【doc】 大鼠血浆和脑脊液中甲氨蝶呤浓度测定及其应用

【doc】 大鼠血浆和脑脊液中甲氨蝶呤浓度测定及其应用 大鼠血浆和脑脊液中甲氨蝶呤浓度测定及 其应用 中国临床药学杂志 CHINESEJOURNALOFCLINICALPHARMACY2005年第l4卷第l期?23? 大鼠血浆和脑脊液中甲氨蝶呤浓度测定及其应用 高科攀,王峰,蒋新国,陆国椿(复旦大学药学院药剂学教研室,上海200032;复旦大学附属肘瘤 医院药剂科,上海200032) 【摘要】目的建立测定大鼠血浆和脑脊液中甲氨蝶呤(MTX)浓度的HPLC法,为脑内靶向制剂及其在动物体内药动学研究 提供学.方法采用高效液相色谱一紫外检测法,用c.8键合硅胶柱,流动相为甲醇一005mo1?L一-醋酸铵缓冲液(23:77, pH=6),检测波长313[1iD..血浆样品沉淀蛋白后取上清液进样脑脊液样品离心后直接进样.本法应用于MTX纳术粒给药后 大鼠血浆,脑脊液中药物浓度测定.结果该法专属性好,最低检测浓度为16g?I,,血浆和脑脊液样品检测线性,精密度 回收率等指标均符合生物样品分析,在应用中取得良好效果.结论本法可用于测定大鼠血浆和脑脊液中MTX的浓度 【关键词】甲氨蝶呤;高效液相色谱法;脑脊液浓度 【中图分类号】R979.1;R945【文献标识码】A【文章编号】 1007.44o6(2oo5)ol一0023.04 Determinationofmethotrexateconcentrationinrats’plasmaandcerebrospinalflu- idandtheapplication GaoKepan,WangFeng,JiangXinguo,LuGuochun University,Shanghai200032,China;Department 200032,China) (DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy. ,Fudan ofPharmacy,TumorHospital,FudanUniversity,Shanghai 【ABSTRACT】 AIMToestablishanHPLCmethodfordeterminationofmethotrexateconcentrationinrats’DlasIna andcerebrospinalfluid.METHODSThereversedphase—HPLCWasperfor medinaCl8column.Themobilepha~ewas amixtureofmethanoland0.05tool’LNH4Acbufierattheratioof23:77(/V)withthepH=6.0.TheWavelength ofultravioletdetectionWas313nm.ThesupematantofplasmasampleWasinjectedtotheHPLCsystemafterproteinpre— cipitation,whilethecerebrospinalfluidsampleWasdirectlyinjected.ThismethodWasthenappliedtodeterminedrag levelinrats’plasmaandcerebrospinalfluidfollowingintravenousadministra tionofmethotrexate—loadednarloparticles. RESULTSThespecificity,linearity,precisionandrecoveryofthismethodwe reallgoodenoughforbiologicalsample analysis.Itslimitationofdetectionwas16ttg?L一.CONCLUSIONThismethodisconvenientandaccurateaaJ1di3 suitablefordeterminationofmethotrexateconcentrationbothinrats’plasma andcerebrospinalfluid 【KEYWORDS】 methotrexate;reversedphase—HPLC;cerebrospinalfluid 甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是一种叶酸拮抗 药,可用于急性白血病和中枢神经系统肿瘤的治疗. MTX不易透过血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB), 影响了其对脑内肿瘤的疗效.