻片用2% 3(APES)丙酮液处理玻片，有助于组织和载玻片的粘附。APES对甲醛固定的组织粘附效果好，可使组织与载玻片发生共价结合。 玻片硅化方法: (1)室温下将高温处理过的载玻片用2% APES丙酮液浸泡3 min;(2)用丙酮洗去多余 的APES;(3)用DEPC处理的蒸馏水或高压消毒的蒸馏水清洗玻片1~2次;(4)40?烤干玻片，防污保存在干燥器皿中待用。整个处理过程均要戴消毒手套进行操作。 2 常用的原位杂交标本有石蜡切片、冰冻切片和细胞培养标本。无论是哪一类的标本，在制备时都要尽量避免 RNase污染。操作时要戴手套，要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀、镊子等。石蜡切片时，展片要用高压消毒处理过的蒸馏水，裱片后把切片置 60?烤箱中烤片1~3 h。置室温下保存备用。新鲜组织切片最好先用固定剂固定(如用4%多聚甲醛或冷丙酮固定10 min)，吹干后-70?保存或在70%酒精中4?保存，培养细胞标本的处理方法与冰冻切片法相似。 3 目的在于提高组织的通透性 ,以防止DNA探针与细胞、组织之间的非特异结合，以增强杂交信号 ,减少背景着色。 (1)脱蜡 石蜡切片必需充分脱蜡 ,因为石蜡未脱净会影响探针的穿透力,因而脱蜡用的二甲苯尽可能新鲜。常规石蜡切片用二甲苯脱蜡 3次,每次5 min;脱蜡后用逐级梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗,然后用蒸馏水洗3 min,必须用高压处理过的蒸馏水。 (2)蛋白酶处理 蛋白酶的消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露,以增加探针与靶核酸结合的机会。常用的蛋白酶有蛋白酶 K(proteinase K)、链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)、蛋白酶BP等。 蛋白酶的浓度及消化时间 ,视组织种类、固定类型、切片厚度而定,一般使用1 μg/ml蛋白酶K(用含50 mmol/L EDTA的pH80,01 mol/L TrisHCl缓冲液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80 PE )37?孵育10~30 min。蛋白酶具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用,促进探针渗透,从而提高杂交信号。配制 但过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及靶核酸的减少,也会导致标本从载玻片上的脱落。 4 (1)变性和杂交 进行杂交反应时 ,探针和靶核酸都必须是单链。如果用双链cDNA探针检测,则探针和靶核酸都必须先解链 ,也就是变性。将生物素标记的双链探针杂交液滴在待检组织上,然后加盖经 250?高温处理过的盖玻片,勿产生气泡,并在盖玻片周边用石蜡油封边(目的是防止探针和杂交液在杂交过程中蒸发),将含有探针的载玻片放入已经加热煮沸(95~100?)的水浴箱的密封盒中(容器底部预先加入适量的蒸馏水)变性5~10 min。探针和靶DNA同时变性,变性的单链探针与靶DNA随即进行杂交反应。如果用单链探针与靶DNA进行杂交,虽然探针本身并不需要变性,但也可将探针加在组织标本上,用上述方法使靶DNA变性。变性完毕将切片放在冰块上迅速降温1~2 min,然后将切片移入湿盒内置37?培养箱杂交60 min。如有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交,先调整好原位杂交仪的变性、杂交时间和温度,将玻片放入杂交仪内进行变性杂交,当杂交仪升温至95?时即可进行变性,变性后温度迅速下降到37?时即可进行杂交反应。 (2)杂交后漂洗 其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针 ,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色 ,增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒 (或杂交仪)中取出,用2×SSC将盖玻片洗脱,2×SSC 30?洗2次,每次15 min;1×SSC 42?洗2次,每次15 min;05×SSC 37?洗2次,每次15 min,TBS缓冲液洗2次。注意在漂洗过程中切不要使切片干燥。 (3)杂交信号的检测 探针与靶核苷酸结合形成杂交体 ,对其检测的方法因探针的标记物不同而异,一般与免疫组化方法类似 ,当带有酶的抗半抗原抗体(或者抗生物素蛋白)通过搭桥(或直接)与探针连接后,催化底物混合液中的底物发生反应,使其产生有色沉淀物即为阳性反应。现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体(或抗生物素蛋白)连接进行检测。在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素(streptavidin alkaline phosphatase conjugated)溶液,室温孵育20~40 min,TBS缓冲液洗3次×5 min,加入BCIP/NBT室温暗处显色10~30 min,TBS缓冲液洗,01%核固红复染切片5 min,蒸馏水冲洗,酒精脱水,中性树胶封片。 (4)杂交结果 DNA原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位,一般在细胞核内,呈紫蓝色颗粒状,若靶基因数量多或显色时间长,则整个细胞核呈浓染蓝色,阴性细胞核呈红色。 (5)对照试验 ?阳性对照 :用已知含靶核酸序列的组织作对照。 ?阴性对照 :用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。 ?用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。 ?省略标记探针。 ? DNA酶消化靶DNA对照。 〖 HJ1〗(6)非特异性染色 非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等 ;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因 ,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3% H2O2处理5~10 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。 第四节 RNA原位核酸杂交方法 一、基本原理 RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交[6,7,25] (RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合 (杂交 )，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的 mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有:(1)使用的探针不同:RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同:RNA原位杂交检测和分析的主要为 内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。(3)有较高的灵敏度:在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位，而DNA原位杂交则难以信任。但RNA原位杂交也存在某些不足之处，为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点:(1)不同探针种类的选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点;(2)有效制止组织和细胞内RNA降解;(3)实验中严防RNA酶污染;(4)对杂交信号有效的放大和显色技巧;(5)阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件的更需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。(6)在实验流程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证RNA原位杂交成功的必要条件。近几年来RNA原位杂交已得到稳步发展。主要表现在:非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位杂交中应用等。