P物质的分子神经生物学研究进展

P物质的分子神经生物学研究进展 7厂硬j军, ,吾笙 生理科学进展1994年第25卷第1期l P物质的分子神经生物学研究进展 李红胜赵志奇(中国科学院上海脑研究所,上海20003]) ?’———————一————一 “ll ? 37? z 摘要P物质约分子神经生物学得到了较广泛的研究,其中包括P物质妁生物 合成与器节,活性均象,释放与灭活,对膜通道的影响以及P物质受体的分子生物学 等.另外,还涉及到了P物质N端片段的功能及结台位点.这些工作为从分子水平上 选一步闰明P物质在神经系统审纷繁而重要的生理功能奠定了基础. P物质(substanceP)是发现得最早的一种神经肽,它与 neurokininA(NKA,也称K物 质),neurokininB(也称neuromedinK)共同组成哺乳动物的速激肽(tachykinin)家族,广泛分 布于周边及神经系统中,在各种组织中呈现出纷繁多样的生理效应.近年来,P物质的分子神 经生物学研究有了长足进展. , ,生物合成 70年代,Leeman研究组首先对P物质进行了测序,提出了十一肽的正确肽链序列.即 ArgPro—Lyr—Pro—GluGluPhe—Phe—Gly—Leu—MetNH2Tregear等用化学成功地合成出 了此肽,而生物合成的研究有赖于DNA重组技术的发展.由于神经肽不是在神经末梢合成, 而是以胞体内核糖体合成前体大分子为前提,固此要阐明P物质的生物合成,必须研究其前 体.目前已弄清了数种前速激肽原的生物合成及加工过程,其中含P物质的有三种. 哺乳动物细胞内编码含P物质的前速激肽原(PPT,preprotaehykinin) 的基固转录出一 种hnRNA,包含7个外显子与6个内含子.第3个外显子编码P物质肽段,第6个外显子编码 NKA片段.其它外显子则编码信号肽或间隔序列(spacer).形成成熟mRNA时,由于不同的 剪接方式产生了多种mRNA,分别命名为a一,8-,7一PPTmRNA.其中,7一PPTmRNA保留 了第6个外显子,能合成出K物质.而—PPTmRNA中遗失了此外显子.因此只能出P物 质.在不同组织中,mRNA的剪接方式,产生的三种PPTmRNA的数量比例都有差异.这种 差异在牛的神经组织与周边组织之间尤为明显,如牛神经组织中a/p—a/1,甲状腺中a/口= 1/10.这一差异导致牛神经组织中P物质的量比NKA高.而在甲状腺中NKA含量则高得 多.最近Bannon等却发现.在鼠和人体内不到a—PPT的存在,而且}与7PPT的相对 含量无组织特异性,鼠和人体内两者比例分别为1:10和4:l. 根据神经肽生成的一般模式,PPT由核糖体边合成边进入粗面内质阿,然后被切除信号 肽.进入高尔基体后经胰蛋白酶样蛋白酶 (trypsin—likeproteinconvertingenzyme,TLPCE)切 割出只含P物质的肽段,接着可能在囊泡中经羧肽酶,氨肽酶,氧化酰氯化酶等的作用最后生 成P物质.后面这部分加工过程与囊泡的轴浆运输同时进行. 对P物质生物合成的调节现在研究得还较少1991年,Freidin等一及另一家实验室都报 道,细胞因子中的白细胞介素1(II1S)加入培养基后,在非神经元细胞存在下能升高体外 培养的颈上交感神经节中PPTmRNA和P物质的含量,而免疫抑制剂糖皮质激素及地塞米 松(dexamethasone)则阻断此效应,其机制尚不明.从I1J一1口的作用可看到,一方面P物质对免 生理科学进展1994年第2j卷第1期 疫系统有正向的促进作用,另一方面免疫系统也能反作用于P物质.Freidin等(1991)的其它 工作还显示白细胞病抑制因子(LIF)也具有与IL一1p相似的作用.另外,膜联神经递质刺激因 子(MANS),睫状神经趋化因子(CNTF)以及钠离子通道阻滞剂河豚毒素(TTX)都可单独促 进交感神经节内PPTmRNA和P物质的生物合成,而促进钠离子通道开放的神经遵质或药 物,如乙酰胆碱,veratridine等则呈现出相反的作用,这种负向调节作用能抑制前述的正向作 用.