临床上常采用鞘内注 射大剂量MTX的治疗以弥补上述缺陷,但手术 要求高,危险性大,患者顺应性差.近年来,脑内靶 向给药研究日益受到关注,各种新的给药途径和药 物剂型层出不穷.为了正确评价药物的脑靶向性. 建立准确简便的测定MTX在动物血浆和脑脊液样 品中的浓度十分关键.文献报道的MTX生物样品 上海市科技发展基金项目(0243nm067) 【作者简介】高科攀(1979一),男,硕士研究生.从事载药纳米粒脑内 递药研究. 【通讯作者】陆国椿,Tel:86.21.64175590-3323 ? 24?中国临床药学杂志 CHINESEJOURNALOFCLINICALPHARMACY2005年第l4卷第1期 分析方法有多种,如酶一多点免疫测定技术,放射免 疫分析,微生物法,HPLC.紫外和荧光法等_】.j,但 禾见测定动物脑脊液中MTX的分析方法.我们报 道了相关HPLC测定方法,能用于MTX脑内靶向制 剂的临床前评价. I 1.1仪器LC一10ATVP型高效液相色谱仪(日本岛 津),HS2000色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有 限公司),TGL16C型台式高速离心机(上海安亭科学 仪器厂),MettlerAE200电子天平(梅特勒一托利多 仪器有限公司),旋涡混合器(原上海医科大学仪器 ),SimpliLab超纯水净化器(Millipore公司). 1.2试剂MTX原料药(浙江万马药业,批号 20010101),MTX注射剂(上海华联制药集团,批号 010908B),甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所),乌 拉坦,高氯酸,氯化钠,氯化钾,氯化镁,氯化钙,醋酸 铵,冰醋酸等均为市售分析纯试剂. 1.3动物sD大鼠,舍,体重250,350g(复旦大学 实验动物科学部). 2方法 2.1溶液配制MTX原料5mg,加入0.2mol?L 旧Na!CO适量溶解,用重蒸水稀释成5mL,配制成 lg?L的对照品储备液.将该液定量稀释成一系 列MTx标准储备液. 2.2血浆和脑脊液样品预处理血浆样品:取血浆 80L,加入同体积的10%HC104沉淀血浆蛋白,旋涡 混合器强烈振荡2rnjn,8000r?min高速离心l0 rain,取上清液进样.脑脊液或人工脑脊液样品,直接 10000r?min离心10rain,取上清液进样. 2.3色谱条件DikmaDiamonsilC】8柱(200n’llnX4.6 n’lln,5pm);流动相:甲醇一0.05mol?L醋酸铵缓冲液 f23:77,用醋酸调pH=6.0);流速1.0mL?min,;检测 波长313Ilm;柱温45?. 2.4方法学验证 2.4.1专属性采用上述样品预处理方法和色谱条 件.分别考察空白血浆和脑脊液样品,MTX标准生物样 品以及试验样品,绘制色谱图. 2.4.2线性关系空白血浆,准确加入一系列MTX标 准储备液,配成0.1,0.3,0.6,1.0,30,6.0mg?L6种浓 度的标准血样,每个浓度配制3份样品,按2.2方法操 作.上述色谱条f牛下测定药物浓度,以峰面积(A)对相 应浓度(c)线性同归. 将MTX标准储备液用人工脑脊液(配制方法参 照文献[4],其主要成分为NaC112.6mmol’L,,CaC12 0.8mmol?L,,Ml21.1mmol?L,,KC12.4mmol’ L,,Glucose5.89mmol?L,,NaHCO327mmol?L,, Na2S040.5mmol?L,,KH2PO40.5mmol?L)准确稀释 成0.05,0.10,0.20,0.50,1.0o,2.O0nag?L,.高速离心 后直接进样,HPLC分析,建立线性方程. 2.4.3方法回收率在各自的标准曲线范围内,配 制高,中,低3个浓度水平的血浆(5.0,1.0,0.2mg? L)和脑脊液(2.0,0.5,0.1mg-I)样品,预处理 后进行HPLC测定,由标准曲线求算测定浓度,与理 论配制浓度比较,计算方法回收率. 