重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？…

重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵？… 重组质粒βhCG—pPIC9K的构建及嗜甲醇 酵,… 第2l卷第5期 2000年lO月 暨南大学(自然科学版1 JournalofJinanUniversity(NatttralScience) Vo1.2lNo.5 0ct.2000 一 重组质粒phCG—pPIC9K的构建及 嗜甲醇酵母(Pichiapastoris)的转化 陈晓丽,?潘善培 ,芦春斌,谢琪璇,肖銮娟 (暨南大学生殖免疫研究中心,广东广州510632) 【摘要]目的:为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒 h0G—ta'ICgK,转化嗜甲醇酵母.方法:根据胁cG的eDNA序列设计两条弓『物,使上游带EcoRI酶 切位点,下游带NotI酶切位点,以质粒口lcG—PBSKS为,进行Pc丑扩增反应;将所得的DNA 片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPICgK质粒进行连接,然后导人大肠杆菌DH5n,用 PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子雎IoG—pPICgK再用电打孔法转化酵母(P/cb~). 用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G418的YPD培养基中筛选多拷贝插人菌株.结果:用所设 计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的B}DNA片段,插入pHCgK 并导人DI-I5n 获得阳性克隆,经PER反应和双酶切鉴定表明重组质粒是一pPIC9K,并转化嗜甲醇酵母获得 耐受4mg,珈I.G418的菌株结论:构建了重组质粒雎—pPIC9K并获得插入重组质粒雎IoG一. … pPICgK帆 ,… 债,压穆譬【关键词];~CR扩增反应;质粒pPIC9K—,/I [中圈分类号]Q7跎[文献标识码】A[文章编号]l0?一996s(zoool~一0l16—06 一暂城件免疫避孕是近3o年来随着一门新型的边缘学科——生免疫学的形成而发展起来的一 个新型的课题免疫避孕的原理是选择生殖过程重要的生殖活性物质作为抗原制备疫苗,在 被接种者体内诱发抗生殖活性成分的抗体,阻断生殖过程的某些重要环节.从而达到避孕目 目前研究有可能用于发展的.发展安全有效避孕疫苗的关键是选择合适的靶抗原, 成为避孕 疫苗的靶抗原主要有精子抗原,卵透明带抗原和激素抗原,其中人类绒毛膜促性腺激素(Hu— mallchorionicgonadotropin,hCG)是研究得较深入的激素抗原.hCG是由人类台体滋养层细胞分 泌的一种糖蛋白激素,它能刺激黄体持续合成孕酮,对维持妊娠具有重要的作用.此外,一些 研究发现hCG具有免疫抑制作用,可防止母体排斥孕体.发展hCG避孕疫苗是试图通过免疫 接种,在体外诱发抗hCG抗体,中和hCG的生物活性,产生避孕效果.hCG由a,S两个亚基组 成,亚基与体内一些垂体激素(如Ii-I,FSH)的a亚基相同,为避免抗体与其他垂体激 素的交 叉反应,确保疫苗的安全性,世界各研究中心在研制hCG避孕疫苗时,主要,~hCC或其C末 端多肽片段作为抗原成分_lj.这些传统的避孕疫苗已完成免疫安全性,毒理学评价,并进行 了疫苗的第1,?期临床试验.大量的动物实验和I,?期临床试验证明这些疫苗无任何毒副 反应,具有抗生育作用,但是还需要进一步提高免疫原性,克服个体差异.我们研究组早期采 用cG偶联载体蛋白TI"为抗原,研制出国产第l代hCG避孕疫苗,对恒河猴进行免疫安全 性与毒理学实验研究,结果表明该疫苗能在体内诱发抗hCG的抗体反应,并且具有免疫安全 [收稿日期]20?一9一】7 [基金项日]广东省自然科学基金项目(94o365}资助 [作者简介]陈晓丽(1976,)女,贵州贵定^.碰士研究生 第5期陈晓丽等:重组质粒3h(一pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(尸mto~s)的转化117 性L3;第1期临床预初试验的结果表明该疫苗在人体内可诱发免疫反应,并且具有记忆性与可 逆性.