从理论上讲，RNA原位杂交已趋成熟和完善，关键是在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中，促进人们对各类基因识别和表达规律的认识。 二、RNA原位杂交中的探针 (一)探针的种类 RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种:即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。 1. 单链cDNA探针: 由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。 2. cRNA探针:是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链 cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA,RNA杂交体稳定。cRNA,RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是:探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。 3. 寡核苷酸探针:人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是:探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与 mRNA形成的杂交体不如cRNA,RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括 3H、 35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。 (二)探针的标记 在 RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。 1. 酶反应法:用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线 型 DNA或RNA的5'端或3'端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。 2. 体外转录法:体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在 RNA聚合酶的作用下，以 DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体 T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。 SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。 依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶 RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。 (三)探针的纯化 某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余 dNTP等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法的原理是: DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是:交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制 RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15% 的水，从而溶解一部分ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 (四)杂交前准备 1. 载玻片和盖玻片的处理 为有效防止外源性 RNA酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。将载玻片和盖玻片分别浸泡在 5, 洁消精(苏洲吴县化工二厂)中12小时，用35?-40? 温水中冲洗30min，再用双蒸水漂洗3次，每次5min，室温下干燥切片后,在180? 烤箱内烘烤4,6小时，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。 为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落，载玻片应涂以粘附剂，大的冰冻或石蜡切片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。 2. 明胶涂片制备 取 10克明胶(Merck)溶于1000毫升40?,50? 双蒸水中，待明胶完全溶解后加入4毫升25% 硫酸铬钾溶液(chromium potassium sulfate CPS) ，使CPS的终浓度为0.1,。将烘烤后的载玻片浸泡在明胶溶液中10min，在室温下干燥玻片。再将载玻片浸泡在含有1, 多聚甲醛，PH7.4的PBS溶液中10min;在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有1, 多聚甲醛，PH7.4的PBS中10min，在室温下干燥玻片。60? 烤箱内过夜备用。 3. 多聚左旋赖氨酸涂片的制备 取 2-4mg多聚左旋赖氨酸(Sigma)，分子量在300000以上，溶于1ml消毒去离子水中。经旋涡器反复搅拌，吸取20,30μl滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用钻笔标出，室温下干燥切片后，在60?烤箱内过夜备用。 4. 硅烷涂片的制备 取 5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane APES)(Sigma)溶于250ml丙酮内。将烘 烤后的载玻片浸泡硅烷溶液中 60min，用双蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60? 烤箱内过夜备用。 注意事项:载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脱落，不干扰杂交信号，低背景，经济及制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上的 RNA酶的污染。多聚左旋赖氨酸溶液的溶度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备载玻片应尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。 5. 新鲜标本的储存和冰冻切片制备 为 RNA原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防RNA酶的污染，制备过程中所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0.1% 焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate DEPC)水清洗。为防止RNA迅速降解，标本离体后，先切成1.5×1.2cm大小，其厚度不超过0.2cm，应迅速投入4, 多聚甲醛溶液内，置4? 冰箱内2 -4小时。再将组织移入30, 蔗糖PBS溶液内，4? 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80? 或-140? 超低温冰箱内保存。如作冰冻切片，先将组织在-20? 恒冷切片机内停留,待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成7μm薄片。40? 烤箱内干燥切片2小时后储存在-80? 或-140? 超低温冰箱内备用。 6.标本的固定和石蜡切片的制备 石蜡切片作 RNA原位杂交的，也应严防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的过程同冰冻切片。为防止RNA迅速降解，离体后标本应立即有效固定。为保存良好组织结构，有利探针的穿透力，应选用合适的固定剂。常用的化学固定剂可分为，沉淀固定剂和交联固定剂两类。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入，但过长时间固定，可引起RNA降解。其不足之处是:组织形态结构的保持不如交联固定剂。交联固定剂能较好保存组织中RNA和组织形态结构，但固定时间过长，也可发生胞浆和胞核内大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。 