这些效应似乎与cAMP及ca”_系统均无关系此外,多巴胺也能调节PPT基因的表达,除 了增快转录速度外,更显着的是促进PPThnRNA加工形成成熟的PPThRNA.多巴胺的调 节作用主要是由D一2多巴胺受体介导,但还必须有D一1多巴胺受体的参与. 二,活性构象 通过对P物质不同长短的片段及各种D型氨基酸取代衍生物的活性研究,目前认为,C 端6个氨基酸为其生物活性所必需.最近,Duplaa等用相应的D型氨基酸分别取代P物质 的各个氨基酸残基后进行生物活性及受体结合,发现第6,7,8,9,11位的氨基酸残基被D 型氨基酸取代后,受体结合能力几乎完全丧失据此他们认为,Phe,phe的芳香环,Met”的S 原子及酰胺键都是与受体发生作用的必需基团,另外Arg的胍基也有一定作用,因为Arg被 取代或去除后,P物质与受体的亲和力明显下降.Chassaing等(1986,1988)根据用NMR技术 进行分析所得的实验资料,提出了一种P物质活性构象:第4,8位氨基酸残基形成的a或3. 螺旋是分子的内核,C端的三个氨基酸残基则形成较为伸展的多聚C样的结构.Connert等. 还发现,某些具有受体结合活性的P物质D一型氨基酸取代物是以 两个13折叠作为其分子的内 核有些P物质衍生物具有P物质受体拮抗剂的功能,即只具有与P物质受体结合的基团而 无正确的促使受体构象变化的效应基团,这将为深入研究P物质各基团的具体功能提供资 料.. P物质酶解去除C端四肽后失去了痛觉传导的功能,但生成的N端七肽显示出了一种新 的构象,在神经系统中具有镇痛作用,与先前的作用完全相反.有人认为它可能通过专门的P 物质N端受体起作用.1990年Igwe等.在鼠脑中发现了一种专一的P物质N端七肽结合位 点,Kd为2.5nmol/L,同时在脊髓中发现了两种亲和力不同的结合位点,Kd分别为 0+O3nmol/I和5.4nmol/L,后者含量明显多于前者 三,释放,作用与灭活 P物质释放前贮存于突触小体内的囊泡中,神经冲动传来时引起离子通道开放,外钙内 流,促使囊泡与前膜融合而释放出P物质.小的初级感觉神经元含有P物质,高钾可引起培养 的初级感觉神经元的ca依赖性P物质释放.近来用抗体微电极技术可精确定位痛觉刺激和 辣椒素引起的P物质在脊髓背角的释放n].在初级传入中P物质的释放可被阿片肽和击甲 肾上腺素(NA)所调制. P物质一方面与后膜的P物质受体结合而作用于突触后神经元,一方面则被神经元或胶 贡细胞膜上的内肽酶EP一24.11酶切失活,而不是象在外周一样被血管紧张素I(an— giotensinIconvertingenzyme,ACE)酶切降解.EP一24.11是,种分子量为87kD的,含一个 Zn的糖蛋白,通过N端的一个疏水肽段结合在膜上.它主要在Phe,Leu,Tyr,Trp等疏水氨 基酸处切割多肽,是一种广谱内肽酶,中枢神经系统中大部分神经肽都由它酶切失活,一般为 多位点酶切.与其它神经肽的酶切失活不同,P物质在Phe与Phe之间被酶切时不仅丧失了 痛觉传导的功能,而且产生了镇痛的P物质N端七肽.因此在神经药理学实验中出现了这样 一 种剂量效应;在痛觉相关部位给较高剂量P物质时能致痛,而给低剂量P物质时反而能镇 生理科学进展1g94年第25卷第1期 痛这可能就是因为EP一24.11将低剂量P物质迅速酶解完,并产生了少量P物质N端七肽的 缘故. P物质与神经元膜上NK—l受体结合后.和在外周一样也是通过G蛋白与磷脂酰肌醇二 磷酸(PIP)第二信使系统相联系,通过三磷酸肌醇(IP)作用于膜上的钙离子通道,引起膜电 位的去极化和蛋白激酶活性的改变,从而达到改变神经元活动的目的.IP还可与内质阿等胞 浆膜上的I受体(可能就是P蛋白)作用0,促使这些胞浆膜腔内的钙离子释放到胞浆中, 升高胞浆中的钙离子浓度.此外,二酯酰甘油(DAG)可与静息状态时正常浓度的钙离子共同 激活ca依赖性蛋白激酶(PKC),PKC除了引起代谢活动乃至基因表达的改变外,也能使胞 膜上的钙离子通道开放,引起外钙内流及膜的去极化.P物质在神经系统中主要通过NK1受 体起作用,有时也与NK一3受体作用.