然而,这些传统避孕疫苗所用的,~hCG是从孕妇尿中提取得到的,其制备程序相当费时, 且要经过一系列繁琐的提纯步骤,产量低,耗资大,不适合大规模推广应用;所得肌CG不易与 ahCG完全分离,会导致发生有害的交叉反应.因此,新一代的避孕疫苗应是基因重组疫苗,采 用基因工程技术制备口hcG抗原.最近,我们尝试用酵母表达系统制备Bllcc抗原,本文报道表 达质粒BllcG—pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichiapastorls)的转化. 1材料和方法 1.1材料 (1)13hCG—PBSKS质粒DNA与大肠杆菌 DH5a菌株由上海生育研究所申庆祥教授 馈赠. (2)pPIC9K质粒与P/ch/apastoris购自美 国lm,itrogen公司,载体质粒图谱见图1.该质 粒在含有a一因子分泌信号的克隆部位有4 个特异的限性酶切位点,SnaBI,EcoRI,Bg Avr1I和.NotI,用于克隆目的DNA. (3)限制性内切酶EcoRI和NotI与lr4 DNA连接酶购自大连宝生物公司.PCR反应 试剂,PBR322/Hind?marker与M)N.~d'Hind? m&l~eF购自上海生物工程有限公司,G418购 自天象人生物公司.其他常规化学试剂为分 析纯上产品.引物由上海生物工程有限公 司合成 图1载体质粒pPICgK的图谱 1.2方法 (1)目的基因,~hCG的制备:将~,hCG—PBSKS质粒DNA导人大肠杆菌DH5a,挑选转化子 扩大培养后抽提质粒,经琼脂糖凝胶电泳鉴定其相对分子质量正确后以此为模板.根据BllcG 的eDNA序列_4J设计并台成两条引物,使其上下游末端分别带有EcoRI与NotI的酶切位 点.上游引物:5'一ATAG_tLATI'C(EcoRr)CAAGGAGCCGCTIEGCA3—3',下游引物:5'一ATIGCG- GCCGC(Not工)_rrA耵?TuGGAccA1,cGGGG一3'.臼llcG—PBSKS质粒DNA 为模板,用上述 一 对引物进行PcR反应,94?变性1min,62?复性1min,72?延伸1min,扩增出两端带有 EeoRI与NotI酶切位点的目的DNA片段(437bp). (2)载体质粒pPIC9K的制备:活化已导人pP【c9K的DH5(~,碱裂解法(分子克隆方法)抽提 质粒,经琼脂糖凝胶电泳鉴定其相对分子质量正确后作为克隆载体. (3)重组子的构建:1)重组子的克隆(分子克隆方法)PER产物8aCG片段经酚/氯仿抽提, 乙醇沉淀纯化后,用EeoRI与NotI两种酶同时消化,质粒pPIC9K同样用EcoRI与NotI进 行双酶切,二者纯化后在T4DNA连接酶作用下进行连接反应,然后导人感受态的大肠杆菌 DH5a,涂布于含氨苄青霉素(.aMP)的LB板上,37?过夜培养.2)重组子的筛选与鉴定从已长 出重组子的板上挑选单十克隆,接种于15rIlL含AMP的LB液中,37?过夜培养,经碱裂解抽 l18暨南大学(自然科学版)2000年 提质粒,其作为模板,用质粒pPIC9K上的5'端factor引物与3'AOX引物和上下游引物分 别进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并根据相应DNA条带相对分子质量判断 是否已经插入.为进一步鉴定重组子,将上面挑出的克隆扩大培养,大量抽提质粒后取一定量 用EeoRI与NotI进行双酶切反应,然后用琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带相对分子质量大小. (4)转化酵母P/ch/apastor,&:质粒t~kCG—pPIC9K用SacI酶线性化后,按照 lm~itrogen公司提 供的方法用电打L转化酵母并涂布在缺组氮酸的MD板上,30?培养.将长出的菌落依次转到 含G418浓度分别为0.5,2.5和4.0.c/mE的YPD板上30?培养.缺组氨酸的MD板和含 G418的YPD板依照lnv~trogen公司提供的方法配制. 2结果 2.1PCR扩增目的基因一陆0G的结果 将通过PCR扩增所得的DNA分子于1%琼脂糖凝胶电泳,得到8h(=GDNA片段,与预期的 一 致,大小为437bp(图2). 