【doc】神经干细胞移植对大鼠脊髓半切空洞损伤的修复作用

【doc】神经干细胞移植对大鼠脊髓半切空洞损伤的修复作用 神经干细胞移植对大鼠脊髓半切空洞损伤 的修复作用 中国矫形外科杂志2005年10月第13卷第20期OrthopJChin,Vo1.13,No.20October2005?l573? 神经干细胞移植对大鼠脊髓半切空洞 损伤的修复作用? 刘媛牵庭梅龙在云曾琳陈恒胜伍亚民-李应玉杨恒文廖维宏 , ' 摘要:[目的]观察神经干细胞移植后对大鼠损伤脊髓形态和功能的修复作用.[方 法]3O只Wistar大鼠,分为半切洞损伤组,D?Hanks液对照组和神经干细胞移植治疗组.4, 8周后取损伤部位脊髓组织进行HE,Nissl,Holmes银染观察神经纤维和神经细胞的再生情况.同时在伤后1,4,8 周进行伤侧下肢MEP和SEP检测,了解感觉和运动功能的恢复情况.[结果](1)治疗组4周后,分化的细胞基本 闭合空洞,形成一空腔.8周时,在损伤处可见大量星形胶质细胞,及少数长出突起,存活的神经元,而且移植物与 宿主之间在形态上形成纤维联系;(2)术后1周各组运动诱发电位和感觉诱发电位峰潜时明显延长,无显着差异性, 手术后4,8周,C组的峰潜时较A,B组明显缩短,有显着的差异性(P<0.O1).[结论]神经干细胞移植到损伤脊 髓组织后,能够存活,分化并从结构和功能上较好地修复组织缺损区域. 关键词:神经干细胞;移植;脊髓损伤;结构修复 Repairingeffectsofneuralstemcellstransplantationonthesemi—cutcavityofspinalcordinrats/ffLIUYuan,LI Ting—mei,LONGZai— yun,eta1.The3DepartmentofSurgicalResearchInstitute,TheAffiliatedDapingHospital,the3rd MilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042 Abstract:[objective]Toobservethemorphological,andfi.,nctionalrepairingeffectsofNSCT(neuralstemcellstransplan? tation)onSCI(spinalcordinjury)inrats.[Method]ThirtyWistarratsweredividedintothreegroupsrandomly:semi—cutcav? ityinjuredgroup(groupA),D— Hankscontrolledgroup(groupB)andNSCTgroup(groupC).AlltheSCItissuesindifferent groupswerestainedwithHE,Nissltoobservetheregenerationeffectsofneuralfibresandcellsat4and8weeksafterinjury. MEP(motorevokedpotentia1)andSEP(somatosensoryevokedpotentia1)oflowerlimbwereexaminedtolearntherehabilitation ofsensoryandmotorfunctionat1,4and8weeksafterinjury.[Result]1.Thecavitywasbasicallyclosedbydifferentiatedcells. At8weekafterinjury,thereweremuchastrocytesandsomesurvivingneuronswithdendrites,whichformedfibrouscontactbe. tweengraftsandthehostsinmorphology;2.Thepeakoflatenciesbecamemuchlongerthanbefore,whichshowednodifferences betweenallgroupsat1weekafterinjury.ThepeakoflatencyingroupCwasmuchshorterthanthoseingroupAandBat4and 8weekswithsignificantdifferences(P<0.O1).