2.4.4精密度在各自的标准曲线范围内,配制高 中低3个浓度水平的血浆和脑脊液样品,每个浓度 配制5份,ld内将样品预处理后进行HPLC测定, 求算测定数据的平均值和标准差,计算RSD,即为口 内精密度.以同样的方法在1wk问隔的5d内测定 高中低3个浓度,每个浓度5份样品,求算平均值, 再计算日间RSD,即为日间精密度. 3结果 3.1方法专属性药物色谱分离良好,在血浆,脑 脊液中均无杂质峰干扰.空白血浆,脑脊液以及含 MTX样品的色谱图见图l. 图1甲氨蝶呤色谱图 lI…’.-J? Fig1Chromatogramsofmethotrexate A:blankplasma;B:plasmaspikedwitbnletbotrexat~;C:plasmac【jn— tainingmethotrexate;D:blankcerebraospihalfluid:E:cerebrospinal fluidspikedwithmethotrcxate;F:ccrebro~,pinallhddcontaining methotrexate. A, L O 8 6 4 2 中国临床药学杂志 CHINESEJOURNALOFCLINICALPHARMACY2005年第l4卷第1 期?25? 3.2线性,检测限,最低检测浓度血浆样品线性 方程为:A=384.3+61644.7C(r=0.9997),药物 浓度在0.1,6.0mg?L范围内呈良好线性关系. 脑脊液样品线性方程为:A=39.7+119172.1C (r=0.9999),药物浓度在0.05,2mg?L浓度 范围内呈良好线性关系.r=2时的最低检测限为 0.8ng,最低检测浓度为16/.tg?L,. 3.3血浆和脑脊液样品方法回收率和日内,日间精 密度血浆样品的高,中,低3个浓度水平的回收率 在95%,99%范围内(表1),脑脊液样品3个浓度 水平的回收率在96%,100%范围内,均符合生物 样品分析要求. 血浆,脑脊液样品中高,中,低3个浓度的MTX 测定日内,日间精密度RSD均<5%(表1),符合生 物样品分析要求. 表1血浆,脑脊液样品方法回收率,日内,日间精密度 Tab1Methodologicalrecovery,within-dayandbetween-dayprecisionofmet hotrexatedeterminationinplasmaandcerebrospinal nllid 4应用 聚氰基丙烯酸正丁酯(polybutylcyanoacrylate, PBCA)纳米粒可望促进药物透过BBB.本研究采用 乳化聚合法L5j制备了MTXPBCA纳米粒,所得纳米 粒乳液对光产生明显的丁达尔现象,经光散射测定 粒径为140nm左右,可确定纳米粒已形成.对3只 大鼠尾静脉注射MTX纳米粒1.6mg?kg后. 于0.25,0.5,l,2,3,4h采集血浆进行测定.由于血浆 样品尤其是最初几个取血点中有可能含有未降解的 纳米粒,用蛋白沉淀法处理可能将载药纳米粒一起 图2静注MTX纳米粒(1.6mg?kg)后血浆平均药一时曲 线 Fig2Average#asmaconcentrationofmethotrexateversus timeafteriv.1.6mg?kgmethotrexateloaded nanoparticles 沉淀,故处理样品时先按血浆体积的0.5倍加入二 甲亚砜(DMSO),旋涡lmin溶解PBCA,使MTX释 放,再加入与血浆等体积的l0%HC1O4,旋涡2min 沉淀蛋白.测定浓度按血浆稀释倍数折算.实验证 明按上述方法处理,加入DMSO不影响方法回收率. 对测定也无干扰,纳米粒能完全破坏且蛋白沉淀效 果良好.同时对3只大鼠尾静脉注射MTX纳米粒 3.2mg?kg后,于0.5,l,1.5,2,2.5,3,4h采集脑脊 液.由于直接进样,不存在纳米粒沉淀问题.结果 见图2,3. 图3静注MTX纳米粒(3.2mg?k窖)后脑脊液平均药一 时曲线 Fig3Averagecerebrospinalfluidconcentrationofmethotrex- ateversustimeafteriv.3.2nag?kg一methotrexate loadednanopar~cles ? 26?中国临床药学杂志 CHINESEJOURNALOFCLINICALPHARMACY2005年第l4卷第1期 5讨论 本研究针对临床前动物实验的特点,建立了快 速,准确的大鼠血浆,脑脊液中MTXHPLC测定方 法.