2.2双酶切后的目的DNA与载体 双酶切后的目的DNA与载体都呈现单一条带,相对分子质量分别相应为437bp和9.3 kb,对应于相对分子质量rl~k6"T的564hp偏前位置和9416hp偏前位置(图3),与理 论值相符. 1857 ]08 929 383 l21 12 图2PCR扩增目的基因结果 PBR3222HJndmmarket;2PER扩增产物 123 Jl蛆^柏lj;DNA与载体 XDNA/Hin~II瑚击;2双酶切后的pHC9K;3.积酶切后的曲cG 2.3重组质粒llhCG—pPIC9K的构建和鉴定 口PICPK载体与PCR扩增产物经EcoRI和NotI双酶切,产物纯化后经T4DNA连接酶于 16?连接,连接产物转化后的大肠杆菌DH5a铺于含氮苄青霉素(AMP)的IJH板上,37?培养 过夜,次日观察到BhCG—pPIC9K质粒转化菌较稀疏地均匀分布在平板上,挑选几个转化菌进 行扩增,抽提质粒DNA进行PCR鉴定.分别用质粒pPIC9K上的5'端nfactor引物与3'AOX引 物和上下游引物进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测其产物,均见单一的条带(图4),其中, 原上下游引物扩增出的条带相对分子质量较小,走在前面;后者由于是用载体的特征引物,故 扩增出的产物含部分载体,相对分子质量较大(多4obp),走在后面.该电泳结果表明目的 6i27.渊猫 第5期胨晓丽等:重组质粒hcc—pPICgK的构建及嗜甲醇酵母(P/ch/am)的转化I19 DNA已正确插人载体中. 为进一步鉴定重组质粒,将上述抽提的质粒再进行双酶切处理.未酶切的重组子存在两 种DNA带型,即超螺旋与开环型,重组子长度约为9.7kb.经EcoRI和NotlI双酶切后的重 组子成为两个片段,分别为9.3kb的载体和437bp外源片段(图5),都对应于M)NA/Hind? m~ei"的相应位置.该电泳结果进一步表明了口hcGDNA片段已正确插人到载体pPIC9K中. 477 12 图4PCR鉴定重组子结果图 1原上下游引物扩增结果; 25'Q,factor,3'4OX引物扩增结果 123 图5双酶切鉴定重组子结果图 hDN~JI-llsdlIImarl~r;2积酶切后的重组于:3未酶切的重组子 2.4嗜甲醇酵母的转化 为将重组质粒导人酵母细胞,先用Sad酶处理使 其线形化,线形化后的重组质粒曲cG—pPIC9K呈单一条 带(图6),对应于},DNA/Hind??er的相应位置.用电 打孔技术把线性化后口hcG—pPIC9K导人嗜甲醇酵母,在 缺组氨酸的MD板上获得白色的阳性菌落(图7a),投有 导人口hcG—pPIC9K的酵母不能在缺组氨酸的MD板上生 长.经用含不同浓度G418YPD板筛选,在含G4184rag/ mL的YPD板上获得数十个耐G418的阳性菌株(图7b). 3讨论 hCG避孕疫苗自70年代起就得到人们的重视,目前 已进行的研究证明hCG避孕疫苗仍是一种具有应用前景 的疫苗,但没有一种能大批量生产并广泛应用于人口控 制为了能大规模生产制备免疫原,并进一步解决疫苗的 12 图6重组质粒线形化图 KDNA/HindlI1ma~er;2.未酶蜘的重组子 3线性化的重组于 个体差异问题,就需要用重组DNA技术来制备免疫原.第2代避孕疫苗将是完全 人工化,生 物工程的产品,与工业生产相接轨,解决抗原的大量生产,挖掘内在的决定簇或引 人外源性生 殖活性抗原,构建多特异性多功能复合免疫原,发展复合避孕疫苗. 120暨南大学(自然科学版)2OOO《 b 圈7cG—pPICgK转化的嗜甲醇酵母菌株 a为在缺蛆氨酸ND板上生长的阳性藏棒;b为在古4mLG418YPD板生长的阳性菌株 目前已有研究者【将重组的CG—p在EC0b中表达,但该C邵是在包涵体中表达的,而 且没有糖基化,是融台蛋白,分离,提纯比较困难.hCG是真核基因,不利于在原核细胞中表 达,因为原核细胞表达的蛋白缺少诸如糖基化和磷酸化之类的翻译后修辞,可能会影响表达蛋 的生物学恬性与构象(其生物活性无法与天然蛋白相提并论)我们采用基因白质 工程方法体 外构建重组曲cG一~ICgK质粒,导入酵母细胞进行表达,这一表达系统的优点是:利于表达 在培养上清中表达具有生物话性的目的蛋白,使真核蛋白,其质粒属分泌型,能够 纯化工艺简 单易行,并且能使表达蛋白糖基化,这正是免疫抗原所必要的.国内有报道J用单酶切构建了 重组质粒pPICgK—oLI-lct—Bh?P.我们在制各目的基因时采用双酶切法,即在上下游引物 中分别设计了不同的两个酶切位点,这样就不需对克隆载体进行去磷酸化以防止其自身环化, 也避免了鉴定重组子时对插入片段进行方向鉴定,从而减少一系列繁琐步骤.pPICgK是一种 穿梭型质粒.