[Conclusion]Theneuralstemcellstransplantedintotheinjuredspinalcord cansurvive,differentiateandrepairtheinjuredareaintermsofstructureandfunction. Keywords:Neuralstemcell;Transplantation;Spinalcordinjury;Structura;repairing 组织移植治疗脊髓损伤的研究已开展多年,但神经干细 胞为组织移植的供体研究已成为新的研究热点.目前,国内 正处于起步阶段,探讨了神经干细胞移植对脊髓半侧横断和 AllenS打击损伤的修复作用.对于将神经干细胞移植治疗脊 髓空洞模型,尚未见报道.由于空洞损伤后,组织缺损明 ?本课受国家自然科学基金(编号:30171068)和重庆市院士基金 资助(号:7671) 作者单位:第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室,创伤,烧伤 与复合伤国家重点实验室,重庆市大坪长江支路1O号 400042 +成都市铁路局中心医院神经内科 通讯作者:伍亚民,电话:(023)68757433 显,光镜下可明确区分移植物与宿主,更有利于观察移植物 的生长情况.因此,本实验运用神经干细胞移植治疗脊髓空 洞损伤,观察其移植后在宿主脊髓组织内的存活,分化以及 受损组织的结构形态变化,并进一步检测神经干细胞移植后 对大鼠下肢功能的恢复情况,从形态学和功能学两方面评价 神经干细胞移植对脊髓损伤的修复作用. 1材料与 1.1动物分组 Wistar成年大鼠,体重220,250g左右,雌雄不拘.每 时相点5只动物,共3O只大鼠.采用大鼠脊髓半切空洞损 伤,随机将动物分为A组:脊髓腰膨大左侧半切空洞损伤 组;B组:在伤后于空洞处注射lOlD.Hanks液;C组:伤 后在空洞处移植lO含5×10个神经干细胞的D.Hanks悬 574I骄外科杂志2(X)5IO第13卷筚20期I)rIh.一pJCI]b1.Vol13,_l20Oclo~r2005 液手术后4.8周通过色.T'镜观察移植物损伤 脊髓巾的形怠学变化 I2手术方法 选取体蘑230—250g的\t.,istar鼠.用1%戊巴比妥钠 腹腔麻醉(4Om)腰背挪脱t将丘lJ物固定:脑市悼定 位仪上常规消毒.尢晡条fI卜下【开—L.处并哪除T. r,【椎板,暴露雌彬大.盯片横H驶璃针捣毁并暇出 腰膨大左侧半脊髓.形战一约2l11nIx212111~×2ITllll大小的空 洞.进行神并干细胞}善键LI后.?]194)线缝台硬脊膜.还层 缝合肌肉,皮肤)HIL注青霉崇1-靼传lid×3?1 I3标丰制备受病理架邑 1.3I灌沱,取柑手术4,8硎麻夫鼠后将其同定 于解剖板上.蝴fl脚牟心窀捕管,翦开左心耳快速灌 ^理盐水I50—2("ml,待娩出体清亮后,灌注4多聚 甲醛约2c)0nJ渣砖啦取出临鼎忙及其头昆删各 3个节段的脊髓胜^4听聚『I醉开定6h.置305;,蔗 储溶液-浸泡.直至组婪!块札至瓶 I.3.2}JJ片取…韵凡伴经修髓脱水,透明挂蜡千l=l 蜡包埋后进衍5n…m卮垃片.轩规进行liE isslHolmf.s银 I4庸发电位精盘 将受榆il!I的Wist~舣.f订l巴r匕妥钠腹腔肺醉. 头颅后,左幢部剪毛.消毒皮肤,切开头领后部皮肤, 剥离骨膜.用汗科钻在右侧皮层中央后【_=il感觉区相对应的冠 状缝后3mffI_矢状缝旁IITIm处钻一盲孔(注意避免打穿硬 脑膜.肌损伤皮层)井暴露左腿坐骨神经..应用F'owerLab/ 16SP诱发I乜位他刺激参数:频率4Hz.被宽O2,强度 4.5mA信号经前置放太器敢凡1()万倍.计算机平均256 改录感觉诱发电位(5,El'和运动诱1发电位(MEP)波 形曲线.it算波峰n々峰潜时.谴删SEP时.刺激电楹位于坐 骨神经.电板置于皮屡.彘般置于头皮下参考电极插于 推旁肌垃删MEI'时,刺激[乜擞与已录电极交换参号电扳 值十硬腭下纽间比较采用t箍验,结果?.