已有文献[3]报道了人脑脊液中MTX测定方 法,但考虑到大鼠脑脊液量很少,无法获得足够量的 空白脑脊液供方法评价使用,故本研究采用人工脑 脊液作替代.从空白大鼠脑脊液和人工脑脊液色谱 图来看,两者十分相似,表明该替代可行.本研究为 小动物脑脊液中药物浓度测定方法的建立提供了较 好的替代途径. MTX不溶于甲醇,在乙腈中紫外吸收下降,所 以甲醇,乙腈都不宜用作蛋白沉淀剂,用三氯乙酸则 血浆杂质峰较多,用高氯酸处理.沉淀效果最佳,血 浆样品中无杂质峰干扰. 流动相中的醇一水比例及柱温对MTX的保留 时间影响都很大,经试验,选择本组中的两相比 例及柱温,MTX与血浆及脑组织杂质峰的分离 很好,MTX的保留时间较短,加快了样品分析速 度. 由于纳米粒在静脉注射后一段时间内无法完全 降解,在用蛋白沉淀法处理血浆样品之前应先将纳 米粒破坏再加入沉淀剂,否则载药纳米粒将随血浆 蛋白一起沉淀,测定的药物浓度低于实际浓度. 【参考文献】 [1]McCruddenEA,TettSE.Improvedhigh—performanceliquidchromatog— raphydeterminationofmethot~xateanditsmajormetaboliteinplasma usingapoly(styrene—divinylbenzene)column[J]JChromatogrB BiomedSciAppl,1999,721(1):87. [2]WangF,JiangXG,LuW.ProfilesofmethotrexateinbloodandCSF followingintranasalandintravenousadministrationtorats[J].IntJ Pharm,2003,263(1):1. [3]吴闯,林贵业.反相高效液相色谱测定J缸浆和脑脊液中甲氨蝶呤 浓度[J].中国医院药学杂志,1999,19(5):272. [4]ChouKJ,DonovanMD.Distributi0n0fantihistaminesintotheCSFfol— lowingintratmsaldelivery[J].BiopharmDrugDispos,1997,I8(4): 335. [5]GulyaevAE,GelperinaSE,SkindIN,eta1.Significanttransportof doxorubieinintothebrainwithpolysorbate-80一coatednanoparticles[J] PharmRes,1999,16(10):1564. (2003.12.26收稿) HPLC-MS法测定人血浆中阿奇霉素浓度及其药动学 兰红梅’,丁黎,简龙海,黄鑫,沈建平,张银娣.(中国药科大学药物分析教研室,南京210009;南 京医科大学第一附属医院国家药品临床研究基地,南京210029) 【摘要】目的建~_Afill浆中阿奇霉素的HPLC.Ms测定法,用其测定了志愿者121服阿奇霉素片剂(500mg)后的血药浓度,并 对受试制剂与参比制剂的生物等效性进行评价.方法血浆样品经直接沉淀酸化后进行HPLC.Ms分析.20名健康志愿者交 叉口服受试制剂或参比制剂500mg.计算主要药动学参数及相对生物利用度,以判断生物等效性.结果在1.0,l627.2g.L 范围内阿奇霉素峰面积与内标峰面积的比值与阿奇霉素的浓度之间呈良好线性关系,最低定量限为1. 0g.Lt.受试制剂和 参比制剂的Tt/2分别为(38.5?3.8),(39.0?4.5)h,tma分别为(2.5?1.0),(2.6?0.9)h,c…分别为(518.8?239.9),(513.6? 231.9)gg’L,.以Aul44计算的受试片剂的相对生物利用度为(99.7?12.6)%.两制剂的药动学主要参数无显着性差异. 结论2种制剂具有生物等效性. 【关键词】阿奇霉素;HPLC.MS;生物等效性 【中图分类号】R978.15;R969.1【文献标识码】A【文章编号】1007—4406(2005)01.0026.04 【作者简介】兰红梅(1976一l,女.在读硕士研究生.从事体内药物分析研究 I通讯作者】丁 黎.Tel:(025)83271289,Fax:(025)83271289:E-mall:dingLidl@hotmai1.G OB