4,多聚甲醛固定液 取 4g多聚甲醛和0.25g甘氨酸分别溶于100ml 0.01mol/L PH7.0 PBS溶液，组织在常温下浸泡于4, 多聚甲醛中4小时，每1小时将组织在真空下吸干10min，再注入新的固定液，共4次。然后用0.01mol/L PH7.0的PBS漂洗2次，每次30min。 福尔马林醋酸固定液 福尔马林醋酸固定液由 50, 酒精、10, 福尔马林和5, 醋酸组成。在常温下将组织浸泡4小时，每 1小时在真空下吸干10分钟，再注入新的固定液，共4次，然后用50, 酒精漂洗2次，每次30min。 (五)杂交前探针的选择 1. RNA探针: RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长 500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。 (1)孵育时间t = Lf- Lo / K × Lo ×Lf (Lo,核酸探针原长度(kb)，Lf,核酸探针水解后所需长度 (kb)，K 是常数率,0.11kb/min)。 (2)在室温中加入下列试剂终止水解:3mol/L醋酸钠，6.6μl(终浓度0.1mol/L)，醋酸1.3μl(终浓度为0.5%)。 (3)加入下列试剂沉淀探针:7mol/L醋酸铵100μl，100%乙醇 750μl，RNA (10mg /ml) 2μl ，置 -20? 2 小时后恢复到室温，在1400rpm离心30min。 (4)小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddH2O稀释到10ng/μl浓度。 (5)最终探针长度可于10% 聚丙稀酰胺凝胶在60? 的尿素中电泳检测。 2. 探针的长度 原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记 cRNA探针的浓度为0.5ng/μl，而非放射性标记 cRNA探针的浓度1.0ng/μl 。杂交液的量要适当，每张切片以30-50μl为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。 3.杂交的温度和时间 设置和调整杂交温度是 RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(meltingtemperature Tm)20-30?。多数RNA原位杂交Tm为95?，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1, 甲酰胺浓度可降低0.72?。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。一般 RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰胺的电离作用。 三、 cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交 (一)组织的前处理 1. 冰冻切片的制备:(1)离体后组织应切成1.5×1.2cm，厚度为0.2cm。(2)立即投入4, 多聚甲醛溶液中( PBS新配制)，4? 下固定2-4小时。(3)倒去固定液后，加入30, 蔗糖溶液( PBS新配制)，4? 下过夜, 次日将组织块储存在-80? 或-140? 超低温冰箱内。(4)或将组织块置于 -20? 恒冷切片机内切成10μm薄片，粘附于涂有粘附剂的载玻片上置室温下，置 40? 恒温箱内过夜，或置40? 恒温箱内至少2小时，后将切片放入切片盒在-80? 超低温冰箱内存放备用。 2. 组织的固定和石蜡切片的制备:(1)离体后组织切成不大于1.5× 1.2cm、厚0.2cm。(2)立即投入 4% 多聚甲醛溶液内(PBS新配制),或2.5, 戊二醛，在室温下固定3-4小时。(3)用PBS冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。(4)切成5μm薄片粘附于涂有粘附剂的载玻片上，在40? 恒温箱内过夜干燥切片，用新的二甲苯脱蜡2×10min和100,、95,、70,、各级酒精1×5min，ddH2O漂洗2×5min。 注意事项 (1)切除的新鲜标本应立即作组织固定或低温储存，以免mRNA降解。 (2)标本尽可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰冻切片，这一制备法既能避免mRNA降解，又能保持良好的组织形态。 (3)对外检病例中，采用10, 福尔马林固定标本的，为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联 (4)在冰冻切片和石蜡切片制作过程中，所使用的容器、器械都要经高压消毒，或清洁后用0.1% DEPC水 清洗，再经ddH2O冲洗，避免外源性RNA酶污染。 (二)RNA探针的标记 RNA探针的制备需将cDNA探针克隆到带有RNA多聚酶启动子的质粒，然后转录制成RNA探针。用 EDTA缓冲液和DEPC处理的ddH2O将会影响RNA多聚酶中的质粒。RNA探针的长度应,500bp，,500bp的探针不易与mRNA形成杂交体。对探针标记、预杂交、杂交和后杂交流程中使用的容器、ddH2O均需经0.1% DEPC处理，为避免RNA酶污染，操作人员必须戴手套和口罩操作。 RNA探针的纯化:?在杂交探针中加入5μl 10, 乙酸(acetic acicl)，11μl 3mol/L醋酸纳 PH6.0，1μl 10mg/ml tRNA，1.2μl 1mol/L MgCl2，300μl 冷酒精。?在-20? 孵育4-16小时。?在4? 下15min，使RNA发生沉淀。?真空下干燥RNA沉淀物。?用DEPC处理的ddH 2 O含标记的RNA探针10,50μg/ml。RNA探针的水解:按以下方法减少探针长度为近200bp，在Microcentrifuge 管内加入50μl RNA探针标记液，加入30μl 200mmol/L Na2CO3 和20μl 200mmol/L NaHCo3。将杂交探针置于60? 条件下，按以下方法计算水解时间，t ,(L0,Lf)/ (K. LO. Lf) (L0 , RNA探针原长度(kb)，Lf , RNA探针水解后所需长度，K , 常数率(K = 0.11kb/min)，t ,水解时间)。 (三)预杂交 (1)切片用DEPC处理的PBS PH7.4(140mmol/L NaCl ，2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HPO4, 1.8mmol/L KH2PO4) 孵育2×5min，再用DEPC处理的含100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片2×5min。(2)用DEPC处理的含0.3% Triton X-100 PBS孵育15min。(3)用DEPC处理的PBS漂洗2×5min。(4)冰冻切片用TE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH 8.0)不含RNA酶的1μg/ml蛋白酶K，在37? 下通透切片30 min。石蜡切片用TE缓冲液配制的不含RNA酶的5-20μg/ml蛋白酶K，在37? 下通透切片30min。(5)在4? 下用DEPC处理的4, 多聚甲醛PBS 溶液作后固定5min。(6)再用DEPC 处理的PBS冲洗切片2×5min。(7)切片作酸酐处理，处理液含0.25醋酸酐、0.1mol/L 三乙醇胺(Triethanolamine TEA)PH8.0，振荡漂洗2×5min。(8)在37? 孵育切片后，杂交缓冲液冲洗(含50, 去离子甲酰胺的4× SSC)，至少10 min。 注意事项 (1)切片的通透化是RNA原位杂交关键步骤，特别对回顾性资料尤为重要，因固定液种类和固定时间的不同，需作最佳通透化条件探索，包括蛋白酶 K浓度，孵育时间20-30min之间调整，甚至采用 0.2mol/L HCL配制的0.1, 胃蛋白酶。 (2)由于醋酸酐极不稳定，宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中。 (3)1×SSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2。 (四)原位杂交 (1)杂交液 (40, 去离子甲酰胺、10, 葡聚糖、1×Denhardt's 、0.02% Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinylpyrrolidone)、10mg/ml去RNA 酶的牛血清、4×SSC、10mmol/LDTT 、1mg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA)的准备。