并用sI软 件进行统计学 2结果 2.1病理染色结粜 移植4周后染色术见明n0炎症反应.移植物分化的细 胞耩本闭台空洞.形成一空髓.细胞形志类似胶质细胞.在 空腔内叮少吐形志较小的散在细胞;8周时染色发现:在 损伤处nf大量形志同的细胞.经病理染色从形态观察 到:决大郫斗为里形脞质如I胞.m可见K出突起,存活的神 经元.同?lf嗜银染发现移植物与宿毛之间在形态L形成纤维 联系.对照组仍为一夺c1—5l 图l脊髓半切涧损伤模型{14E:x40图2扭 伤后4周脊髓横切发现移植物能闭台空洞一银x20I 图3移植8周后移植物与宿主可互相发出纤维.形 成联系{银染x400}T:砖植『托It:宿兰围4移 植8周分化的细胞胞浆丰富,有多个突起.形成与正 常神经元无明显差别,lxclfj-图5移植8周 后存活的细胞与宿主相接-,l12(KiI 中国矫形外科杂志2005年10月第13卷第20期 OrthopJChin,~o1.13,No.20October2005?1575? 2.2SEP和MEP检测结果 手术后1d,A,B,C组大鼠都表现为左下肢瘫痪,术 后1周各组运动诱发电位(MEP以Pl波的峰潜时计算)和 感觉诱发电位(SEP以Nl波的峰潜时计算)峰潜时无显着 差异性,手术后4周,8周,c组的峰潜时较A,B组明显缩 短,有显着的差异性(P<0.01).检验方法同前,见表,图 1,2所示. 表1脊髓损伤后不同时间各组MEP的变化 P<O.O1P<0.05.VSgroupA;#tP<0.01#P<0.05,VSgroup B 表2脊髓损伤后不同时间各组SEP的变化 P<0.O1P<0.05,VSgroupA;革}}P<0.O1#P<0.05,vsgroup B +^组+B组一.Ik—c组(-B)+^组+B组一一c组 】用4周B周时间 图1大鼠脊髓损伤后不同时间MEP变化 图2大鼠脊髓损伤后不同时间SEP变化 3讨论 传统观念认为,中枢神经系统是终末分化组织,神经元死 ,随着神经干细胞研究的深入,发现 亡后不能再生.但近年来 成体神经组织内仍然存在少量具有分裂增殖潜能的神经干细 胞,对神经系统的损伤具有修复的潜能.尽管在中枢神经 系统损伤后,可见部分受损神经元的突触发芽以及再髓鞘化, 但其增生能力十分有限,不能满足功能恢复的需要.人们期 望通过移植的方法对神经系统的急,慢性损伤进行有效的治 疗.然而,对神经干细胞移植到损伤部位,特别是不同损伤模 型的情况下,其存活,分化的情况尚无详细地报道,对其修复 损伤的过程仅有少量报道. 本研究通过将神经干细胞移植到脊髓空洞模型后4周发 现,移植的细胞能够存活,形成类似脊髓外膜的结构,封闭开 放的脊髓空洞.同时在空洞内还弥散分布移植后分化的细 胞,形态上类似星形胶质细胞和神经元,通过Nissl,HE,和 Holmes银染发现:移植组的神经干细胞能从结构上较好的填 补空洞,而对照组和单纯损伤组的损伤部位仍然是较大的空 腔并出现空洞化的改变(如模型所示).其中移植的神经干细 胞能发生分化:90%的细胞分化为星形胶质细胞,但仍可见存 活达8周之久的少量神经元,其胞体形态清晰,可见多个细,长 的突起,一方面,可能是由于在损伤情况下,机体的反应以修 复组织缺损为主,因此胶质细胞的反应更为活跃.另一方面, 可能是由于在损伤组织中,含有大量,复杂的血清成分,各种 细胞因子及炎性物质,对神经干细胞的定向分化产生综合影 响的结果.进一步通过银染观察到:移植物中分化的细胞能 长出神经纤维与宿主相连,并且宿主也发出纤维深入到移植 物中.作者认为神经干细胞移植到脊髓空洞区域后,移植物 能够存活并且能在损伤的微环境下发生分化,其中分化的神 经元存活时间较长,提示可能对脊髓功能的恢复起一定作 用,. 对脊髓损伤治疗效果进行评价,除了形态学的观察外,最 常用,经典的指标是电生理功能检测.脊髓损伤后,由于感觉 和运动传导通路受损,通常会发生SEP和MEP峰潜时的改 变.本实验中观察到:在脊髓半切空洞损伤后,即刻所有动 物的SEP和MEP波幅都明显减低甚至消失.术后1周,单纯 损伤组和对照组SEP,MEP基本没有变化,NSC移植组也无明 显变化;4周后,各组都有所恢复,但移植组恢复最明显;8周时 移植组SEP和MEP已接近正常,但损伤组和对照组SEP和 MEP的峰潜时仍较正常明显延长.