未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN叫和IL-12表达的影响

未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN叫和IL-12表达的影响 未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN 叫和IL-12表达的影响 事罗清等未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN一和IL.12表达的影响第3期 doi:10.3969/j.issn.1000—484X.2011.03.004 未成熟树突状细胞对T细胞活化及其IFN叫和IL.12表达的影响? 李罗清孙圣刚?曹学兵?王云甫?(湖南省岳阳市一人民医院神经内科,岳阳414000) 中国图书分类号R392.1文献标识码A文章编号l000-484X(2o11)03.0209-04 [摘要]目的:探讨未成熟树突状细胞(DC)对T细胞活化及其IFN一和IL-12表达的影响.方法:通过诱导Lewis大鼠 骨髓前体细胞,获取未成熟(iDC)和成熟(mDC)两种状态的DC;将两种DC用乙酰胆碱受体(AChR)负载后进行T细胞重复刺 激,交叉刺激和无关抗原刺激试验,观察T细胞增殖情况并测定T细胞IFN一,IL-12的表达水平.结果:(1)AChR负载的iDC可 明显抑制T细胞增殖,且这种被抑制的T细胞对AChR负载的mDC的交叉刺激也不引起增殖,但对无关抗原OVA负载的mDC 的刺激可产生明增殖.(2)与mDC组比较,AChR负载的iDC初次和重复刺激均明显抑制T细胞IFN一和IL-12的表达.结 论:iDC可诱导抗原特异性T细胞耐受,耐受机制可能与Thl细胞因子IFN一和Il厂l2的抑制有关. [关键词]树突状细胞;T细胞;免疫耐受;细胞因子 Effect0fimmaturedendriticcellsontheactivationofTcellsandtheexpression0f ?1N.YandIL.12byTcells LILuo—Qing,SUNSheng一,CAOXue—Bing,WANGYun—Fu.DepartmentofNeurology,YueyangFirstPeopleHospi— tal,Yueyang414000,China [Abstract]Objecfive:Toinvestigatetheeffectofimmaturedendriticcells(DCs)ontheactivat ionofTcellsandtheexpressionofIFN一 andIL-12byTcells.Methods:IrmnatureandmatureDCs(iDCsandmDCs)wereinducedf南 mratbonemarrowprecursoreeHs.Afterpulsed withacetylcholinereceptor(AChR).DCswereusedt()stimulateTceHsbyanystimulationso frepetitive,crossorindependentwithantigen0一 valbumin.FheproliferationofTcellsandtheexpressionofIFN一了 and1L-12byTcellsweremeasured.Results:(1)TheAChRpulsediDCsin— hibitedtheproliferationofTcells.Their~hibitedT('ellsdidn'tpropagatewhenrestimulatedb yAChRpulsedmDCsbutpropagateintensively whenrestimulatedbyovalbuminpulsedmDCs.(2)ComparedwiththeresponsesofmDCs,th eexpressionsofIFN一andIL-12byTceHsstimu— latedwithAChR—pulsediDCswereinhibited.Conclusion:iDCscouldinducetheantigen —specifictoleranceofTcells,whichisrelatedtothein— hibiti()nofThlproductionofIFN一7andIL-12. [Keywords]Dendriticcells;Tcells;Inmmnetolerance;Cytokine 树突状细胞(Dendriticcell,DC)既可启动免疫应 答,也可诱导中枢和外周耐受.DC提呈抗原最终表 现为免疫激活还是免疫耐受的决定因素目前尚不十 分清楚.