香菇多糖提取作业

香菇多糖提取作业 香菇多糖提取 提取法: 用物理提取的方法生产精细化学品，即通过将某一种物质按一定的要求从混合物中提取出来从而获得产品的方法。 张杨杨 精化1122 1、认识香菇多糖 (1) 香菇多糖结构式 分子式:〔 C42H72O36 〕n 分子量:〔1152.9995〕n (2) 香菇多糖性质 香菇多糖(lentinan;LNT)是从香菇中分离纯化的一种葡聚糖，是以增强T细胞和巨噬细胞功能为主的免疫增强剂。 密度:1.88g/cm3;沸点:1472? at 760 mmHg。 溶于碱溶液或甲酸，微溶于热水或二甲亚砜，不溶于冷水、醇、乙醚、氯仿、吡啶或六甲基磷酰胺。对硫酸和盐酸稳定。 (3) 香菇多糖的功能 香菇多糖具有激活细胞免疫、调节多种体液免疫因子、诱导α-干扰素生成，调节机体免疫应答反应，诱导白细胞对肿瘤浸润，导致肿瘤部位血管扩张、出血、坏死，阻止病毒与宿主细胞的结合，提高SOD〔超氧化物 歧化酶〕活性，抑制MDA〔丙二醛 〕生成，抗脂质氧化，降低胆固醇，调节糖代谢、改善糖耐量、扩张胃肠道产生饱腹感而减轻食欲，降低血糖等功能。 【丙二醛 】 英文名:Malondialdehyde;malonic dialdehyde;Propanedial 简称:MDA 分子式OHC-CH2-CHO 分子量72.0634 无色针状晶体，熔点 72,74?，一般含两个结晶水，60?下真空干燥可得无水物，易潮解，纯的丙二醛在中性条件下稳定，但在酸性条件下不稳定。 由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而得，可在高真空下升华精制，主要用于医药中间体、感光色素的原料。与蛋白质不相容，有潜在的致癌性。 【超氧化物歧化酶】 英文名:Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白。 简称:SOD。 SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。 (4) 香菇多糖的应用 ?、香菇多糖在医药领域的应用 香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、肺癌等方面具有良好疗效。作为免疫辅助药物，香菇多糖主要用来抑制肿瘤的发生、发展与转移，提高肿瘤对 化疗药物的敏感性，改善患者的身体状况，延长其寿命。 香菇多糖与化疗剂联合使用，有减毒、增效的作用。化疗药物杀伤肿瘤细胞的选择性较差，对正常细胞也具有杀伤作用，产生毒副作用，造成化疗不能按期按量进行;由于化疗的剂量不足，常引起肿瘤细胞的耐药性，成为难治性癌症，影响疗效。化疗过程中服用香菇多糖，可以增强化疗的疗效，并减轻化疗的毒性作用;同时，化疗过程中患者的白细胞下降的发生率、胃肠毒性、肝功能损害及呕吐的发生明显降低。这充分说明了香菇多糖与化疗并用可以增效、减毒，并增强患者机体的免疫功能。 香菇多糖配合其他药物治疗慢性乙型肝炎，可提高乙肝病毒标志物的转阴作用，减少抗病毒药物的副作用。此外，香菇多糖可用于治疗结核杆菌感染。 ?、香菇多糖在保健食品领域的应用 香菇多糖是一种特殊的生物活性物质，是一种生物反应增强剂和调节剂，它能增强体液免疫和细胞免疫功能。香菇多糖的抗病毒作用机制可能在于其提 高感染细胞免疫力，增强细胞膜的稳定性，抑制细胞病变，促进细胞修复等功能。同时，香菇多糖还具有抗逆转录病毒活性。因此，香菇多糖是一种有待开发的抗流感的保健食品。 (5) 香菇多糖的质量 主要活性成分:香菇[Lentinus edodes(Berk)sing]子实体提取、精制的多糖。