这种受体类型则可能与cAMP第二信使系统相耦联 Womack报道,P物质能升高27脊髓背角神经元的胞浆钙离子浓度,其中一半神经元是通 过I促使胞内钙库如内质阿等释放钙离子到胞浆,称为R型神经元, 另一半神经元则是通过 外钙内流升高胞浆钙离子浓度,称为E型神经元 关于G蛋白与P物质受体的关系,目前还不清楚有指出,用影响G,G—G的药物 均不影响P物质引起的去极化反应因此认为,参与P物质作用的G蛋白可能是一种未知的 新的G蛋白.’ 四,受体与离子通道研究 与其它神经递质或调质类似,P物质也能作用于多种类型的受体.速激肽家族有NK—l, NK一2,NK一3三种受体,都能与P物质相结合.其中P物质与NK1受体结合能力最大,因而 NK一1受体特称P物质受体(SPR),NK2,NK一3受体则分别称为K物质受体(SKR)和neu— romedinK受体(NKR);但在机体中P物质发挥其生理功能并不仅仅通过NK一1受体,在外周 组织与神经系统中还分别通过NK一2和NK一3受体起作用.目前已有了专一的NK—l受体激 动剂与拮抗剂,因此能将其功能与另两种受体的功能分辨开来. P物质受体研究最显着的成果是运用重组DNA技术和非洲爪蟾卵母细胞表达系统获得 了该受体的单克隆cDNA,由此cDNA序列推出了受体蛋白完整的氨 基酸顺序,并鉴定其为七 个跨膜结构的受体类型.这一工作是由日本Numa实验室的Nakanishi等”首先完成的,几乎 与此同时,美国的Hershey和Krause2Ja]运用多聚链反应(PCRj技术也得到了相同的结果. Nakanishi等还对表达在爪蟾卵母细胞膜上的P物质受体进行了一系列电生理特性研究,获 得了一些整体实验较难得到的资料”. 在P物质受体的各部分肽段中,第V,?个跨膜区及第1个胞内环可能与G蛋白相耦联 胞外的端是糖基化部位,咆内的C端是磷酸化部位.N端,C端及第?个胞内环与先前测得 的NK一2受体的相应序列相差很大,提示P物质与受体结合的专一性和作用的特异性由这三 部分区域来实现.P物质受体与NK一2受体的第1-,?个跨膜区则很相似,可能是速激肽受体 家族的特征结构区.通过C端的磷酸化与脱磷酸化,受体活性可由胞内的蛋白磷酸他系统加 以调节.磷酸化导致P物质受体脱敏,由肾上腺素受体激之类的特异激酶介导,脱敏可持续 1~2h(Putney等.1991).以前认为,这是由于磷酸化后的受体因为与逮捕固子(arrestin)结合 而同G蛋白解耦联,现认为到少不完全是这一种机制,还可能具有受体从胞膜上分离内流或 降解下调等机制,这样才与脱敏持续时间相吻台.因为只有受体的重新合成才需要这样一段较 长的时间. P物质受体的基因组成最近也由Hershey,Krause等进行了研究.该基因含A,B,C,D四 生理科学进展1994年第2j卷第1期 个内含子和五个外显子,编码区上游的TATAAA序列是RNA聚合酶的识别位点,在一52至一 45处有一段序列5TGACGTCT一3’与f的ca诱导序列5TGACGTTT3及cAMP反 应因素(cRE)识别的同感序列5fT(G/T)ACGTCA一3都很相似,这是否意味着P物质受体 的表达同时受ca和cAMP两个信号系统的调控还有待进一步研究. 将P物质mRNA克隆或含P物质mRNA的组织总mRNA注入卵母细胞进行表达,用 电压钳技术记录外源性P物质对其膜特性的影响,发现P物质灌流几秒种后引起氯离子通道 开放.产生具有振荡特点的内向电流.其机理是P物质与其受体结合后,通过G蛋白激活磷脂 酶c(PLC),生成IP使胞内钙库释放ca”,ca”作为第二信使促使氯离子通道开放一增大cl一 电导;由于ca对钙库上的I受体有负反馈调节作用,因此,P物质引起的内向电流具有振 荡特性. 在不同的神经细胞,P物质对离子通道的作用不同.如在背根神经节细胞,P物质作用于 受体产生内向电流,不依赖于钙离子通道,而是非选择性地开放离子通道,使Mg,Na流入, Mg”增加,阻断K电导,K和cl一的流出也可能参与P物质的去极化作用.