一种观点认为,机体内存在不同的DC亚 群,它们分别负责不同的功能?J.但近来研究表明, DC亚群的功能并非一成不变,如从人的前体细胞分 化而来的DC,对不同的活化刺激物表现出不同的反 应l2J.因此,这种一类细胞对应一类免疫反应的观 念受到了挑战,并提出了另外一种观点:DC的不同 成熟状态有着不同的功能_lJ.本研究旨在探讨未成 ?本文为湖北省自然科学基金项目(No.2006ABA344)和湖北省教育 厅科学研究项口(No.2004Z001) ?华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科,武汉430022 ?郧阳医学院附属太和医院神经内科,十堰442000 作者简介:李罗清(1972年一),男,博士,副主任I篡师,硕七生导师,主要 从事神经免疫的基础与临床研究,E-Il1:l?x1s@163.CO/ll. 熟DC对T细胞活化,分化及功能的影响. 1与方法 1.1主要试剂与动物RPMI1640培养基,胎牛血 清,逆转录试剂盒,TRIZOL为美国Gibco公司产品. PCRMarker(DL一2000)购自大连宝生物公司.细胞因 子:rrlL一2,n-IL一4,rrGM—CSF均为Sigma公司产品.大 鼠IFN一了ELISA检测试剂盒为R&D公司产品.乙酰 胆碱受体(AChR)由本实验室提取.健康lewis大 鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司. 1.2DC的体外诱导,抗原负载及灭活按本实验 室已有方法培养Lewis大鼠DC_3J.收集疏松粘附于 培养板底的DC,第6天加入LPs的同时,未成熟组 和成熟组分别加入50/~g/ml的AChR或50lzg/ml的 OVA,置37?,5%的c孵箱中,用完全培养基继 续培养18小时即得AChR负载的iDC(AChR+iDC), AChR负载的mDC(AChR+mDC)和OVA负载的 mDC(OVA+mDC).充分洗涤后重悬于RPMII640 完全培养基,加入终浓度为25g/Inl的丝裂霉素C, 于37~C孵育30分钟灭活后,以RPMI1640培养液洗 涤3次,调整细胞浓度为4×lO5ml作为刺激细胞. 1.3混合淋巴细胞反应 1.3.1AChR负载的DC重复刺激T细胞尼龙毛 柱法分离Lewis大鼠脾脏T细胞.取24孔培养板, 每孔分别加入106T细胞,再加入105AChR负载的 iDC或mDC刺激,用完全培养基调整终体积为1ml. 置37oC,5%的C0'孵箱中培养.每组设4个复孔, 每个刺激循环后行细胞计数.第6天加入终浓度为 100u/ml的Ib2扩增T细胞.2周后,同前条件加 入It?AChR负载的iDC或mDC再次刺激.再次刺 激后第3天加入终浓度为100U/ml的IL一2扩增T 细胞.再次刺激l周后,同条件加入1o5AChR负载 的IDC或mDC行第3次刺激.第3次刺激后第3天 加人终浓度为100U/ml的IL-2扩增T细胞. 1.3.2淋巴细胞增殖测定取96孑L培养板,每孑L 分别加入2×lO5AChR负载的DC重复刺激前的T 细胞作反应细胞(NT);再分别加2×lo4,1×lO4,5× lO3AChR负载的iDC或mDC作刺激细胞,终体积为 200td;每浓度设3个复孑L.37%,5%CO2孵箱中培 养.4天后每孔加人5mg/r~的MrITI12Ol,继续培 养4小时.离心弃上清,每孑L加入DMSO100l,测 各孔490肿波长的光密度值(A490),结果以3孔均 值表示.同前方法,反应细胞改为AChR负载的iDC 或mDC重复刺激3次后的T细胞(iDC.3T或mDC一 3T),测定其对AChR负载的iDC或mDC的增殖活 性.同前方法,刺激细胞改为OVA负载的mDC,测 定AChR负载的iDC或mDC重复刺激3次后的T细 胞对OVA负载的mDC刺激的增殖活性. 