美国柏尔莱克多巴胺M1008-03B说明书(中文翻译)

美国柏尔莱克多巴胺M1008-03B说明书(中文翻译) 美国柏尔生物科技有限公司 (BIOO Scientific Corp.) 产品说明 莱克多巴胺酶联免疫反应测试盒使用说明书(M1008-03B) 一( 简介 1(试剂盒描述 TMMaxSignal莱克多巴胺酶联免疫反应测试盒适用于肌肉、动物组织、牛奶、饲料、尿液、血清、血浆中莱克多巴胺残留的定量，性能稳定、操作简单、灵敏度高。莱克多巴胺在中国和欧盟作为家畜的生产增长剂是非法的，为防止莱克多巴胺进入食物链，养殖者和政府监督管理部门需要准确、快速和灵敏的的检测技术。本试剂盒对反应中不同样品的检测限是0.02 ppb。该试剂盒有以下特点: ? 快速。10-60分钟之内可完成从肌肉，组织，饲料，尿液，牛奶中提取莱克多巴胺的全过程且回收率达到75-95%。 ? 快速的ELISA检测(在不考虑样品数量下只需不到2小时)。 ? 高重复性。 2(试剂盒原理 TMMaxSignal克伦特罗酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联免疫反应原理，含有莱克多巴胺的抗原已经包被于微孔板上。测试分析时，样品和特异性HRP标记结合物共同添加到板上孵育。如果样品中含有莱克多巴胺抗原，就会竞争抗体，从而阻止抗体与板上抗原结合。加入TMB底物后将催化底物显色，根据颜色反应的灵敏度来确定样品中莱克多巴胺的浓度。颜色的深浅同样品中药物的浓度成反比关系。 3(试剂盒组成部分、储存及检测下限 (1)试剂盒包括: 内容物 规格 保存条件 已包被抗原的酶标板 1×96孔板(12×8孔) 2-8? 莱克多巴胺液: 阴性控制(白) 0.8 mL 0.04 ng/mL (黄) 0.8 mL 0.1 ng/mL (橙) 0.8 mL 2-8? 0.25 ng/mL (粉红) 0.8 mL 0.6 ng/mL (紫) 0.8 mL 1.5 ng/mL (蓝) 0.8 mL 100 ng/mL(示踪物，可选，红) 0.8 mL 莱克多巴胺一抗 12 mL 2-8?* 100×HRP酶标二抗 250 µL 2-8?* 二抗稀释液 20 mL 2-8? 200×样品提取液(A) 25 mL 2-8? 10×样品提取液(B) 25 mL 2-8? 20×浓缩工作洗液 28 mL 2-8? 终止液 20 mL 2-8? TMB底物 12 mL 2-8? 样品平衡液 0.5 mL 2-8? (2)试剂盒的保存 1 本试剂盒应当在2-8?的温度下储存，有效期为一年。如果三个月内不使用试剂盒，一抗和100×HRP酶标 二抗应置于-20?或者冷冻保藏。 (3)样品检测下限 检测物质 检测下限(ng/g) 0.64(快速提取法?) 饲料 0.8(快速提取法?) 0.02(有机溶剂提取法?) 肌肉/肝脏/肾脏 0.05(有机溶剂提取法?) 0.12(快速提取法) 牛奶 0.4 尿液 0.4 (4)交叉反应数据 药物 灵敏度 (ng/g或ppb) 交叉反应 % 莱克多巴胺(Ractopamine) 0.04 100 莱克多巴胺葡糖苷酸A(Ractopamine Glucuronide A) 0.1 45 莱克多巴胺葡糖苷酸B(Ractopamine Glucuronide B) 0.15 41 莱克多巴胺葡糖苷酸C(Ractopamine Glucuronide C) 0.05 97 克伦特罗(Clenbuterol) >10，000 <0.01 叔丁肾上腺素(Colterol) >10，000 <0.01 马布特罗(Mabuterol) >10，000 <0.01 利托君(Ritodrine) 50 1.0 苯氧丙酚胺(Isoxsuprine) 500 <0.01 沙美特罗(Salmeterol) 500 <0.01 酚间羟异丙肾上腺素(Fenoterol) >10，000 <0.01 比托特罗(Bitolterol) >10，000 <0.01 脲喘宁(Carbuterol) >10，000 <0.01 吡布特罗(Pirbuterol) >10，000 <0.01 特布他林(Terbuterol) >10，000 <0.01 噻吗洛尔(Timolol) >10，000 <0.01 间羟异丙肾上腺素(Metaproterenol) >10，000 <0.01 异丙(去甲)肾上腺素(Isoproterenol) >10，000 <0.01 沙丁胺醇(Albuterol) >10，000 <0.01 4(其他需要而本试剂盒未提的设备或 , 酶标仪(450nm) , 恒温培养箱 , 匀质器 , 旋转蒸发仪或者氮吹仪、 , 漩涡振荡器 , 移液枪 (10、20、100和1000 µL各一支) , 多道移液枪(50-300µL) , 甲醇 , 乙腈 , 乙酸乙酯 2 , 正己烷 二.