【doc】人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在大肠埃希菌 …

【doc】人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在大肠埃希菌 … 人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和L2在 大肠埃希菌 … 场一, 中华实驻和临床病毒学杂志1999年12月第13卷第4塑—hine~JExpClinViro],December1999,Vo|13.No,4 人乳头状瘤病毒16型结构蛋白L1和 L2在大肠埃希菌中的高效表达 /? 王文颖用兰萍孙亚洲 ———,r——一 } 【摘要】目的研究^乳头状瘤病毒(HPV)主要结构蛋白L1(HPV16L1)和次要结掏蛋白L2 (HPVI6L2)在原核系统的表达.采用pET-30a载体分别构建pET-30a—LI和pET-30a-L2质粒,并 分剐转^太肠埃希菌BL21苗株,经IPTG(异丙基硫代一D-半乳糖苷)诱导,表达融合蛋白6×His-I1 和6×HiL2,用SD~PAGE和Westernblot方法进行检测.结果6×His-Ll和6×His-L2融合蛋白在 BL21菌中高效表达.约2—3m.其相对分子质量分别约为60000和97000;6×His-L]降解较6× H【2多.结论HPV16结构蛋白L1和【2能在原棱表达系统高效表达;6×His-L2稳定性高于6× His-LI融合蛋白. 【主题词】兰些堕耋\^基因表达癌蛋白质'''———— —一 Efficientexpressionofhumanpal~mavirtutype16(HPV16)capedproteinsL1andL2Ecoil WANG嘶,ZHOUI:,s州Y=.r1~u'Beo'ingF~n&hiplfosp~ed,'Be@'ing10005O 【Abs?】 ObjectiveTostudytheexpressionofHPV16eapsidproteinsLIandL2inE.eoli.Methods TheplasmidspET一 30s-LlandpET-30aL2wcreconshmetedfromthepET-30avector,andtransduetedintothe BI21.1rhefusionproteins6×His-LIand6× His-L2wegeexpressedwhenindueedaddingofIGSDS- P^cEandWestemhlotanalyseswereusedtodetecttheexpressedproteinsResultsFusionprot His-L1 eins6× and6×His-L2wexpressedefficientlyinEco/i,theMrwerealeut60加 0and970o0respecUvdy.6×His. L1degradedmorethan6xH比 ConclusionLIandL2proteinswe1.eexpressedatahiglllevelinprokaryotie epre眄;o曲em,ar,dL2prc4~it~we佗mB组b王ethanL1pmn. 【K竹,*oraslPapillomavims.hmnanGeneproteinexpressionCaoeer 人乳头状癌病毒(Humanpapilloma'titus,HPV)基 因组由三个部分组成;长控制区(LCR)又称上游调 节区(URR),或非编码区(NCR);早期区,包括E1, E2,E3,E4,E5,E6和E7;晚期区,包括IJ1和L2;LI 核苷酸序列约15kb,编码主要结构蛋白IJ1,相对 分子质量约为58000,L2核苷酸序列约1.5kb,编码 次要结构蛋白L2,相对分子质量约为55000…. HPVL2和L2基因结构简单,变异性很小,即使发生 变异.也不影响蛋白抗原的免疫原性.HPV型别 的确定.是根据新克隆HPV的E6,E7或L1的开放 读码框架(ORFs)的核苷酸序列与已知型别的相应 序列相比,同源性小于9o%以上者为新型,同源性 大于90%者为亚型.目前已发现70多型HPV,根 车研究属国家"九五重点医学科技攻关专题 作者单位:100050北京,酋都医科大学附属j七京友谊医院{王 文颖);中国医学科学院肿癌研究薪(周兰萍,孙亚州) . 论着 据各型别损害和致癌性,可分为高危型和低危型 HPv粘膜低危型HPV如HPV6和11等,主要引起 皮肤和粘膜的良性肿瘤,如皮肤疣,寻常疣,生殖疣 等.高危型如HPVI6和18等,主要引起恶性肿瘤 如宫颈癌,喉癌,肺癌,口腔癌等.根据分子流行病 学研究的结果,HPVI6是我国妇女官颈癌的主要型 别.有关HPV癌基因E6,E7的研究已有很多.如 E6主要在人的乳房细胞中有活性,E7主要在人和 啮齿类的细胞中有活性等.