1.4上清液中IFN.7水平的测定取AChR负载的 iDC或mDC初次刺激前后和重复刺激3次后的各组 细胞培养上清液,用0.45/zm的滤膜除去杂质后,采 用酶联免疫吸附试验(EHSA)检测IFN一7浓度. 1.5RT-PCR测定T细胞I~12p35mRNA的表达 收集AChR负载的iDC或mDC初次刺激前和重复刺 激3次后的各组T细胞,用TRIZOL试剂提取细胞总 RNA.在逆转录酶M—MLV的作用下,将mRNA逆转 录成cDNA分子.然后通过PCR扩增IL-12p35和 参照/3-aetin的eDNA.IL-12p35的上游引物为:5C— GCTACCTCCTCTYC1_I?3,下游引物为:5GC1]rrCTG- GTGCAGAGTC3,扩增产物长度为500bp.l3一actin 的上游引物为:5AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA3. 中国免疫学杂志2011年第27卷 下游引物为:5ATGCTGCTFACATGTCTCGAT3,扩增 产物长度为266bp.PCR总反应体积501.反应条 件为:94qC预变性5分钟,94?变性30秒,48?(B— actin为54c【=)退火30秒,72cc延伸45秒,共进行32 个循环,72?加强延伸7分钟.将lO扩增产物于 琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下观察并摄像. 1.6统计数据以?s表示,多个实验组间 比较采用单因素方差分析one—wayANOvN),两两比 较采用最小显着差(ISD)法.两组之间的比较采用 t检验.以=0.05为检验显着性水准. 2结果 2.1淋巴细胞增殖测定 2.1.1重复刺激AChR+mDC初次和重复刺激均 能诱导强烈的T细胞增殖,3个刺激循环后T细胞 扩增了50,80倍.而AChR十iDC初次和重复刺激 均只引起微弱的T细胞增殖(结果见表1,2). 2.1.2交叉刺激和无关抗原刺激AChR+mDC重 复刺激3个循环后的T细胞对AChR+iDC的刺激 引起较弱的增殖反应,而AChR+iDC重复刺激3个 循环后的T细胞对AChR+mDC的刺激不引起增 殖.AChR+mDC和AChR+iDC重复刺激3个循环 后的T细胞均能对无关抗原OVA负载的mDC的刺 激产生明显增殖,前者增殖反应更强(结果见表3). 2.2上清液IFN.水平的测定AChR+mDC初次 和第3次重复刺激后,其上清液中IFN.7的含量较 刺激前均明显增高.而AChR+iDC初次和第3次 重复刺激后,IFN一丫的含量与刺激前比较均无明显 差异,并显着低于AChR+mDC组(结果见表4). 2.3IL-12p35mRNA的表达5组T细胞~-actin mRNA表达恒定,无明显差异,表明该实验方法可 靠,结果具有可比性.AChR+mDC初次和第3次重 复刺激后,IL-12p35mRNA的表达水平均明显上调. 而AChR+iDC初次和第3次重复刺激后,IL-12p35 mRNA的表达与刺激前比较均无明显差异,并显着 低于AChR+mDC组(结果见图1). 表1重复刺激过程中T细胞增殖(×119mlI1) Tab.1ProliferationofTcellswhenstimulatedrepeaU~yby DCs(×lO6ml一) Note:ComparedwithAChR+mDCgroup,1)Jp<O.05,2)P<0.01 澶笠盛塾挝突状绁胞对T咀也活化及其IFN.7和lL.12表达的影响第3 表2A0IR负载的mDc和iDc初次和重复刺激T细胞增殖的能力 Tab.21r|IecapabilityofAChRpulsedDCsstimulatingTcellsthefirstorrepetitive Note:ComparedwithAChR+niDC:NTgroup,1)尸<0.01;Compared,MthAChR十 rrd)C:mDC一3—1group,2)P<0.Ol;ComparedwithAChR+iDC:NTgroup 3)P<005 表3重复刺激3循环后的T细胞对交叉刺激和无关抗原刺激的增殖能力 Tab.3ProliferationofTcellsstimulatedbyDCsfor3cycleswhenrestinmlatedcrosslyorbyin dependentantigen Note:Compa~twithAChR+nd)C:iDC一 3Tgroup,1)P(0.05;ComparedwithOVA+mDC:m1)C一 