警告 实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。 ? 标准品中含有克伦特罗，请小心使用。 ? 不要使用过期的试剂盒。 ? 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。 ? 尽量保持室温20-25?，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直 射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。 ? 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。 ? 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。 ? 孵育时间的计算越越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。 ? 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。 ? 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。 TM三. MaxSignal Ractopamine ELISA Test Kit检测方法 1(试剂的准备 所有的试剂在使用之前应将其回温至室温，并在使用试剂前摇动几下，以保证合理的浓度。 (1)二抗工作液 按1:99的比例来配制二抗浓缩液和二抗稀释液，配成二抗的工作液。 (2)1×样品提取液A 按1:199的比例配制样品200×提取浓缩液和双蒸馏水。 (3)1×样品提取液B 按1: 9的比例配制样品10×提取浓缩液和双蒸馏水。 (4)1×工作洗液 按1:19的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。 (5)甲醇:1×样品提取液;(4:1;V/V) (饲料快速提取法) 按1:4的比例配制1×样品提取液B和甲醇。举例:取2ml的1×样品提取液B加入到8ml甲醇中，配制成10ml的甲醇:1×样品提取液B;(4:1;V/V)，按需要，可同比例放大或缩小。 2(样品的准备 2.1 饲料 2.1.1快速提取法?(该方法不适合于复合饲料) (1)取1份饲料样品，加入2份溶液 [甲醇:1×样品提取液B;4:1;V/V](如1g 样品+2 mL溶液)，使用适当匀浆器匀浆样品; (2)称取1.5 g匀浆样品，室温(20-25?) 离心力4000g离心5分钟; (3)移取0.1mL上清液到另一试管，加入0.7 mL 1×样品提取液B，充分混匀; (4)取50μL样品进行检测。 稀释倍数:16.0 2.1.2快速提取法?(该法均可用于普通饲料和复合饲料) (1)样品使用适当的匀浆器进行匀质; *(2)称取2克匀质的样品，并加入20mL 0.1M 盐酸。最大转速漩涡振荡15分钟; *(3)室温(22.5?2.5)?下离心力2000g离心10分钟，移取1 mL上清液到另一新试管，加入20μL 5M 氢氧化钠，调节pH为6-8; *(4)室温(22.5?2.5)?下离心力2000g离心10分钟，移取0.5mL 上清液到另一新试管，加入0.5mL 1×样品提取液B，充分混匀; 3 *(5)取50μL样品用于检测。 稀释倍数:20 2.2 肌肉/肝脏/肾脏 2.2.1快速提取法(鲜肉检测) (1)除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪，使用适当的匀浆器进行匀浆; (2)称取0.5克匀质的样品，并加入1mL 1×样品提取液A。最大转速漩涡振荡3分钟或摇床20分钟; (3)室温离心力4000g离心5分钟，移取0.5mL上清液到另一试管(避免接触脂肪层); (4)75?孵育5分钟，最大速度漩涡振荡1分钟; (5)室温离心力4000g离心5分钟; (6)移取0.2mL上清液到另一试管，加入5μL样品平衡液，充分混匀; (7)取50μL样品进行检测。 稀释倍数:3.0(为避免高背景值，已知阴性样品应作平衡，从测试结果中抽掉阴性样品结果) 2.2.2 有机溶剂提取法?