但在脊髓背角神 经元,P物质抑制I,关闭M通道,产生慢的内向电流,它是ca依赖性的.这些结果提示,同 一 物质在不同细胞上对通道的作用可能不同.因此,对P物质在中枢神经系统中的作用机制 进行分析时必须谨慎. 五,生理意义及研究前景 P物质广泛存在于外周及中枢神经系统中.免疫组化实验显示,P物质在下丘脑,脑干,脊 髓以及杏仁复合体等的中间神经元或投射神经元中都呈明显的阳性,可以推测它在神经系统 中的生理功能是至关重要的.目前的研究主要是集中在其痛觉传导的作用上.对P物质的神 经分子生物学研究将揭示其发挥生理功能的分子机制,弄清其作用受到哪些因素影响,如何影 响.认清这些机理有可能为有关病症的诊治提供理论指导.P物质和其它神经肽一样,与经典 递质共存于同一神经元内.如与5一HT或5-HT/TRH共存于大鼠延脑,与ACh共存于某些副 交感神经元,与兴奋性氨基酸共存于脊髓初级传入神经元等.P物质与共存的递质之间存在相 互作用,这种相互作用发生在突触前还是突触后,其分子机制如何,都有待于进一步研究. 神经系统中P物质的生理功能并不仅仅局限在神经系统内部,它在神经系统与非神经系 统问的桥接作用也越来越引人注目,尤其是在神经系统与免疫系统,神经系统与内分泌系统之 间的作用.P物质能以神经分泌的方式作用于各种免疫细胞,促进免疫系统功能.它能促进单 核巨噬细胞的吞噬和趋化活性以及IL—I—II6,7-干扰素和PGE的产生,促进肥大细胞释 放组织胺,参与炎症反应.还能激活B细胞合成分泌免疫球蛋白.P物质对于内分泌系统则能 调节垂体内LH,TSH,PRL,GH的分泌以及下丘脑中 LHRH,TRH,SOM的分泌等.反过 来,免疫系统与内分泌系统也能影响P物质的合成与释放,前述的IL 一1p和糖皮质激素对颈上 神经节中PPTmRNA的转录和P物质的合成的调节作用就是一个例 子.另外,免疫细胞产生 的组织胺和PGE还能易化初级传入纤维释放P物质,导致痛觉过敏. 这些纷繁而重要的相互 作用也要求在分子水平上加以深入研究. P物质的分子神经生物学已有了一个基本的轮廓,需要进一步深化, 还有不少欠缺的环节 如体内P物质N端七肽结合位点的分子结构,P物质受体的脱敏及基 因调控等有待于我们去 补充. 生理科学进展1994年第25卷第1期 参考文献 1BannonMJ.HaverstJckDM.ShibataK.etat.Prepro tackykiningoneexpressionintheforebrain:regulation bydopamineIn:LeemanSE.etaledsSubstancePand RefatedPeptides:CellularandMolecularPhysiolc~ gY.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.o1 632NewYork:theNewYorkAcademyofSciences. 1991.31,37. 2FreidinM.KesslerJA.Cytokineregulationofsubstance Pexpressioninsympatheticneuron8.ProcNatlAcadSci USA.1991.88;3200,3202 3Dup[aaH.ChassaingG,LavielleS.etalInfluenceofthe replacementotaminoacidbyitsDenantionerinthese— quenceofsubstanceP1Bindingandpharmacologica! dataNeuropeptidest1992.19:251,257 4ConvertO.Dup[aaH.LavielleS.etalInfluence0fthe replacementofaminoacidbyitsD-enantionerinthese— quenceofsubstance2ConformationalaI_[ysisby NMRandenergycalculations.Neuropepridest1992. 