它既能在原核细胞中复制,又能在真核细胞中表达,用起来比较方便.车研究采 用两种方法鉴定重组子,一种是通过用原上下游引物和载体pPIC9K上的5'端afactor引物与 3'AOX引物分别进行PCR反应,都成功的扩增出单一的目的带,且前者相对分子质量较小(图 4).nfactor是pPICg~的信号序列,作用是使目的蛋白分泌到培养基中;5'端afactor引物与3' AOX引物是根据pPIC9K的cDNA序列设计的,用于鉴定外源基因是否正确插入载体;由于二 者的相对分子质量都为20bp,所以其扩增出的DNA相对分子质量比用原引物扩增出的DNA 相对分子质量大.另一种方法是用EcoRI与NotI将重组子进行双酶切,能将其切成两个相应 的片段——目的基因与载体,经鉴定二者相对分子质量正确(图5).以上都表明目的基因已正 确插入载体中,重组质粒为eG—pPICgK. 导入酵母细胞后,我们用含不同浓度G418的"tqJD板筛选多克隆的菌落.因为质粒含有一 故转化的酵母菌能够耐受G418,如果转入的外源基因拷个卡那霉索的抗性基因, 贝数越多,转 染的酵母菌耐受G418的浓度就越高,其分泌表达的蛋白量也会增加.我们已挑出能耐受4 mg/~L的酵母菌落,并诱导其分泌表达目的蛋白CG,cG—pPIC9K转化的嗜甲醇酵母的诱 第5期陈晓丽等:重组质粒phCC—pPlCgK的构建丑嗜甲醇酵母(Pichiap.咖m)的转化121 导表达的结果另作报道 致谢:感谢生命科学技术学PL~,1飞鹏教授和中山医科失学刘彦文老师对本文宴验工作的 指导,以及医学院生物化学教研室老师的热诚帮助. [参考文献] JONESwR.Contraceptive~,aceiJle[Jj}]aillereObstetricsandGynaeeology,1996,10:69. 刘学高国产避孕疫苗研究现状和前景[动物学研究,20OO,21(1):23. 潘善培,陈淑群,曹佐武等国产第一代0hcc避孕疫苗免疫恒河猴的抗体反应及免 疫安全性研究[J] 暨南大学(自然科学版),1998,19(3):81. FII)DESC,GOODNANMThed)NAforthebeta—sul~nitofhunchehorioniead曲 Ps0ggc~t8evolutionofa ger~ebyrealt}lTDughintothe3'tm~amlatedr~ionlJ.Natt~e,1980,286:684 STEVENSVSP~glessindel?em0fhumanc}-0ri? jcgozu~btropinantifertillg~vaccines[J].AmJRepmdIm- rrm帅1,1996,35:14,3. u删cuM,COSKIJNS,JAROUDIK,eta1.EffectofhuITm-el~rlcmiedl0lIeytokinep0lI鲫 humanend?l盹越cellsinE[J.ArnJRepmdlmmun~l,1998,加:83 A舳KM,PAI13NASKKB,SUBEEtlsM.P?血工ystudi~withreeomNnan~ehofionic曾d0,TDpfn口一subunit producedinEforas趴antigeninabinhcontrolvaccine【JlAmJllel~:lIramunol,1998,39:172. 王桂玉刘润梅,潘善培等重组质粒pm凹K一0L}k一CCCTP构建及在毕赤酵母 中的表达[.中国 生物化学与分子生物,1999,15:175. 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Resu】Is:B—hCGDNAfragmentwasinsertedintovectorpPICgK.B—hCGDNAWItSlinkedwithvec[ol- plo~midpPIC9Kcorrectly.B—hCG—pPIC9KI~,'ItStransfom~lintoPiehiapastoris.G4l8resistant colonieswithmultJcopyinsertsw鹊obrained.Cmldu帅:Therecombinantplasmid吕一hCG—pPIC9K was洲玛咖cted.Pichiapastofiswi[hjnserted口一hCG—DHC9Kwasobtained. [Keywords]口_hcc;PCR;plasmidpPIC9K n口