按干燥品计算，含香菇多糖应不得少于92.0%。 性状:类白色或浅黄色粉末;无味，有引湿性。在水、甲醇、乙醇或 丙酮中几乎不溶;在0.5mol/L氢氧化钠中溶解。 比旋度:取本品，臵五氧化二磷干燥器中，减压干燥至恒重，精密称取适量，加0.5mol/L氢氧化钠溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定(中国药典)，范围在+2,+15之间。 【比旋度】一种物理性质。 用光照射尼科尔棱镜，光波只能从一个平面振动通过。通过后的光叫作平面偏振光，当平面偏振光通过长1dm且每1ml含旋光物质1g的溶液，在一定的波长和温度下的旋光度称为比旋度。 【引湿性】药物的一种性质。 大多数药品在湿度较高的情况下,能吸收空气中的水蒸气而引湿,其结果使药品稀释,潮解,变形,发霉等现象，叫做引湿性。 也指在一定温度及湿度条件下物质吸收水分能力或程度的特性。 液体物质也具有引湿性。 2、追根溯源 (1) 诞生与发展过程 1968年GoroChihara首先从香菇子实体中浸提出6种香菇多糖,并证明其中一种具有明显的抗肿 瘤作用,定名为Lentinan 1970 年Chihard 和Sasaki 用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到另外4 种多糖。 1986年获日本厚生省批准生产并外销。 1988年我国卫生部批准进口，现今我国已有几家国产LNT上市(如南京振中和福州梅峰等)。香菇多糖由于是单一组分，质量易于控制，且具有 疗效高，剂量低，毒副作用小等优点，受到医生的青睐。 自此,世界各地掀起了一股从大型真菌中寻找抗肿瘤药物的热潮。有关香菇多糖的研究尤其活跃,包括提取工艺及分离纯 化研究,香菇多糖理化性质及药用价值研究 。但对多糖理化性质、结构、药效、药理等方面仍无定论,仍须继续深入研究。 (2) 各种生产方法比较 主要的多糖提取方法有如下几种: 热水浸提法、 酸(碱)浸提法、 微波提取法、超声波提取法、复合酶解法等等。 ? 香菇多糖提取的工艺流程的对比 多糖提取的常规工艺 原料预处理?水(或酸)浸提?浸提物?真空浓缩?浓缩液?酒精沉淀?沉淀物?sevage法脱蛋白?水相?丙酮洗涤?多糖粗制品 采用复合酶解工艺 原料预处理?复合酶解?酶解液?真空浓缩?浓缩液?酒精沉淀?沉淀物?丙酮洗涤?多糖粗制品 复合酶解、 酸处理结合热水浸提法提取香菇多糖的改进工艺 原料预处理?复合酶解?酶解液?水浸提?酸浸提?浸提物?空浓缩?浓缩液?酒精沉淀?沉淀物?sevage法脱蛋白?水相?丙酮洗涤?多糖粗制品 ? 操作要点的对比 热水浸提法 向香菇处理物中加入 20倍体积的蒸馏水,并在 40? 水浴恒温下浸泡 4h。放臵冰箱冷冻柜中冷冻过夜。将香菇浸泡液从冰箱中取出, 解冻后在恒温水浴箱内分别抽提 30min、 60min、90min ,用4层纱布过滤后收集滤液。向滤渣中加入20倍体积的蒸馏水再抽提一次, 沸煮时间同上用 4层纱布过滤后收集滤液,合并两次滤液。 酸浸提法 向香菇处理物中加盐酸溶液使其最终浓度分别为 0.3mol/L、0.4mol/L、 0.5mol/L , 臵于60?恒温水浴中浸提 8h , 加适量的NaOH中和至中性,过滤,浓缩。 微波提取法 向香菇处理物中按1:25加入去离子水浸泡过夜,粉碎,在一定微波条件下提取,冷却后离心,从上清液中取样测定其中多糖含量。 超声波提取法 向香菇处理物中加入蒸馏水，进行超声波处理浸提。 