19;259,270. 5IgOJ.KimDC.SeyboldVS.etat.Specificbinding. substancePaminotermina[heptapeptideESP(i一7)to mn1】sehrainandspinalcordmembranes』Neurosci, l990,10I3553,3663. 目DugganAW?HendryIA,GreenJL.etThep~para— tionand—ofantihodymicropobes.JNeurosciMeth. 1990.23:24I,243. 7ZhaozQ,YaagHQ,ZhangKM.eta1.Re[easeanddephi一 ?41? tionofs0hsta~cePbycapsaieininsubstantiago[atinosa stndeindwiththeantibodymicroprobetechniqueandim— munohistoe]lemistry.Neuropeptides.19g2,23:】61, 167. 8TurnerAJ.Enopeptidase一24118ndneuropeptide metabolism.In}TurnerAJedNeuropeptidesandTheir Peptidases.Weinheim:VCH.1987183,201. 9MikoshlhaK.AcerebettarpurkinjecellmarkerP{0 proteinisaninositol1.4,5-trisphosphate(1nsPr)一 ceptor.In:SarakeM.etat.edsMo[ecularBasisof NeuronalConnectivity.Nigata:Kohko—doCo,Ltd.. 1992l56,l58. 10~/omackMD.Mechanismsunder[yingmudulatianof dorsalhornneuronshysubstancePDissAbstrIntB. 1991.5l;3268. 1lYokotaY.SasaiY.TanakaK.etalMdecularcharac terlzatlonofafusctiona1cDNAfo…tsubstat,ceP一 ceptor.JBiolChem.1969t264:l7649,17652 l2HersheyAD,KrauseJE.Molecularcharacterizationo aluncdona[cDNAencodingtheratsubstancePrecep- totScience.19g0,247:958,962. 13HarndoY.MasuY.NakanishiSExpression0f?dif femurtaekyirdnreceptorsinxenopusoocyte8byexoge 乃【)1]smRNAsJNe~osc1.1987.713265,3Z73. 14JessopDS,etal_SubstanceP:mu[tifunctiona[pepdde inthehypothalamopituJtarysystemtJEndoerinol, l992.132:331,337 一 氧化氮在阿片耐受中的作周 阿片耐受的机理至今还不清楚,一系列复杂的因素在阿片耐受过程中发挥着作用,兴奋性氨基酸NMDA 受体可能参与吗啡耐受的形成.因为NMDA受体拈抗剂可延缓吗啡耐受的发生.近年来的工作表明.激活 NMDA受体弓f起的作用有一部分是通过NO产生的.本文应用NO的合成抑制剂NOArg观察是否能阻止 吗啡耐受的发生实验结果表明.NO:Arg可蹦防止吗啡耐受的形成,并能翻转吗啡耐受,呈剂量效应关系, NO:Arg还能防止吗啡成稳的发生,但NOzArg不能防止型阿片受体激动剂的耐受.说明型阿片受 体激动剂吗啡与激动剂U50.488H和K.激动剂NalBzOH的耐受机理各不相同. {ProcNadAcadSciUSA.1993.90i516~5166.”)(董宏伟韩济生)