3Tgroup.2),<O.05;Compm'edwithAChR+iDC:mDC一3T group,3)P<0.Ol 表4重复刺激过程中上清液中IFN吖的含量(pg/m1) Tab?4ThecontentofIFN-7insupernatantwhenstimulatedrepeatedlybyDCs(pg/n~) 图1T细胞IL-12p35mRNA的表达 Fig.1ExpressionsofIL-12p35mRNAbyTcells Note;A.BeforestimulatedbyDC;BAfterthefitststimulatedbyAChR+ iDC;C.Afterthethirdstimulat{xlbyAChR+iDC:D.Anerthefirst stimulatedbyAChR+m1)C;E.AfterthethinlstimulatedbyAChR+ m1)C. 3讨论 DC既可以激活也可以耐受的方式提呈抗原,其 功能特征取决于其成熟状态和局部微环境.T细胞 的充分活化至少需要获得两个相关的刺激信号,一 是T细胞受体(TCR—CO3)介导的抗原特异性信号(第 一 信号),二是由B7一CD28等共刺激分子介导的抗原 非特异性信号(第二信号).缺少共刺激信号的抗原 提呈可导致克隆性T细胞无能,未成熟DC表面 MHC,共刺激分子及其它辅助分子的表达水平较低, 所以虽然它们具有很强的抗原摄取加工能力,但由 于缺少第一和/或第二信号的刺激而不能活化T细 胞,导致T细胞的无能或低反应性,从而诱导抗原特 异性耐受.未成熟DC可诱导T细胞无能并显着延 长移植物的存活时间l.抗原负载的未成熟DC可 诱导1型糖尿病耐受E.体外实验也发现,未成熟 Dc可诱导抗原特异性T细胞无能l.受者T细胞 与供者未成熟DC共同培养后,当再用供者免疫源性 DC刺激时,细胞因子的分泌明显减少且T细胞呈现 明显的低反应性E』.本研究中,AChR负载的mDC 初次和重复刺激均能诱导强烈的T细胞增殖,而 AChR负载的iDC仅在初次刺激时引起较弱的T细 胞增殖,重复刺激则明显抑制其增殖;当这些经 AChR负载的iDC重复刺激3个循环后的T细胞再 用AChR负载的mDC刺激时,也不能引起增殖;但当 用无关抗原OVA负载的mDC刺激时,则产生明显的 增殖反应.提示未成熟DC可引起T细胞无能,且这 {}瑚 种无能是抗原AChR特异性的. 免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导 的.IFN.-/主要由活化的Thl型T细胞产生,可通过 上调淋巴细胞或诱导抗原提呈细胞MHC1/类分子的 表达来促进抗原提呈和特异性免疫识别,促进巨噬 细胞Fc受体的表达并激活巨噬细胞,参与B细胞免 疫应答.IL-12主要由活化的巨噬细胞,树突状细胞 和中性粒细胞产生,可通过促进IFN一的产生而诱导 CD4ThO细胞向Thl细胞分化,在Thl反应中处于 不可或缺的地位_8j.近来研究发现,免疫系统中可 能存在一个IL-12/IL-10免疫调节环路,控制着机体 对自身免疫性疾病的易感性j.在此环路中,IL一12 促进IFN一7产生,而IFN.7一方面通过上调B细胞共 刺激分子的表达促进体液免疫;另一方面通过上调 抗原提呈细胞MHCII的表达增强其向CD4T细胞 提呈抗原的能力,诱导Thl细胞分化.同时IL-12可 通过下调IL-10等Th2细胞因子而拮抗免疫抑制细 胞的功能.未成熟DC诱导的1型糖尿病耐受与T 细胞IFN.的表达下调有关_l.体外未成熟Dc诱 导的T细胞无能与其IL-2,IL一4,IL-12,IFN一7的表达 抑制有关J.我们发现,成熟Dc初次和重复刺激均 引起IFN.7和IL-12的表达显着增强,呈典型的Thl 细胞因子分泌模式;而未成熟DC初次和重复刺激 时,IFN一和IL-12p35的表达均无明显变化.由此我 们推测,未成熟DC诱导产生抗原特异性T细胞耐受 的机制,可能与Thl型细胞因子IFN一和IL—l2的抑 制有关. 4参考文献 1FairchildPJ,WaldmanH.Dendriticcellsandprospectsfortransplantation ? 会讯? 中国免疫学杂志2011年第27卷 tolerance[J].Curro0inImmunol,2000;12(5):528.535. 