相关研究发现:移植的组 织或细胞主要通过直接生长越过损伤部位或在脊髓损伤处形 成中继站而恢复脊髓的功能..作者通过病理染色观察到: 移植物发出的纤维部分地连接两侧断端,重建纤维联系.同 时移植物中分化的神经元可能形成新的突触联系以及分化的 胶质细胞分泌各种神经营养因子,与少突胶质细胞分泌的抑 制因子相互作用后,其改变后的微环境可能更有利于神经元 的修复,从而挽救频死的神经元,保持神经回路的营养作用, 与靶组织重建突触联系,促进运动功能的恢复.因此,神经干 细胞移植治疗可从结构和功能上较好地修复脊髓半切空洞损 伤. 参考文献: [1]NakamumM,ToyamaY.Transplantationofneuralstemcellsinto即j一 ? ?1576?中国矫形外科杂志2005年10月第13卷第20期 OrthopJChin,Vo1.13,No.20October2005 halcord"afterinjury[J].NipponRinsho,2003,61(3):463—468. 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(收稿:2005-05—14) 截瘫患者的褥疮治疗 林世德焦守凤刘鑫孟庆溪赵廷宝 褥疮是截瘫病人最常见的并发症之一:它多发生于无肌 肉包裹或肌肉层较薄,缺乏脂肪组织保护又经常受压的骨隆 突处,如枕部,棘突隆起处,骶尾部,膝关节内外侧,内外 踝,足跟部等处,其中以骶骨,大转子及坐骨最为常见.本 科治疗的截瘫患者,大多数来院时已经出现骶尾部等处褥疮, 有的甚至深达骨骼.从2004年3月至今,作者对32例截瘫 患者的骶部褥疮进行了综合治疗,效果良好,总结如下. 1临床与方法 1.1一般资料 本组32例,男25例,女7例;年龄24—55岁,平均年 龄38岁;疮面最大18cm×8cm,最小3cmx2om,平均6.6 omx4.6cm;按中国中医偏瘫网褥疮分度:I.3例,?.21 例,?.7例,IV.1例并有感染. 1.2治疗方法 1.2.1定时翻身,去除疮面坏死组织. 1.2.2传统方法敷贴新鲜鸡蛋膜+云南白药+硫酸庆大霉 素涂抹等. 1.2.3重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF,商品名"金因 肽",深圳市华生元基因工程发展有限公司研制),每日约 2001U喷疮面1次,30,60min后给予持续灯烤,保持疮面干 燥,夜间用油纱贴住疮面后无菌纱布覆盖保护. 1.2.4加强营养,防止低蛋白血症. 1.2.5对疮面大而深的,行皮瓣转移术治疗. 2结果 经过上述处理后,所有患者疮面均愈合良好,具体详见 下表. 3讨论 rhEGF治疗褥疮可能通过以下途径起作用:(1)趋化作用: 作者单位:济南军区总医院脊髓修复科,济南250031 促进上皮细胞(表皮细胞,粘膜细胞,内皮细胞),中性粒细胞, 成纤维细胞等多种细胞向创面迁移,提供组织再生与修复的基 础,缩短创面愈合时间;(2)增殖作用:?作用于细胞生长调节 基因,促进RNA及DNA的复制和蛋白质的合成;?调节细胞 糖酵解及ca浓度;?促进创面细胞再上皮化,加速创面愈合速 度;(3)重建作用:?促进胞外基质(透明质酸,纤维连接蛋白, 胶原蛋白,糖蛋白和羟脯氨酸等)合成;?诃节胶原的降解及更 新,增强创面抗张强度;?提高上皮细胞的完全再生度和连续 性,预防和减少疤痕形成,提高创面修复质量. 持续灯烤保持创面干燥,不仅可以预防感染.而且其热 效应可引起局部皮温升高,血管活性物质释放.并刺激皮肤 内热感受器,通过丘脑反射.使血管平滑肌松弛,血管扩张, 血液循环加快.促进疮面愈合. 夜间油纱敷贴疮面不仅可以缓冲平卧时疮面受压,摩擦, 而且可以引流渗出液,防止疮面与纱布的粘连,防止疮面反 复破坏. 云南白药虽有去腐生肌的作用,可去除疮面坏死组织. 使其保持新鲜,干燥.但在促进表皮细胞生长方面仍不如意. 敷贴新鲜鸡蛋膜虽然有渗透及为表皮细胞生长提供支架的作 用,但对疮面较深的?一?.褥疮则效果欠佳,而且经局部灯 烤后容易变形,破裂,失去渗透作用,故不适用于长期卧床 的截瘫患者. (收稿:2005-05.14)