硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法的建立.doc

硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法的建立.doc 硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法的建立 【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽剂微生物限度检查法。方法 测定 硝酸咪康唑搽剂对大肠埃希菌等5种试验菌的回收率，对2个控制 菌(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)的检查方法进行验证。结果 用薄膜过滤法和0.1%吐温80-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗剂 检查本品的细菌总数、真菌及酵母菌计数，其试验菌回收率均达到 70%以上。同样用该方法检查本品的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌，其试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应。结论 用薄膜 过滤法联用0.1%吐温80-pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗剂可以 消除硝酸咪康唑搽剂在试验条件下的抑菌作用，从而顺利检出该品 种所污染的各种微生物。 【关键词】 硝酸咪康唑搽剂;微生物限 度检查;方法学验证 Abstract:Objective To establish a method of microbial limit test for miconazole nitrate liniment. Methods Centrifugal sedimentation and culture medium diluted method were used to validate the accuracy and feasibility of microbial limit test.Results The recovery of bacteria, yeast and mould were above 70%. P. aeruginosa and S.aureus were positive and Gram negative organisms were negative. Conclusions Membrane filtration and the polysorbate 80 sodium chloride peptone buffer can be used to test the total viable aerobic count and specified organisms (include S. aureus and P. aeruginosa) for miconazole nitrate liniment. Key words:miconazole nitrate liniment;microbial limit test;method validation 微生物限度检 查法是检查非规定制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法，检 查项目包括细菌数、真菌数、酵母菌数及控制菌检查,1,。但具有 抑菌成分的药品由于其抑菌活性的干扰，常规检查结果不能真实地 反映出药品中污染微生物的情况，必须先消除供试品中的抑菌活 性，再根据《中国药典》规定的方法进行检查，并必须对所采取的 检查方法进行验证，以确认抑菌活性的消除和检查方法的可靠性。 具有抑菌作用的药品，每个品种抑菌效果不同，因此适合各个品种 的微生物限度检查法也不同。 作者曾用常规法、培养基 稀释法及薄膜过滤法(用pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗)对硝 酸咪康唑搽剂进行微生物限度检查，结果均不能达到药典要求。吐 温80是亲水性面活性剂，具有增溶作用，因此本文选择用薄膜过 滤法联用0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲溶液做冲洗剂检 查该药品的细菌、真菌、酵母菌数和控制菌，结果满意，可为同类 药品的微生物限度检查法提供科学依据。 1 1.1菌 种大肠埃希菌(Escherichia coli),CMCC(B) 44 102,, 金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus),CMCC(B) 26 003,, 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis),CMCC(B)63 501,, 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),CMCC(B) 26 003,，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),CMCC(B)10 104,白色念珠菌(Candida albicans),CMCC(F) 980011,, 黑曲霉(Asperg illus niger) ,CMCC(F) 98003,，由广东生物研究所提供，菌种代数均为第3代。 1.2培养基及试剂pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液、营养肉汤、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、虎红培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂、二盐酸二甲基对苯二胺试剂、PDP琼脂培养基、三氯甲烷、甘露醇氯化钠琼脂培养基和革兰氏染色剂。 1.3样品硝酸咪康唑搽剂，阿特维斯(佛山)制药有限公司，批号:0606950，成分:硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亚砜。 2方法与结果 2.1菌液制备,1, 2.1.1取经37 ? 培养18,24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌与大肠埃希菌的肉汤培养物1 mL，加入9 mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释并制成每1 mL中含菌数50,100 cfu的菌悬液，做活菌计数。 2.1.2取经25 ?培养18,24 h的白色念珠菌液体培养物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释并制成每1 mL中含菌数50,100 cfu的菌悬液，做活菌计数。 2.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5,7 d，加入3,5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数50,100 cfu的孢子悬液，做活菌计数。 2.2供试液的制备,2,取本品10 mL，加pH7.0无菌氯化钠 蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1?10的供试液。 2.3验证方法 2.3.1细菌、真菌和酵母菌计数法回收率的测定 薄膜过滤法联用0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲溶液作冲洗剂对各试验菌的回收率进行实验，3次独立平行试验结果的均值见表1,3,。 ?试验组:取供试液10 mL到薄膜过滤器中,用无菌的0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲溶液冲洗3次，每次100 mL, 并在最后1次冲洗液中加入1 mL的试验菌液(50,100 cfu/mL)冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于预先制备好的营养琼脂培养基或虎红培养基平板上，置30,35 ?培养48 h或23,28 ?培养72 h。记录菌落数。试验组的菌回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数)?菌液组的平均菌落数×100%。 ?菌液组,4,:在过滤器中预先加入大约20 mL的无菌0.9%氯化钠溶液，再吸取1 mL的试验菌液(50,100 cfu/mL)到过滤器中，过滤。再用100 mL无菌的0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗1次，取出滤膜，菌面朝上 贴于预先制备好的营养琼脂培养基或虎红培养基平板上培养，培养方法同试验组。 ?供试品对照组:方法同试验组，但不加试验菌液。 ?稀释剂对照组:方法与试验组同，其中供试液用pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液代替。稀释剂对照组的菌回收率=稀释剂对照组平均菌落数?菌液组的平均菌落数×100% 表1各试验菌株的回收率 略 从表1可知，在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率、试验组的菌回收率均不低于70%。可用薄膜过滤法联用0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗方法检查硝酸咪康唑搽剂的细菌、真菌及酵母菌数。 2.3.2控制菌检查方法验证 ?试验组:取供试液10 mL到薄膜过滤器中, 用无菌的0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL, 并在最后一次冲洗液中加入50,100 cfu的试验菌(验证铜绿假单胞菌时,试验菌为铜绿假单胞菌)，冲洗后取出滤膜放入预先制备好的相应培养基中，依相应控制菌检查法检查。 ?阴性菌对照组:方法同试验组，试验菌改为50,100 cfu阴性对照菌(2个控制菌验证的阴性对照菌均为大肠埃希菌)。 ?菌液组 :在过滤器中预先加入约20 mL的无菌0.9%氯化钠溶液，在吸取50,100 cfu试验菌到薄膜过滤器中，用100 mL 0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液冲洗1次。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于预先制备好营养琼脂培养基上，置(36?1)?培养48 h，记录活菌数,5,。 3次平行试验结果一致，试验结果见表2。 表2对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的验证结果 略 从表2可见，用薄膜过滤法联用0.1%吐温pH7.080 氯化钠 蛋白胨缓冲溶液作冲洗剂检查铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，方法成立。 3讨 论 硝酸咪康唑搽剂为广谱抗真菌药，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亚砜等成分，对皮肤癣菌、念珠菌等有抗菌作用，对某些细菌也有一定抑制作用。《中国药典》2005版规定，对药品在微生物限度检查时，其方法应通过验证，以确认供试品的抑菌活性已被消除而保证检查方法的可靠性。从本品的微生物限度检查法的建立研究可见，选用薄膜过滤法联用0.1%吐温80 pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液作冲洗剂来检查本品的细菌数、真菌、酵母菌数及控制菌(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)的方法有效，在细菌总数、真菌及酵母菌计数实验中，试验菌回收率均能达到70%以上;铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查实验，试验组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应。本文结果可为同类产品的微生物限度检查方法验证提供科学的依据。 【