但由于该病毒不能 在体外进行培养,妨碍了病毒自然感染历史和装配 的研究.对于主要结构蛋白Ll和次要结构蛋白I上 的研究,目前国内外许多实验室试图用原棱系统或 真系统表达L1和I上,据推测,真核系统表达的蛋白 经过翻译后修饰,形成病毒样颗粒(VLP),其活性更 接近于相应的天然蛋白.但是无论原核或真棱系统 表达的蛋白,其高产量一直是关键的问题.我们利 用原核表达载体pET-30a获得了IJ1和I上的高效表 卜//, , 中华赛验和临床病毒学杂志1999午】2月第u眷第4期 cneJExtJC|inViTo1.December1999,~ca13.No4 迭菌株. I材料和方法 i.I材料来源DET-30a载体和BI21菌株由中国 医学科学院基础医学研究所生化室赠送;pUC18-L1, pUC18.L2质粒由中国预防医学科学院病毒所遗传 室赠送;1kbDNAladder为GIBCOBRL公司产品;限 制性内切酶BgllI,BamHI,EcoRI,q'4DNA连接 酶,蛋白中相对分子质量标准品为美国Promega公 司产品;KpnI为华美公司产品;DH5a为肿瘤研究 所保存;Penta—HisAb为德国Qiagen公司产品;GaM— HRP为美国Jackson公司产品. 1.2质粒构建HPV16LI和L2ORF克隆到 pET30a载体的方法如下:pUCI8-LI和pUC18L2分 别用BgllI酶切后,用DEAE一纤维素法回收纯净化, pET30a载体用BamHI酶切后,用同样的方法回收 纯净化,然后在_r4连接酶作用下,将L1(nt5637一nt 7151)和L2(nt4138.nt5668)分别克隆到DET一30a 的BamHI位点.克隆的结果经酶切鉴定正插方向. pET30a-L1用EcoRI酶切,pE730a—I2用KpnI酶 切鉴定. 1.3LI和L2融合蛋白的表达DET30aL1和 pET30a.L2质粒经过42?90s,分别转入感受态的 BL21菌中,含该质粒的菌在37?生长至对数中期, (A600ilm=06),加入IPTG使终浓度为1mmol/L. 诱导3h球浴5min;5000r/rain4?离心5mira,弃上 清,菌体用1/10体积50mmol/LTris(pH8.0),2 retool/LEI)TA重悬,加入溶菌酶(500IIl1)和1% TritonX一100(1%体积),30?15rain;12000r/IIlin4屯 离心15mln,弃上清,沉淀中加入1/50体积50mmol/ LTris(pH8,0),2mmoI/LEDTA重悬,进行L1和I上 蛋自检测. 1.4-SDS—PAGE上述IJ1和I上的蛋白悬液分 别取1,ul在醋酸纤维素膜上打点,吹干后,用蒸馏水 打湿,在10%的丽春红中染色l0mln,用水脱色与 标准浓度牛血清蛋白打点图进行比较,确定蛋白悬 液的浓度,然后取20g蛋白,与等体积2×SDS加 样缓冲液混合,煮沸3min,上样,其中,分离胶浓度 为12.5%,浓缩胶浓度为1.67%.采用稳流,蛋白 在浓缩胶中用稳流40mA,进人分离胶后用稳流6o mA,当溴酚蓝迁移至距胶下缘5mlll时,停止电泳. 取下胶,在考马斯亮蓝中染色3h,脱色. 1.5Westernblot分析取1OL1或L2蛋白,同 上进行SDS—PAGE,停止电泳后,用半干式电转移的 方法,将凝胶上的蛋白质转移到醋酸纤维素膜上,吹 干膜,在10%的丽春红中染色10min,用水脱色.再 晾干膜,在3%lISA(封闭液)中封闭lh,用TBS— Tween20一Tritonx.100(订r)洗液洗涤5min,重复3 次,加入Penta—HisAb(1:1000于封闭液中稀释),反 应1h,轻轻摇动,用m洗液洗5min,重复3次,加 入GaM—HRP(I:10000于封闭液中稀释),闭光反应 1h,轻轻摇动,用订r洗液洗涤5min,重复4次,加 入显色液4.氯一1.萘酚进行显色. 2结果 2.1质粒构建和鉴定质粒的构建见图1,酶切鉴 定结果见图2. .C2hlBamHi:c2h Bg[.; ::::::,.ll[BglII—— ;4kb一 L1j5kb\,,—/L2j5kb , , /\,/. Lc…1{ /一,,\/—,,, ..)T~M3a- \-,一.\,一/ ER137(2hIK.n137.(2u /ll,-/\, 围1重组表达质粒pET-30~LI和pET-30a-u的构建 Fig.1Const~etionof~oombinan!Drej0n pl~smidspET-3~a-LIandpET-30a-I_9 2.2SDS.PAGE结果在SDS.PAGE的结果中,与 pET一30a表达的蛋白相比较,pET-30a—L1和pET-3Oa- L2表达的靶蛋白分别位于相对分子质量60000和 约97000处;6×His.LI融合蛋白的相对分子质量约 为60000,6×His—L2的相对分子质量约为97000. - 360 见图3 生望塞堕塑l竖宣蔓兰垄查塑!