(2)沥干后用杂交缓冲液漂洗，并沿组织周边擦干，每张切片滴加 30μl探针杂交液(内含5-10ng非同位素标记cRNA探针)。(3)用24×30mm杂交罩(hydrophobic plastic coverslip)复盖杂交组织。(4)置42? 湿盒内过夜。 注意事项:杂交液应新配制，并在 -20? 下储存，新配制杂交液能使用几个月。 (五)杂交后处理 (1)揭去杂交罩将切片浸泡于2×SSC中5 - 10min。(2) 在37? 用 2×SSC 2×15min、1×SSC 2×15min振荡漂洗。(3)为消除未杂交单股cRNA探针，在37? 含RNA酶A 的NTE缓冲液(500mmol/L NaCl,10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,PH8.0)中漂洗30min。(4)置37? 用0.1×SSC振荡漂洗2×30min。 注意事项 在同一容器中不能同时放入含不同探针切片。 (2)如果杂交的背景较高，非特异性信号较多，可采用52? 含5, 甲酰胺的2×SSC洗脱 (六)杂交后显色 (1)用Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-Hcl,150mmol/L NaCl)振荡漂洗切片2×10min。(2)每张切片滴加封闭液 40μl (含0.1% Triton X-100和2% 正常羊血清的Buffer A PH7.5)。(3)抖去封闭液，每张切片加羊抗地高辛抗体AKP结合物30μl (Buffer A内含0.1, Triton X-100,1% 正常羊血清, 羊抗地高辛抗体AKP结合物)在温盒内2小时。(4)用Buffer A振荡漂洗切片2×10min。(5)用Buffer B PH9.5(100mmol/L Tris-Hcl,100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl 2 )孵育切片10 min。(6)显色液配制:用10ml Buffer B PH9.5，内含45μl 硝基四氮唑蓝(Nitroblue tetrazolium NBT)(75mg/ml NBT,70%二甲基甲酰胺)，35μl 5,溴,4,氯,3,吲哚基,磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate BCIP)或X - Phosphate(50mg X - Phosphate/ml,100%二甲基甲酰胺)。(7) 每张切片200μl显色液，在黑暗条件下显色2-24小时。(8)显色满意后用Buffer C PH8.1(10mmol/L Tris-Hcl,1mmol/L EDTA) 冲洗漂洗切片。(9)ddH2O中止反应。(10)用0.02, 亮绿或0.1% 核固红复染细胞核1-2min。(11)用自来水洗2×10min。(12)用即用型(Gva Mount)水溶性封片剂封片。 注意事项 (1)显色液的配制:10ml Buffer B PH9.5溶液中含有45μl NBT(70, 二甲基甲酰胺中含有75mg/1ml NBT)，35μl BCIP或X-磷酸盐(100, 二甲基甲酰胺中含有50mg/ml X-磷酸盐)， 1mmol/L左旋咪唑(levamisole)(2.4mg/10ml左旋咪唑 Sigma)。 (2)抗地高辛抗体,AKP的最佳浓度探索可采用同一杂交切片，用1:100、1:500和1:1000抗体浓度比较之。 (3)如果显色液中用1mmol/L左旋咪唑的浓度，仍然发现内源性磷酸脂的活性较高(背景色)，左旋咪唑的浓度可以增加到 5mmol/L。 (4)NBT/BCIP显色液后杂交切片，不能用二甲苯透明和溶二甲苯的封片剂。 (5)滴加杂交液和显色液应防止流失，除标记切片放平整之外，很重要的原因之一与载玻片的清洁度有关。用 DAKO魔笔沿组织周围划圈，在杂交反应中既可省略杂交罩、又可在显色反应中防止反应液外溢。 四、用寡核苷酸探针检测组织切片中的 RNA原位杂交用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的 mRNA(靶核苷酸)是较为常见的RNA原位杂交。这是因为寡核苷酸探针不仅具有能按靶核苷酸序列设计与特定的靶基因结合，而且以核苷酸为原料通过 DNA合成仪合成。寡核苷酸探针方法简便，探针一般较短组织穿透性好，无须进一步纯化等优点外，而且易于在组织切片内检测靶 mRNA的一种理想的原位杂交探针。作者运用生物素及地高辛标记的寡核苷酸探针，对 17例新鲜乳腺癌组织分别作了RNA原位杂交和Northern杂交。冰冻切片中 RNA原位杂交， ER mRNA阳性率64.6 %(11/17)，PR mRNA为58.9%(10/17),而Northern杂交中ER mRNA阳性率为76.5%(13/17)、PR mRNA阳性率为64.7%(11/17)。上述两种杂交中ER mRNA 阳性、阴性符合率分别 为58.7% 和17.7% , PR mRNA为47.1%和 23.5%。在此基础上作者还对 278例乳腺癌分别作了RNA原位杂交和免疫组化对照检测。石蜡切片中RNA原位杂交，ER mRNA、PR mRNA的阳性率分别为67.3%和61.9%，高于同一组织切片中免疫组化的ER 52.9%和PR的41.8%, ER mRNA、PR mRNA的阴性率为32.7%和38.1%，又低于同一组织切片中免疫组化的ER 47.1%和58.2%。ER mRNA与ER的阳性及阴性符合率分别为48.6 %和28.1%，ER mRNA阳性而ER阴性的占18.7%，ER mRNA阴性而ER阳性的仅占4.3%。PR mRNA与PR的阳性及阴性符合率分别为39.6%、35.9%，PR mRNA 阳性的而PR阴性的占22.3%，PR mRNA阴性而PR为阳性的仅占2.2%。经结合临床随访和组织学分级、淋巴结转移等，得到理想结果。现将原位杂交实验流程介绍如下: (一)组织的前处理 1. 对组织预处理所用的刀具及容器作清洁处理和灭活RNA酶。 2. 将外科或动物实验切取标本切成?1.2×1.0×0.2cm组织块立即冷冻在液氮内储存，或用 4, 多聚甲醛(用新鲜0.05mol/L PH7.4 PBS配制)或中性福尔马林(ddH2O配制， PH 7.0)固定，固定时间以 24-36小时为宜，避免RNA降减或固定过度。 3. 为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10μm, 切片内如含有脂肪组织应在氯仿内孵育5min，以得到好的切片背景，并干澡切片。石蜡切片厚度为 5,7μm，用无RNA酶的防切片脱落的载玻片贴附组织切片。 4. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精处理(100%、95,、80,)至水化(ddH20 3×5min)。 (二)杂交的预处理 ? 恒温箱内干燥切片后，滴加 5-10μg/ml蛋白酶K，置37? 湿盒内孵育30min， ddH 2 0 3×1. 在37 5min 或 4?75, 酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。 2. 0.25% 醋酸酐10min, 经70? 2×SSC漂洗、40? 2×SSC各漂洗15min，2×SSC 3min，切片经75-100% 酒精梯度脱水。 注意事项 1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。蛋白酶K 浓度过低，不能使靶核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制(0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0，50mmol/L EDTA，经高压灭菌后备用)，蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱内分装保存。蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求准确无误。 2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在差异，选用蛋白 K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略。 酶 (三)寡核苷酸探针选择和标记 常用的寡核苷酸探针对已知靶 RNA序列而设计的。特定序列的单一寡核苷酸探针，能与靶mRNA区段的部分序列完全或基本相配对，其长度为19-24核苷酸。这类探针多采用对其5'端进行磷酸化实现。探针通常无须纯化，但是较长的寡核苷酸探针，各片段可能受到污染，应通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将污染的片段除去。 (四)预杂交 1. 将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗 2×5min。 2. 准备杂交液(3×SSC，1×Denhard's液(0.02%(W/V) Ficoll，0.02%(W/V) 小牛血清 ，0.02%(W/V) 聚乙烯吡咯烷酮( polyvinylpyrrolidone)，10% (W/V)葡聚糖，125μg/ml 酵母tRNA，100μg/ml变性和剪切的硅鱼精子DNA，10μg/ml Polyadenylcytidyic acid，50% 甲酰胺 , 20mmol/L 焦磷酸纳 PH7.2)。 3. 按组织片大小， 每张切片滴加40μl杂交液，置37? 温盒内2小时。 (五)杂交 抖去甩干杂交溶液，用 DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30μl 探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在44? 湿盒内孵育过夜。 注意事项 1. 寡核苷酸探针杂交条件，既要保证杂交特异性的严格性，又要具有能在适当速率下形成稳定杂交体的松 动性。一般情况下，用合成寡核苷酸进行杂交的条件要比杂交体的解链温度 (Tm)值降低5,10?。这一条件可以减少短探针杂交可能造成假阳性的硷基错配，也会使完全配对的杂交体形成速率降低。短寡核苷酸与靶序列形成的杂交体极易解体，杂交后漂洗必须尽快进行。 2. 在使用靶序列完全配对的单一寡核苷酸探针时，杂交条件极易从杂交体的Tm值推得。对短于 18个核苷酸的寡核苷酸，将杂交体中A残基数与T残基数和乘以2?，再将残基G与C残基数的和乘以4?，两积相加便得出杂交体的Tm值。但对于含有较长寡核苷酸的杂交体，采用此法结算的Tm值偏高。 注意事项 1. 去离子甲酰胺的浓度(deionized formamide dF)为47%，过高和过低甲酰胺的浓度都会影响杂交结果，当去离子酰胺浓度高于或低于 47,，应加ddH2O调整，并根据Longetal1992年报导，计算去离子甲酰胺百分比公式为: %dF=,GC,寡核苷酸G，C硷基量的百分比，L,寡聚核苷酸探针长度，,mismatch,寡核苷酸不能与靶核苷酸配对硷基的百分比，47,杂交温度，10?(在37?下)。 2. 杂交液内加入变性剪切的鲑鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。 3. 杂交液能在,20?保存几个月。 (六)杂交后处理 1. 将切片置37? 2×SSC中漂洗2×10min。 2. 在37? 2×SSC 漂洗2×15min、1×SSC漂洗 2×15min、0.25×SSC 漂洗2×15min均需用振荡漂洗切片。 (七)免疫检测及显色 1. Buffer A PH7.5(0.1mol/L Tris，1mol/L NaCl，2mmol/L MgCl2，500μl Tween 20)冲洗、漂洗各 3×5 min。 2. 用DAKO魔笔沿组织周围划圈，每张切片滴加Streptavidin-AP(链菌素抗生物素-碱性磷酸酶)抗体30μ ? 温盒内1小时。 l(1μg/ml)，置37 3. Buffer B PH9.5(0.1mol/L Tris，1mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2)冲洗、漂洗各3×5 min。 4. Buffer C PH9.5(0.1mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，5mmol/L MgCl2)冲洗、漂洗各3×5min。 5. 每张切片滴加50-100μl显色液(1 ml Buffer C PH9.5内含0.33mgNBT，0.16mg BCIP，1mmol/L 左旋咪唑在黑暗条件下显色20-40min，显微镜下控制效果。ddH2O中止反应。 6. 用核固红复染1-3min，次日在在37? 恒温箱内干燥切片15min后，单张切片快速经二甲苯，中性树胶封片。 (八)阳性信号的评定 原位杂交的阳性信号位于浆内 , 经NBT/BCIP显色，阳性信号为蓝色，呈细颗粒状。信号越强，颜色越深，呈蓝紫色和紫黑色。阴性对照片内无阳性信号检出。原位杂交的阳性等级按以下方法计算: 1. 阳性细胞数:阳性细胞?10%、?30%、?70% 和,70%分别计1、2、3和4分。 2. 阳性着色强度:杂交信号强度可分为弱、中、强三级分别计1、2和3分，上述两种计分相加, 1-3分者为阴性, 4-5分者为阳性, 6-7分者为强阳性。 (九)原位杂交的对照 原位杂交流程中阴性对照设定 : 在ER mRNA、PR mRNA的阳性组织片中,在杂交过程中加杂交液不加探针 ,在免疫检测中不加Streptavidin-AP等，其结果均为阴性。 注意事项 1. 阳性对照 对已知含有丰富靶mRNA的组织和细胞和不含有靶细胞mRNA的组织和细胞作对照。技术控制包括遵守正确的实验操作和注意事项和不正确实验操作之间的对照。对组织中mRNA保存、RNA和寡核苷酸探针及各种缓冲液配制出现的不应该阳性和阴性结果比较。 2. 阴性对照 对已知缺靶mRNA的组织和细胞为阴性对照。技术控制包括:靶细胞在原位杂交过程中用 RNA酶消化靶mRNA，靶组织的细胞内应无阳性结果检出，杂交用敏感的探针和无关探针应出现差异，检测省略标记探针或略去抗地高辛抗体均为阴性结果。 五、用cDNA探针检测体外培养细胞中的RNA原位杂交 (一)细胞的准备、固定和细胞的通透 ? 5,CO2大气压下，用涂有多聚左旋赖氨酸的显微载玻片上培养细胞。 1. 在37 2. 用37? 0.01mol/L PH7.4 PBS漂洗细胞，用福尔马林醋酸固定液 (用0.9, NaCl 配制，内含 4% 甲醛、5, 醋酸)常温下固定30min。 3. 常温下用0.01mol/L PH7.4 PBC冲洗已固定细胞片，然后将细胞片储存在4?，70% 酒精内。 4. 杂交前处理，按70%、90% 和100% 各级酒精梯度脱水，用二甲苯洗脱细胞片中残留脂滴，再由高浓度酒精至低浓度酒精 (100%、90% 和70%)依次至ddH2O，然后用0.01mol/L PH7.4PBS孵育细胞片。 5. 干燥细胞片后，在37? 湿盒内用0.1% 胃蛋白酶(用0.1N HCl配制)通透细胞片 20min。 注意事项 为有效防止外源性 RNA酶的污染，显微载玻片、盖玻片和培养皿分别参考有关要求作:浸泡、清洗、干燥和用铝箔纸包裹后烘烤灭 RNA酶处理。 (二)原位杂交 1. 选用适合DNA标记的地高辛等标记物，并参考地高辛标记手册。 2. 准备杂交液(60% 去离子甲酰胺、300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA、 25mmol/L NaH2PO4(PH7.4)、5%葡聚酸和 250ng/μl剪切的鲑鱼精子DNA。 3. 在杂交前将标记的cDNA探针在80? 中短暂复性，然后加入杂交液，其浓度为5ng/ml。 4. 滴加10μl杂交混合液(杂交液加探针)于细胞片，置37? 湿盒内杂交16小时。 (三)杂交后洗脱 1. 杂交后在常温下，用60, 甲酰胺，300mmol/L NaCl和30mmol/L 柠檬钠，冲洗漂洗细胞片。 2. 用37? 上述溶液振荡漂洗细胞片3×1min。 3. 用0.01mol/L PH7.4 PBS 漂洗细胞片1×5min。 (四)免疫荧光检测 1. 滴加封闭缓冲液(100mmol/L Tris-HCl PH7.5、150mmol/L NaCl、2% BSA) 置37? 湿盒内 30min，以封闭非特异性结合部位。 2. 沥干细胞片，滴加抗地高辛抗体(1:200、1:500用封闭缓冲液配制) 在37? 内45 min。 3. 用Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.05% Tween 20) 冲洗漂洗各 5min。 4. 由低浓度至高浓度(70%，90%，100%)各级酒精梯度脱水各5min。 5. 空气中干燥细胞片。 6. 滴加甘油显色混合液。 注意事项 甘油显色混合液的配制: 9份甘油比1份(1mol/L Tris-HCl(PH7.5)， 2% 1.4-diaza-bicyclo-[2.2.2]-octane (DABCO)和DNA复染剂(或碘化丙啶Propidium iodide PI 500ng/ml)或 DAPI (75ng/ml) 7. 在荧光显微镜下观察。 六、 RNA原位杂交现状和进展 原位杂交技术能在目的细胞和组织中观察基因和分析基因的缺失、增减和变异，使传统的基础医学和 临床医学研究推进到基因分子认识水平。尤其是 RNA原位杂交已成为最有效的分子工具。从培养细胞检测结果表明，采用荧光素标记探针结合 CCD摄录的图象分析处理系统，原位杂交的分辩率已达到 1kb靶DNA的灵敏度。