2VieiraPL,deJongEC,WierengaEAeta/.DevelopmentofThl?indue— ingcapacityinmyeloiddendriticcellsrequiresenvironmentalinstruction 【JJ.JImmunol,2000;164(9):45074512. 3李罗清,孙圣刚,曹学兵eta1.早期脂多糖干预对大鼠树突状细胞 表型和功能的影响[J].免疫学杂志,2005;21(5):193.196. 4KuoYR,HuangCW,GotoSeta1.Alloantigen—pulsedhostdendriticcells induceT-cellregulationandprolongallograftsurvivalinaratmodelof hindlimballotransplantation[J].JSurgRes,2009;153(2):317.325. 5Marin—GallenS,Clemente—CasaresX,PlanasReta1.Dendriticcells pulsedwithantigen—specificapoptoticbodiespreventexperimentaltype1 diabeteslJJ,ClinExpImmunol,2010;160(2):207—214. 6XiaY,ZhangY,JiangSeta/.CD4(+)T-cellanergyinducedbylin(一) CD117(c-kit)(+)stemcell,derivedimmaturedendriticcellsloadedwith nuclearantigenderivedfromTrypanosomaequiperdum[J].Autoimmunity, 2010;43(8):664—671. 7Nouri—ShiraziM,GuinetE.DirectandindireetCROSS-toleranceofalloreac— tiveTcellsbydendriticcellsretainedintheimmaturestage[J].Trans- plantation,2002;74(7):1035.1044. 8Athie—MoralesV,SmitsHH,CantrellDAeta1.SustainedIL-12signaling isrequiredforThldevelopment[J].JImmunol,2004;172(1):61-69. 9TuohyVK.YuM.YinLeta/.ModulationoftheIL-IO/IL-12eytokine circuitbyinterferon—betainhibitsthedevelopmentofepitopespreadingand diseaseprogressioninmurineautoimmuneencephalomyelitislJj.JNeu- roimmunol,2000;l11(1.2):55—63. 10ZhangC,ZouX,LeluoGet.Preventionoftype1diabetesbyimmature dendriticcellstreatedwithallethanolextractofPaecilomyeeshepiali Chenmycelium[J].MethodsFindExpClinPharmacol,2OO8;30(6): 42l_429. [收稿2010-09.O1修回2010-11-19] (编辑张晓舟) "第六届全国中医药免疫学术研讨会"征文通知 为了促进中医药免疫学理论的研究以及免疫学理论和技术在中医药研究和临床 中的应用,活跃学术气氛,经筹备,"第六 届全国中医药免疫学术研讨会"定于2011年9月16日在辽宁沈阳召开,并给予l 类继续教育学分. 主要内容包括:免疫性疾病的中医药治疗;中药免疫药理及药效学研究;免疫学与 中医药理论;免疫学技术的进展及在中 医药研究中的应用;中药多糖与免疫(专题).论着,综述,文摘不限. 截稿日期为2011年8月30号,提倡电子邮件投稿,亦接收纸质稿件. 通讯地址:广州市机场路l2号广州中医药大学免疫研究室 邮政编码:510405联系人:周联王青 电话:020.36585479传真:020—36585094 电子邮箱:immunology@gzhtcm.edu.cn或immunology@tom.con. 中国免疫学会中医药免疫分会 2011年3月