堡!旦整堂蔓塑堂坠P!?塑! ABCM 羞圈2重组质粒pET-30a-L]和pET-3Oa,L2 鉴定的琼脂糖凝胶电辣 F.2I呲c山吼ofpL~mldspET-SOa-LIand pET-30a-L2hv~slfictimertdonoe]~Ec0R andKpnIin?l0日eelectmpho~sis M:lkbDNAladderA:pET-30a-I.2./KlmIBET-30a—LI/ EIC:pET-Mla]EeoRI 毪 算争0 瓣97X)晰CI)#55fX船 M:中相对分于质鼍蛋白标准;A:pET一3一1.】质粒表达的 L】蛋白;B:pET-3Oa-L2质粒袁达的L2蛋白;C:pET-30a 载体表选的蛋白对J瞩 圈3大脑杆菌中表选融音蛋白6xHi~-LI删d6 Hi~L2的SDS-PAGE电诛(125甓SDS- PAGE.考乌斯亮蓝染色) Fig-3SDS-PAGEanalysisof6xHI~LI删d6×His?L2 fnsi~pfotelnsexpressedjnEcdi(125%SDS? PAGE一?L—ebrini~!bl…lBjn) M:MidrangeT?I?wBpmte~nm;A:L1protein er.[rtessedf/cm一哪dpET?30a—L1;B:也pr~ein~pressed fromplasmidpET-30a?L2:C:Proteinexpr~sedfromvecEo pET-30a盼olmEml 2.3Westernh|ot结果如图4所示.6xHis.LI和6 ×His—L2均有不同程度的降解,但6×His.L1的降解 较6×His—L2更为严重,60O00下方有若干条降解蛋 白带;而6×ttis-L2的97O00下方只有4条很细的降 解蛋白带 ? .._蔓—一 囊j___一42lxm j. 二:: 囊够一爱ll M:中相对分于质量蛋白标准;A:pET-30a-Ll质粒表达的 LI蛋白;B:pET-30a-L2质粒表达的L2蛋白;c:pET-30a 载体表达的蛋白对j!{l 围4Pent~His单抗艟测6×His—L1and6xHis-L2的 Wemblot结果【单扰稀释度为1:1000) F姆.4WesternblolT鹧ulIof6His—IJ]删d6×Hi~k2一 ~tingvdtbpema-HisMcAb(theMeAbdilution一11000) M:Mid-rangemalecul~welBproteinTTr,A:1.1lrnaein expr~sedfromp]asmidpET-30a—LI.B12proteinexpressed h帆挑dpET-30a-L2;CPnexpres~,dh?f pET-Mlaascontrol 3讨论 通过对原核系统和真核系统的表达研究结果显 示,HPV的主要结构蛋白IJ1的相对分子质量约为 55000,HPv次要结构蛋白l2的相对分子质量约为 72000一91;我们用原核表达载体pET-30a表达的IJ1 和I2融合蛋白相对分子质量分别为60fi00和 97000,提示L2可能以聚合体形式存在,Banks 等在原核表达系统表达了HPV16LI一8.半乳糖苷 酶融台蛋白和HPV16L2.0一半乳糖苷酶融合蛋白,在 SDS—PAGE的结果中L1融合蛋白的相对分子质量比 预期相对分子质量低很多,Westernblot的结果显示 在预期相对分子质量位置有一条微弱的蛋白带,说 明IJ1大量降解.KirnbauerR等"在昆虫细胞中表 达了L1和L2蛋白.L1和L2都有多条降解蛋白带. 在我们的结果中,IJ1和L2融合蛋白均有部分降解, IJ1尤其明显,这一结果与文献报道相一致.提示我 们在进行u和L2的操作,尤其是L1操作过程中必 须在冷室条件下,而且尽量避免反复冻融,以及操作 过程中加入某些蛋白酶抑制剂.?Sz等的研究 指出,u的稳定性小于L2.是由于IJ1磷酸化和糖化 都很弱,且磷酸化半衰期很短,仅60rain.120min 后磷酸化基本消失;而L2磷酸化和糖化增多较强. L2的磷酸化半衰期为3h.在24h后,仍有磷酸化 中华宴验和临床捕毒学杂志1999年】2月第l3卷第4期— C— hine~JExpClJnVirol,D~ember1999,Vol13.No.4 存在.在我们的结果中,L2的稳定性远大于L1,提 示我们:原核系统表达的蛋白,也有类似磷酸化的修 饰.我们已经获得了高技价的L1和L2免疫血清, 将另文发表. 参考文献 l候云德分病毒学北京:学苑出版社】99O 2PushkoP,SasTCu2iekJ,sequ…variationthep? dpmtofh1Lmapapi1msb,p~-16JGeaVirol,1994, 75:91】.9I6 3孙亚洲致病的人乳头瘸病毒和宫颈癌病原学研究的新概念. 国第五官颈璃学术台议论文摘要汇编.北京:中国医学科 学院,1995.76.79 4吴爱茹孙亚洲tlI西襄垣官颈癌高发区妇女生殖人乳头瘸病 毒(HPV)感染与南颈痛关系的研究.