(咸肉、腌肉、鲜肉检测) (1)除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪，使用适当的匀浆器进行匀质; (2)称取3克匀质样品，并加入8mL乙腈和1mL乙酸乙酯。最大转速漩涡振荡3分钟; (3)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心5分钟，移取6 mL上清液到另一新试管; (4)在60-70 ?减压蒸馏或60-70?水浴氮气吹干; (5)加入1mL正己烷溶解样品，并加入1mL 1×样品提取液B，最大转速涡旋振荡1分钟; (6)打开管盖，将样品置于85?水浴3分钟(如果下层液量足够用以检测，此步骤可以忽略); (7)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心5分钟，取50μL下层液用于检测。 稀释倍数:0.5 2.2.3 有机溶剂提取法?(适合高脂肪产品) (1)除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪，使用适当的匀浆器进行匀质; (2)称取2.5g 匀质样品，并加入10mL 甲醇，最大转速漩涡振荡10分钟或在多管道漩涡器(振荡器)摇荡10分钟; (3)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心10分钟，移取4 mL上清液到另一新试管; (4)在50-60?减压蒸馏或50-60?水浴氮气吹干; (5)加入4mL正己烷溶解样品，振荡2分钟，再加入1mL 1×样品提取液B，最大转速涡旋振荡2分钟; (6)室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心10分钟;(如果已生成乳状液，先将样品置于80-95?水浴3分钟，然后以室温(22.5?2.5)?下离心力4000g离心10分钟); (7)取50μL下层液用于检测。 稀释倍数:1.25 2.3 牛奶 (1)无脂牛奶用1×样品提取液B稀释10倍(如20µL牛奶+ 180µL提取液)，直接取50μL用于检测。 (2)含脂牛奶在使用前需要以4000g离心5分钟，除去上面脂肪层。取清液用1×样品提取液B稀释10倍(如20µL牛奶+180µL提取液)，直接取50μL用于检测。 稀释倍数:10.0 2.4 尿样 (1)取0.5mL尿室温下离心力4000g离心5分钟; (2)取50μL上清液用于检测。 稀释倍数:10.0(为避免高背景值，建议使用1×样品提取液B对尿样进行10倍稀释(1:9)，调节pH在中性范围) 3(酶联免疫反应测试步骤 4 以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。 试剂 每个反应需要的体积 24次反应的体积 一抗 100μL 2.4 mL HRP酶标二抗 150μL 3.6 mL 工作洗液 2 mL 48 mL 终止液 100μL 2.4 mL (1)加入50µL的标准液或样品于所设定的孔中，样品需作平衡检测; (2)在每孔中加入100µL一抗，轻敲微孔板边缘混匀1分钟; (3)室温下避光孵育30分钟; (4)洗板3次，每次加入250µL 1×工作洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干; (5)在每孔中加入150µl 1×HRP酶标二抗，轻敲微孔板边缘混匀1分钟，室温下避光孵育30分钟; (6)洗板3次，每次加入250µL，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干; (7)加入100µl的TMB底物(底物本身是透明的，出现颜色改变不能使用。孵育时适当覆盖微孔板)，轻敲微孔板边缘混匀1分钟; (8)室温下避光孵育15分钟后，加入100µl的终止液终止反应，尽快在450nm下读OD值(读书前使用无绒布擦拭底部水分和指模)。 4(结果计算 (1) 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。 相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ×100 (2) 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。 (3) 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。 (4) 样品检测下限和定量下限计算方法如下: 样品检测下限 = (0.04ng/g) ×(稀释倍数) 样品定量下限 = (0.1ng/g) ×(稀释倍数) 备注:如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法(如色谱/质谱方法等)进行确证。 以下曲线图是莱克多巴胺酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线 Ractopamine Standard Curve 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10Relative Absorbance(%)0 0.1110100 Standard ng/mL(log10) 四. 问题与解决 1.标准品无颜色变化或者无相应数值 可能原因 解决方法 5 试剂使用顺序混乱，或者操作步骤出错。 遵循实验说明重复实验。 使用了错误的抗体，或者二抗配制错误、失效。 确保抗体来自同一试剂盒，所有抗体不同批次之间 有一定的差异，确保二抗的配制无误。 TMB底物失效。 使用新的BIOO TMB底物。 2.低吸光度(OD值) 可能原因 解决方法 试剂过期，或者不同的批次混用。 查证过期试剂和批次。 洗液配制错误。 使用试剂盒提供的洗液，正确配制。 过多次洗涤。 按照说明书要求进行洗涤。 孵育时间过短。 按照说明书要求，严格计算好时间。 实验室温度过低。 保持实验室温度在20-25?，不要在空调风口或者 寒冷的窗户旁进行实验。 试剂或者微孔板温度过低。 确保试剂或者微孔板完全回温，在实验开始前，将 试剂放置盒子外最少1小时。 使用错误波长读数，或者酶标仪失灵。 确保450nm波长读数，检查酶标仪。 试剂盒处于极端的条件。 检查试剂盒从冰箱拿出使用的次数，检查试剂盒是 否放置极端温度(过冷或者过热)时间太长。 3.过高的背景值或吸光度(OD值) 可能原因 解决方法 使用了质量差的水。 如果使用的水可疑，尝试使用蒸馏水配制洗液。 底物失效。 确保加入微孔板前，底物是无色的。 洗涤不当或者洗板机洗板效果不好。 采用说明书建议的洗涤次数，每次每孔至少加入 250μL洗液。检查洗涤系统，排除故障。 酶标仪失灵。如果OD值读数很高而颜色很浅，那个使用校正微孔板检查酶标仪，检查光源。 这是非常可能的情况。 实验室温度过高。 保持实验室温度20-25?，避免在热源或者阳光直 射处实验。 试剂混淆，被污染或者配制不当。 确保使用正确的试剂，准确配制，避免污染。 4.板内差异性大 可能原因 解决方法 加入标准品，试剂和样品的时间不一致。 确保所有试剂可用，尽可能使用多道枪加样，加标 准品，试剂和样品途中，不能中断。 多道枪使用不当。 校准多道枪，检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致。 洗涤系统出现故障。 检查洗涤系统，保持良好运行。 5.板间差异性大 可能原因 解决方法 板与板之间孵育时间相差太大。 独立计时，确保一致的孵育时间。 板与板之间不一致的洗涤过程。 确保相同的洗涤次数，保证洗涤系统正常运作。 使用移液枪不当。 检查移液枪，确保吸取相同液量。 微孔板，试剂，标准品和样品处于不同温度。 确保微孔板，试剂，标准品和样品充分回到室温， 如果试剂体积较大则需要回温较长时间。不能用温 水浴回温样品。 不同批次的试剂混用，或者试剂盒过期。 注意试剂不要混用，不同的试剂盒可能显示不同的 6 OD值，但是相对吸光值是有很好的对比性的。通常 0标准品的OD值小于0.6显示试剂质量下降。 6.一个或者多个标准品数据点超出曲线范围 可能原因 解决方法 标准品添加顺序混乱，或者放置于错误位置。 按照说明要求重复实验，保证标准品添加正确。 标准品被污染或者与其他标准品混淆了。 改用新的标准品，按照由低浓度到高浓度的顺序添 加标准品。 洗涤不一致或者洗涤系统失灵。 遵循一如既往的洗涤方式，检查洗涤系统。 加入标准品和试剂的时间不一致。 确保一切就绪，由低浓度到高浓度添加标准品并保 证不被打扰，使用多道枪移液。 多道枪使用不当。 校准多道枪，检查吸嘴是否套紧，确保吸液量一致。 附:中英文对照 Negative control 阴性质控(0标准品) Ractopmine Antibody #1 莱克多巴胺一抗 HRP-Conjugated Antibody #2 HRP-酶标二抗 Antibody #2 Diluent 二抗稀释液 Sample Extraction Buffer 样品提取液 Wash Solution 工作洗液 Stop Buffer 终止液 TMB Substrate TMB底物 7