而在冰冻和石蜡切片中原位杂交的灵敏度远不如培养细胞，靶DNA仅为40kb，而mRNA为10-20拷贝。如何提高组织切片中杂交信号的敏感度已成为当今原位杂交技术研究的热点，采用寡核苷酸与多种cRNA探针似鸡尾酒混合方式，以同一序列合成不同探针来提高杂交的灵敏度。其次为组织前处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化并检技术和激光共聚焦显微在多重RNA原位杂交中应用等。 (一) 组织前处理的改进 RNA原位杂交中组织固定多推荐 4, 多聚甲醛，固定时间不超过24小时，尤以冰冻切片为佳。1998年Liu[8]比较了同一肾组织和肺组织，用4% 多聚甲醛和10% 中性福尔马林固定，石蜡切片和冰冻切片中RNA原位杂交检测结果。按0.5、4、16和48小时时间段检出杂交信号，经图象分析系统处理并比较阳性率、阳性强度和杂交信号定位等表明:(1)固定36、48小时时间段，石蜡切片组结果好于冰冻切片组; 这些报道(2)中性福尔马林固定与多聚甲醛无明显差异。同样的结果还见于Le[9] 在甲状腺组织肿瘤的研究.为外检病理标本作回顾性RNA原位杂交开辟广阔应用前景。 (二) 杂交信号放大 通过原位PCR方法来扩增靶RNA核苷酸片段来提高原位杂交的敏感性，从理论上讲也是成立的。但从近几年应用结果表明主要存在以下问题: (1)如何避免扩增后核苷酸向细胞外弥散，引起杂交信号的定位错误。 (2)扩增后核苷核又如何得到有效标记，尤其是低敏感度扩增产物的标记。 (3)如何预防凋亡细胞和RNA酶处理后切片中核碎片即非目的核苷酸片段扩增。 (4)如何保持细胞形态和组织结构的完整性。(5)如何克服在应用微波和热处理中使 9号染色体着丝点破坏所造成的假阳性。总之通过原位PCR、微波和热处理方法来提高靶细胞核酸数量或增加敏感性在应用中尚存在着异议[11-12]。TSA是酪胺酰胺信号放大(Tyramide Signal Amplification)的缩写，而CARD则是催化报道基因 * 沉淀(Catalyzed reporter deposition CARD)的缩写(*报道基因:处于另一基因下游并可反映转录上游基因表达水平的基因 )。前者名称侧重酪胺酰胺的放大作用命名[10-11]。1989年Bvbrow首先将TSA应用到斑点杂交和ELISA中来提高检出信号的敏感度。1995年由Kerstens[15] 和1997年Speel[13,18]等又将TSA引用到原位杂交中，因为检测低拷贝的RNA往往得不到有效的杂交信号，而TSA则使原位杂交的灵敏度提高了2-100倍，能在组织切片中检出多拷贝和单拷贝1-5kb的DNA 序列为低丰度的mRNA 和rRNA检测奠定了基础。从而在近两年内使RNA原位杂交技术得到稳步发展并展示广阔的应用前景。 1997年Schmidt[16]首先提出了CARD的命名,1999年 Yang[11]和Speel[13]综述了CARD在原位杂交中的应用。对酪胺酰胺的放大的原理和应用作了详尽描述:(1)低浓度的酪胺酰胺在辣根过氧化物酶活性和H2O2的作用下，通过催化报道基因使酪胺酶分布在原位杂交点或杂交点附近，使大量半抗原分子(生物素、地高辛、二硝基苯(dinitrophenyl)和荧光素介入而达到杂交信号放大。(2)而高浓度的酪胺酰胺在辣根过氧化物酶活性和H2O2的作用下催化报道基因直接发生沉积，使显色的面积增大而达到信号放大。(3)半抗原标记的探针与靶核苷酸杂交?与抗半抗原抗体结 合的辣根过氧化物酶 (HRP)反应?又与荧光素标记的酪胺酶结合?在荧光显微镜直接显示。(4)生物素标记或半抗原标记的酪胺酰胺通过链菌抗生物素、卵白素等?通过间接放大显示[15]。 TSA或CARD是一种容易、快速、高度敏感和有效的提高杂交信号放大系统[10-18]。尤其是不需要改变原有杂交实验流程，在杂交后加入或与荧光素、链菌素抗生物素相连接，以DAB等为底物，避免了 NBT/BCIP 在二甲苯中透明引起信号褪色，因此为技术人员所接受，而高敏感度和良好的定位更为病理学家所接受，而且为常规福尔马林固定的标本中开展以诊断为目的的杂交检测创造了条件，也为杂交信号计算机图象自动化处理应用开拓了应用前景。但应用TSA或CARD时应遵循以下几点:(1)按探针种类和不同组织类型在参考有关文献后作出。a.在探针杂交后应用，参考TSA试剂盒稀释浓度，在37? 或常温下孵育 5-15min，预处理中需抑制内源性过氧化物;b.酪胺酰胺结合荧光素可作直接显示;c.酪胺酰胺结合生物素、地高辛、荧光素、链菌素抗生物素、卵白素作间接显示其放大效果高于直接显示。(2)最佳信/噪比(Signo-to-noise ratio)和获得最大放大效果，在标准化原位杂交流程下进行，应适当调整探针浓度和免疫组化流程。(3)为获得最大限度信号放大，多采用间接显示法。通过链菌素抗生物素、酶和卵白素等增加杂交信号检出。(4)可采用葡聚糖或高分子量聚乙烯醇[24](Polyvinyl alcohol)增加酪胺酰胺定位和加速显色反应。(5)杂交后固定应省略，越来越多研究表明，杂交后固定可导致杂交信号减弱。总之 TSA或 CARD不但能促使原位杂交技术的发展，尤其是在RNA原位杂交中显示无与论比的应用前景。 (三) RNA原位杂交与免疫组化双重检测技术 Fransje[19]报道了在正常表皮,剥落上皮和牛皮癣上皮的组织切片中先后作RNA原位杂交检测其组蛋白表达，同时用 MIB作免疫组化标记检测细胞增值率，以阐述各组表皮的组蛋白表达与细胞动力学的关系。这种检测的设计非常完美，但检测技术较为繁杂。因为一般抗血清中含有较多的 RNA酶，若先进行免疫组化,需加入核酸酶抑制剂，先进行原位杂交，杂交液中不宜含聚蔗糖，否则会增强免疫组化的染色背景。杂交前的预处理和杂交后的洗脱不宜过度，以免抗原变性或丢失。 RNA原位杂交与免疫组化并检，一般先作原位杂交检测，后作免疫组化检测 [19-22]。 (四) 多重RNA原位杂交技术 Grino[23]运用激光共聚焦显微镜,成功地将标以同位素[s35]-UTP,地辛高-UTP和生物素-UTP三种cRNA探针，在下丘脑旁室核单个神经原细胞中检出促肾上腺皮质激素释放因子(Corlicotropin releasing factor)、精氨酸后叶加压素(Arginine vasopressin)和Peptidylycin, α-amidating monooxygenase mRNA。在一张组织切片中进行多种RNA杂交的目的是研究某个细胞与相关细胞内基因表达水平，以及它们之间相互联系，有重要应用价值。切片在10μm以上，在组织前处理，预杂交以后，可将几种杂交探针同时加入进行杂交，然后按各种标记的要求作免疫反应,并以不同方法依次显色，是难度极高的RNA原位杂交。 第五节 地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法 寡核苷酸探针的优点在于它能根据需要人工用 DNA合成仪合成,其长度及分子大小比较一致,可以控制。其长度一般较克隆的 DNA片段短。目前,寡核苷酸探针已能成功的为放射性同位素、荧光素、生物素和地高辛所标记 ,并用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然其敏感度不如来自质粒扩增的 cRNA或DNA探针,但由于探针制备简便再加之于近年在合成中用非放射性标记的成功,寡核苷酸探针在生物学、基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。 在原位杂交中应用寡核苷酸探针 ,其基本操作要点是相同的,如杂交温度在Tm -25?,杂交孵育时间以过夜(16 h左右)为佳。应用寡核苷酸探针在原位杂交技术中的成功与否主要决定于探针的设计,使有效配对率增加而错配(mismatch)减少。 1 (1)冷冻切片:厚10~20 μm,贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80?,在应用于杂交实验前 ,使迅速回升到室温,干燥,固定于4%多聚甲醛PBS溶液中,pH74。PBS漂洗5 min×3,孵育在2×SSC 10 min。 (2)石蜡包埋切片:浸入二甲苯10 min脱去石蜡,以100%乙醇10 min×2,从高到低梯度乙醇(95%,80%,70%)1 min/每个浓度。PBS 5 min×3孵育在2×SSC 10 min。 (3)离心细胞涂片:将细胞先以4%多聚甲醛固定,应用离心沉淀法,将沉淀物涂于有粘附剂的载片上,应用PBS(含5 mmol/L MgCl2)5 min×3漂洗。在01 mol/L三乙醇胺含025%(V/V)乙酸酐 10 min。在02 mol/L TrisHCl含01 mol/L甘氨酸pH74 10 min。孵育在2×SSC 10 min。 2 探针准备 3 预杂交和杂交 室温孵育1 h。如加鲱鱼精子DNA,用前须在沸水浴中加热变性 10 (1)加约30 μl预杂交液在每张载片上, min,酵母tRNA不用加热。 (2)预杂交后以2×SSC漂洗,以吸水纸试干切片周围水份,应用预杂交液稀释地高辛标记的 Oligo,浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素 (proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo,其理想工作浓度为342 ng/ml(0.342 ng/μl)。 (3)加30 μl杂交液在切片上,加硅化盖玻片,在37?过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为 42?。 (4)次日室温2×SSC液漂洗切片1 h。 (5)1×SSC漂洗切片1 h(室温)。 (6)0.5×SSC 37?漂洗半小时。 (7)0.5×SSC室温漂洗半小时。 (8)显示等方法同前述。 第六节 原位杂交结合免疫细胞化学双标记法 原位分子杂交检测 DNA或RNA,能进行基因定位,检测基因扩增,或在转录水平上研究基因表达。免疫细胞化学是检测细胞和组织内的蛋白抗原成分 ,是在翻译水平上研究基因表达。把这二者结合起来 ,就形成了一个新的分子检测系统,即能够在细胞和组织检测特定的基因或其mRNA,也可以检测该基因表达的肽或蛋白质,进一步了解基因的转录,翻译调节以及一种基因的转录与另一种基因编码的蛋白质合成之间的相互关系。当然,把二者与形态学特征,如细胞类型相结合,对于深入研究基因扩增,表达的调控与疾病发生的机理有更重要更广泛的应用前景。(ISH)与免疫组织化学(IHC)结合法是先后用ISH和IHC在同一切片进行，也可分别在相邻的二切片上进行ISH和IHC染色。相邻切片可使ISH和IHC染色都获得理想的结果,易成功,但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差,但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色,使第二次染色不十分理想。由于mRNA易被RNase降解,因而在实践中往往首先进行原位组化染色,这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失,如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。 一、杂交、免疫组织化学方法 1 将切片漂洗于能经受高压灭菌的器皿中。01 mol/L PBS pH72洗3×5 min。 2 0.1 mol/L甘氨酸PBS冲洗5 min。 3 0.4% Triton X100 PBS 15 min。 4 1 μg/ml蛋白酶K(01 mol/L TrisHCl pH80,50 mmol/L EDTA配),37?保温15~30 min。 5 4%多聚甲醛 PBS溶液再固定5 min。 6 PBS冲洗2×3 min。 7 0.25%乙酸酐(01 mol/L三乙醇胺配)10 min。 8 2×SSC冲洗10 min。 9 将切片用灭菌吸水纸吸干,然后加入杂交液。核酸探针浓度为025~05 μg/ml。每个切片15~20 μl杂交液。43?保温12~16 h。 10 4×SSC 37?冲洗30 min。 11 2×SSC(含RNaseA 20 μg/ml)37?保温30 min。 12 1×SSC和0.5×SSC,37?分别冲洗30 min。 13 0.05 mol/L PBS冲洗3×5 min。 14 0.5% H 2 O 2 PBS室温20 min。 15 0.05 mol/L PBS冲洗2×5 min。 16 碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体(Fab)与抗蛋白或多肽等抗体混合液,前者一般1?1 000稀释 ,后者则因抗体而异。稀释液:1% BSA,0.4% Triton X100,0.05 mol/L PBS pH72,4.?孵育24 h。 17 0.05 mol/L PBS冲洗4×5 min。 18 生物素化二抗(1?100~1?200)37?保温1 h。 19 0.05 mol/L PBS冲洗3×5 min。 20 ABC(1?200~1?400)37?保温1 h。 21 0.05 mol/L PBS冲洗3×5 min。 22DAB显色液(005 DAB+0.03% H 2 O 2 ,0.05 mol/L PBS pH7.2配)显色5~10 min。23 0.05 mol/L PBS冲洗3×5 min。 24TSM1冲洗2×5 min(TSM1:0.1 mol/L TrisHCl pH8.0,0.1 mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl 2 )。 25 硝基四氮唑蓝(400 μg/ml)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(200 μg/ml)混合液(用TSM2配显色混合液)显色1~3 h,避光。 26 20 mmol/L EDTA终止显色。 27 将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上,空气干燥。 28 梯度酒精脱水,透明、封片。 结果 :ISH阳性细胞的胞质呈紫蓝色,胞核不着色,示该细胞含XmRNA。ICC阳性细胞的胞质呈棕色 ,胞核不着色示该细胞含X多肽。双标记细胞的胞质为蓝棕混合色,示多肽与mRNA共存于该细胞内。作原位杂交与 IGSS双标记,杂交阳性呈红色,表达蛋白抗原呈黑色 二、免疫细胞化学 -杂交结合方法 1 组织切片或细胞标本,先作免疫细胞化学染色。 2 染色后的标本,经80%、95%、100%酒精脱水,干燥。 3 再用原位分子杂交方法进行杂交前、杂交和杂交后处理。 4 杂交信号的显示要与免疫染色的呈色形成鲜明对比,如红与兰,或棕与兰,或黑与红色等。 结果 : 1 在同一细胞内DNA或mRNA呈红色,抗原呈兰色。二者分别定位不同。 2 在同一细胞内DNA或mRNA与抗原定位相同,二种颜色相重。 3 在相邻连续切片或同种细胞标本上分别单独做原位杂交和免疫细胞化学,并将其结果与双标记标本的结果比较 ,以确定双标记结果的准确性。 三、对照 应按照原位杂交和免疫细胞的技术要求分别设立对照试验。由于二者都可能出现假阳性 ,证明阳性结果的特异性十分重要。 第七节 双重原位杂交方法 双重原位杂交是在同一标本或同一细胞内同时检测两种或两种以上的靶核酸序列的技术。一般用相邻的连续切片 (3 μ),用两种不同的探针进行原位杂交,杂交结果呈现两种不同的颜色,比较相邻切片的杂交 以证实两种靶核酸是否存在于同一细胞中,这种方法适用于较大细胞的研究。此法杂交过信号的定位分布, 程和结果 ,二者互不干扰,显示方法和呈色可以用同一检测系统 ,敏感性相同,可比性强。缺点是杂交信号可 比能因切片较薄而减弱,找寻同一细胞的切面进行分析有一定困难。用两种探针在同一标本上作原位杂交 ,用上述方法更简便,两种不同标记探针的杂交阳性信号呈色不同 ,在同一标本上很容易找到。 一、放射性探针与生物素探针结合双重杂交方法 (一)一步法 可以用生物素和 35S分别标记的探针同时加在同一细胞标本上,进行杂交,检测两种mRNA(Oden等,1990)。这种一步法的优点是杂交反应一次完成,操作流程短,同一细胞内的两种信号容易分辨。缺点是放射自显影的阳性信号明显减少。二步法可以克服这一缺点。 (二)二步法 组织标本先用 35 S标记探针做原位杂交,自显影杂交信号切片用蒸馏水轻轻漂洗,浸入杂交前缓冲液 ,经酒精脱水,干燥后,再用生物素标记探针进行第二次杂交,碱性磷酸酶呈色。两种杂交信号明显可辨。其他标记物如地高辛等也可与 35S探针相结合进行双重原位杂交。 二、非放射性探针的双重原位杂交方法 (一)双重荧光探针原位杂交方法 1 直接法 用不同颜色的荧光素标记的两种探针 ,直接与靶核酸在标本原位杂交,杂交信号能在荧光显微镜 ,流式 细胞仪和激光共聚焦显微镜下进行检测。优点是简便,缺点是敏感性低。荧光双或多重杂交法多用于染色体 ,培养细胞和冰冻切片。常规石蜡切片的自发荧光强,一般不适于直接荧光原位杂交。 2 间接法 用地高辛和生物素分别标记的不同探针、杂交后 ,用不同荧光素标记的地高辛抗体和抗生物素抗体或卵白素检测杂交体。已有 FITC(绿色)TRITC(红色)和AMCA(aminomethylcoumarin acetic acid)兰色荧光 (二)生物素和地高辛标记探针的双重原位杂交方法Herrington等(1989)报告用生物素和地高辛标记探针双重原位杂交方法,适用于常规石蜡切片 ,同时检测人Y染色体和人乳头瘤病毒(HPV)的核酸序列。杂交液中同时含有两种标记的探针 ,杂交后切片先用辣根过氧化物酶标记的卵白素和碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体混合液(1μl标记抗体和6 μl标记卵白素加入600 μl TBS中)孵育30 min,室温。