中华肿瘤杂志.L992,】4: 293.297 5Haw]ev?Nt1Bl啪P,Vou皂enKH,HubbertNL.HPV】6E6al】dE7 proteimcooperateto】nH【mtathuma口l"orezkinkerat[noc~,tesEMBO. 1989.8394~5.39l0 6MungerK,PheWC.BubbV m曲pngillomavimst?ge16are TheE6呲dE7geneso1thehu? tc~ether…saandsI】"lfor 361 transfo~tionofprimal'humanketafin~ytesJVirol,198963:4417? 442I 7DoorbarJ.Cl?I由PHIdPnfificafionofproteinsenoodedbytheL1and 吐openrendingh蜘ofhumanp印"ImnavlnLaJVimL,1987,61: 2793?2799 8Fir~laffJM.KJviatNB.Beekm~nnAMet.DeIect0fHPVeapsid a~afigensin恤舢oIepitheliMIe8j0nsusingantibodi~ted asainsttheL】aJ-dL2open~dSn8Il础Vimlogy.L988,164:467? 4秆 9Yaeg~hiN.Jeni~SA.ValPnfineJM,etalCharacterlzatio~o1 dpoLycLnnal咖emandmon~lonalant【dl幅n删耐againstin? t础al】ddenat~lHPVl…B.,V199175:1538-15. 10BandsBL.MatMsh~'sklG.PimD.eIExp~,itmofHPV16cap~id pr~einsiFbacteriaal】dthelx~figenleebamelerizadonJcenViro1. t987.68:308I?3O89. 】】KirebaterR.TaubJ.G…【eH,eta1.Effi~ent~lf-assemblyof HPVL6LIandL2into*im~lthepartfol~~JVimI,1993,67:6929? 6936 I2x]SZ.BanksLM.Baeu[o,,5msexpressio~0ftheHPVL6c8璐i:*ole4ns: deteetitm0fLI-L2proteincomplex~JGenViroI.199172:298l? 2988. (收稿:1998.tO-21修回:】999-02-24) 酒精性肝病患者肝炎病毒的检测及其临床意义 李东良林华陈紫榕 肝炎病毒和酒精为肝实质损伤的两 太主要原因.为了解酒精性肝病(Alco— holicliv盯diseas,ALD)重复肝炎病毒感染 的状况及其临睐特点,我们采用聚台酶 链反应(PCR)法巢式PCR法分别柱阐l HBVDNA,HCVRNA;应用酵联免疫吸附 (ELISA)法检测A—G型肝炎病毒血清 标志物,试剂均为卫生部批准的合格产 品.各型肝炎瞒毒感染的定依据分别 为:抗一HAVlgM阳性;HBeAg和,或HBV DNA阳性;拄.HCV和f或HCvRNA阳 性;HDAg和抗一HD~阳性:抗一HEVIgM 用性;抗一HGX'阳性.血清标本取自解放 作者单位:3500O2幅州.懈放军476中 医院肝病研究所 军476医院1995年1月一1998年l2月 肝病门诊及住院的124名AL1)患者,其 中酒精性脂肪肝(AFL)6d.倒.酒精性肝 捉(AH)24例;酒精性肝硬化(AC)24例, 嗜酒者肝癌(PHC)12例均符合日本 1993年修订的ALD诊断及分型标准. 检测结果.ALD患者肝炎病毒榆出率为 3629%(45/124),显着高于非ALD患者 l2%'12/LO0);主要病毒为HBV2016% {25/124j,HCV9.68%(12/124j,二者均 高于非ALD组9%,2%与报遭的本地区 白然人群HBsAg和抗HCV阳性率 1l12%,2.29%;其它各型肝炎病毒检出 率与埘照组无差异PHC患者肝炎病毒 (9/2),AC次之,为 检出率最高,为75% 5833%(14/24j.二者之和为63.89% . 论着摘要 (23/36),显着高于非硬化组25%(221 88),表明长期过量饮酒可增加HBV和 HCV的易感性,且随着ALD的病程进展 肝炎病毒的检出率逐步升高.本组HBV 检出率高于HCV检出率与日本报道的 嗜酒者主要伴随HCV感染'35%).而 HBV感染只有6%有所不耐.这可能与 我国HBV感染高发有关.研究结果还 显示伴随肝炎病毒感染的ALD患其肝 功能损伤程度较单纯ALD患者严重.提 示嗜酒着肝损伤的发生,发展与重复肝 炎病毒感染并复有密切关系.酒精和肝 炎病毒对肝细胞损伤有协同和加强作 用. (收稿:L999.03.29修回:L999-07.08)