用TBS洗后先用AEC显色呈红色。用蒸馏水洗后,再用pH95 005 mol/L TrisHCl缓冲液洗。再用NBT-BCIP显示碱性磷酸,反应呈兰色。 第八节 原位杂交的 PCR增敏法 Bagasra及其同事在1990~1993年成功的报告了原位杂交和聚合酶链反应结合法,简称为原位杂交 PCR(PCR in situ hibridisation,PCRISH)。PCRISH技术的基本原理是首先利用PCR技术将靶核酸片段扩增,然后做原位杂交,即用标记的核酸探针与扩增了的DNA进行杂交，显示和定位,其敏感性可达到显示单个拷贝基因信号的程度。 方法步骤 1 将离心沉淀的细胞滴入覆有聚四氟乙烯(teflon coated)三个凹孔的特制玻片凹孔内 ,加热105? 90s。 2 以2%多聚甲醛冲液,pH74,固定1 h。 3 PBS漂洗3 min×3。 4 如用生物素标记核酸探针,应用03%的H2O2孵育37?过夜。 5 蛋白酶K溶液(5 μg/ml PBS)55?孵育2 h(孵育时间应根据细胞的种类而定)。 6 将孵育的载片置于96?热板上2 min,最终以蒸馏水漂洗,空气干燥。 7 在溶液中按PCR技术的需要加入对应的引物(Primer),15 μl PCR混合液含10 μmol/L MgCl 2 和10 μl Taq多聚酶(1u/μl,Gene Amp Cetuo)。把上述溶液加入左侧二孔中,留一孔加入无引物的 PCR混合液作为对照。 8 将载片以22×66 mm盖片覆盖,片周以无色指甲油封闭,放入自动的PCR热循环仪。可用锡箔纸覆盖于热循环仪表面再放置载片。按 94?/45?/72?每个温度 1 min,30个循环。这温度也可根据引物的GC比例加以调整以求得理想的扩增。也可根据下列公式计算引物的 Tm值(Muller & Wold,1989) Tm,815+166(log M)+041(%GC)-500/nn,引物的长度,mol/L,缓冲液中盐的摩尔数,一般是0047 mol/L 9 扩增后,将切片放入100%乙醇3~5 min,以锐利刀片移除盖片,将载片放在90%热板上 30 s。 10 应用2×SSC漂洗。 11 用生物素标记核酸探针进行杂交。载片在95?热板上5 min,然后移入湿盒,48?孵育4h或过夜。 12 次日PBS漂洗。 13 以抗生物素标记FITC抗血清(100 μg/ml)PBS pH72，37?孵育1 h。 14 PBS冲洗。 15 以甘油/PBS溶液封片,荧光显微镜观察。如生物素标记核酸探针的显示系统为过氧化物酶 ,则应用DAB/H2O2溶液显色,常规光镜观察。 第九节 原位杂交的CSA增敏法 Bobrow等(1989)首次报道了催化信号放大法(catalyzed signal amplification,CSA)。Adams等(1992)将CSA法用于提高免疫组织化学的敏感性。Kerstens等(1995)成功的将CSA法用原位杂交的增敏(详细方法参考第三十一章)。适用于光镜或荧光显微镜的原位杂交的弱信号的放大。 第十节 原位核酸分子杂交的试剂 原位杂交工作涉及三个方面的试剂 :特异性的探针;探针的标记;敏感而又可靠的检测方法。 一、特异性的探针试剂 特异性的探针必须是一段已知的基因片段。相对于膜上杂交而言 ,原位杂交有其特殊性。即细胞和组织中的待检测基因隐藏于类似于网络状的立体结构之中 ,给探针的进入带来明显的影响。探针的可接触性 (accesibility)对原位杂交尤为重要。理想的探针应满足下列要求。 (1)适当的探针长度。 (2) 能对探针进行高效率的标记。 (3) 能长期保持稳定。 核酸探针有多种多样 ,基本上可分为DNA,RNA和人工合成寡核苷酸三大类。 1 DNA和RNA探针 其原理是克隆一段特异的 DNA或RNA片段,装载到相应的质粒中。经过质粒扩增,酶解和纯化等步骤,就可以得到大量的DNA和RNA片段。问题在于这一过程对大多数实验者来说过于复杂了。最好的解决办法是直接购买纯化好的探针,其次是获得已装载好特异性DNA或cDNA片段的质粒。有商品化的DNA探针供应,这些探针已经严格纯化和定量。国际上如美国CHEMICON， CALBIOCHEM， CLONTECH， BIOGENEX等著名生物技术公司都有商品化的探针供应。国内有些生物工程技术公司,如博士德公司也有大量商品化的探针销售。一些国内大的研究机构,如中国医学科学院,北京肿瘤研究所,北京医科大学病理系和军事医学科院也有商品化的探针。在缺乏商品化探针的情况下,也可以从国内外一些实验室获取一些装载DNA的质粒,自己进行扩增,酶切和纯化。其技术并不复杂,其所需试剂很多公司有供应,如PROMEGA， CLOTECH， SIGMA， BOEHRIGER MANNHEIM。 2 寡核苷酸探针 在待查基因序列已知的情况下 ,简单而又经济的途径是合成寡核苷酸探针。寡核苷酸探针的长度一般 在 10 bp~100 bp,探针越短,渗透性越好,但结合不太稳固。探针太长则合成成本上升 ,也没有必要。最好是长度20~30 bp的寡核苷酸探针。合成探针的时候可以掺入半抗原如地高辛 ,生物素和FITC等。寡核苷酸探针也可用3′尾段标记法予以标记。国内国外合成寡核苷酸探针的公司甚多,用户需自己提供探针序列。 二、探针标记 各种不同类型的探针须经过恰当的标记 ,才能在原位杂交中应用。DNA探针一般采用的标记方法为随机引物标记和缺口平移法。寡核苷酸探针则主要采用 3′ 和半抗原标记两种 (包括生物素)。放射性核素标记的优点是敏感性特别高,特异性也比较好。缺点是要有放射性核素有关的处理经验,存在着对人体的潜在危害性。国际上许多著名的公司都有放射性核素标记盒供应,如PROMEGA， SIGMA， CLONECH等。 ,FITC和生物素。其最大的优点是没有放射性核素的潜在危害性 ,同时也有相当高的敏感性和特异性。地高辛标记试剂盒由BOEHRINGER MANNHEIN公司独家经营。方法为随机引物标记和缺口平移法。随机引物标记法的优点是 具有较高的敏感性。缺口平移法所标记探针较短 ,对组织和细胞有很好的渗透性,特别适合于标记效率高 , 原位杂交。生物素和 FITC标记探针试剂则有多家公司供应。所用方法同样为随机引物标记和缺口平移法。值得注意的是 ,生物素所标记探针会因为内源性生物素的干扰而形成背景染色,应该用内源性生物素封闭系统进行处理。 三、原位杂交信号的检测试剂 放射性核素探针的原位杂交需要相应的显影乳胶。至于半抗原探针的原位杂交则需要半抗原对应的抗体 ,单抗和多抗均可。原位杂交探针反应后,其余的步骤与免疫组化相似。半抗原对应的抗体 ,如地高辛抗体和FITC的抗体,即充当一抗使用,也可以标记酶和胶体金后直接使用。一般用过氧化物酶和碱性磷酸酶作标记物。尤其是碱性磷酸酶敏感性较高 ,使用最多。BOEHRINGER MANNHEIM,SIGMA,CHEMICON,CALBIOCHEM等许多公司都有这两种抗体及其酶标记复合物。 BOEHRINGER MANNHEIM最常采用的检测系统是碱性磷酸酶标记的亲和纯化抗地高辛抗体,膜上杂交效价可达 1?5000以上,原位杂交效价可达1?500以上,配合BCIP/NBT显色,敏感性和特异性都很好。SIGMA 碱性磷酸酶标记后,膜上杂交效价可达1?10000,原位杂交效价可达1?1000以上。有单克隆抗地高辛抗体, 过氧化物酶由于敏感性较低,酶标地高辛抗体一般不常采用。往往将地高辛抗体充当一抗,后接生物素化二 过氧化物酶复合物(LSAB,S-P和SABC等),这样可大大地提高敏感性。如果探针由生物抗和链酶亲和素— 素标记,可以直接配合链酶亲和素—过氧化物酶复合物(LSAB,SP和SABC等)使用,最好是用敏感性较高的第二代产品。 四、成套原位杂交检测试剂盒 总的来说 ,原位杂交是一个很复杂的操作过程,条件不好掌握。尤其是对初作此项工作的人来说。针对这一点 ,国际国内一些公司设计了一系列的成套原位杂交检测试剂盒,试剂盒中包括蛋白酶 K,含标记探针的杂交液,封闭液及检测系统等主要试剂。由于每种试剂都经过最优化检测后配制 ,所以成功率很高,操作也较简便。如BIOGENEX,DAKO,CALBIOCHEM等公司有一系列的成套原位杂交检测试剂盒。博士德公司有几十种原位杂交成套试剂盒 ,主要包括病毒系列(EBV、CMV、HBV、HCV、HPV),癌基因系列(bcl2、Cyclin D1、C)erbB2、cFos、MDM2、MYC、nm23、P16、P21、P53、Rb),细胞因子系列产品(EGF、bFGF、TGF和其它(iDNOS、cNOS、ER、ET)。 五、如何选择原位杂交试剂 首先是探针的选择。在有纯化 cDNA探针供应的情况下,优先选择裸探针自己进行标记;若已知探针的序列 ,则可以自己设计探针的序列和长度,合成时即掺入半抗原或放射性核素。cDNA探针和寡核苷酸探针各有优缺点 ,如两种探针的结果相互对照则更有意义。检测系统一般选择碱性磷酸酶标记的抗体 ,配合BCIP/NBT显色。在不太熟悉原位杂交技术的情况下,优先选择原位杂交成套试剂盒 ,不仅操作简便,结果也更为可靠。