8000r/min离心五分钟，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至10~20ml，加入两倍体积的无水乙醇，进行醇沉。放臵过夜后再次离心，留取沉淀物，干燥至恒重。 复合酶浸提法 向香菇处理物的中加 0.1g纤维素酶和0.5g果胶酶,目的是为了酶解细胞表面结构及细胞间连接物,使其部分糖类物质的溶出。往酶解后的香菇处理物中加入 20倍体积的蒸馏水,并在40水浴恒温下浸泡80min 。迅速升温沸腾90min ,后过滤得滤液。离心沉淀,上清液浓缩,乙醇沉淀。 复合酶解,酸与热水相结合浸提法 向香菇处理物中加 0.1g纤维素酶和 0.5g果胶酶,目的是为了酶解细胞表面结构及细胞间连接物, 使其部分糖类物质的溶出。加 20倍体积的水在 40 水浴恒温下浸泡 80min。后再迅速升温煮沸 60min,用 4层纱布过滤后收集滤液, 再调节 pH分别为 4.5、5.0、5.5 ,进行酸浸提, 然后再用 4层纱布过滤后收集滤液。合并两次滤液。浓缩。 (3) 现在常用的生产方法 以上几种方法均有优点和缺点，而现如今也都在被使用～在此，我以热水浸提法来介绍其生产技术。 3 、生产技术 (1) 原料及要求: 将香菇清洗干净，除去其根部，将剩下的菌伞挤压，切小块放入真空干燥箱干燥，待香菇恒质量，放入粉碎机中粉碎，将粉碎后的香菇粉依次通过40，60，80，100目的筛子，得到40目以下、40,60目、60,80目、80,100目、100目粒度以上的样品，过筛之后把各级香菇粉分别装到清洁干燥的烧杯中，编号贴上标签，臵于真空干燥箱中待用。 【所谓的多少目】是指在每英寸(一个的单位长度2.54厘米)的长度上有多少筛孔，如果有80个孔，就是80目筛，孔数越多，孔眼也就越小，经80目筛后的颗粒的直径为2.54/80= 0.03175cm (2) 生产原理: 多糖溶于热水,不溶于60%以上乙醇,也不溶于氯仿正丁醇.热水浸提时，香菇组织膨胀破裂，多糖成分浸出，所以用热水提取,乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质;因为热水也可以将蛋白类物质提取出来,所以用氯仿正丁醇萃取除去提取液中的蛋白。 (3) 工艺流程: 【sevage法脱蛋白】 正丁醇、氯仿混合溶液(正丁醇:氯仿=1:4或1:5)和样物提取液混合并且振荡，不需要加热，利用离心机离心，直到离液面交界处无白色混悬，也就是蛋白质介于提取液与试剂交界处即可，最后分别提取即可。 (4) 工艺流程说明及主要工艺参数: 热水浸提 向香菇处理物中加入 20倍体积的蒸馏水,并在 40? 水 浴恒温下浸泡 4h。放臵冰箱冷冻柜中冷冻过夜。将香菇浸泡液从冰箱中取出, 解冻后在恒温水浴箱内分别抽提 30min、 60min、90min ,用4层纱布过滤后收集滤液。向滤渣中加入20倍体积的蒸馏水再抽提一次, 沸煮时间同上，用 4层纱布过滤后收集滤液,合并两次滤液。 真空浓缩 将上述滤液用旋转蒸发器在75? , 0.09Pa大气压下进行浓缩, 收集浓缩液。并用高速离心机在 6000rpm离心 15min , 目的是去除蛋白质和杂质,得上清液。 酒精沉淀分离 在浓缩液中加入 4倍体积的 95%乙醇, 使香菇多糖呈絮状凝胶物沉淀析出,而大部分蛋白质和其它成分保留在溶液中, 再用高速离心机在 7000rpm下离心 15min得沉淀。 sevage法脱蛋白 将上述沉淀溶于适量的蒸馏水中,分别加入 20% 体积的氯仿和 7% 体积的异戊醇生成絮状凝聚物, 用高速离心机在5000rpm离心15min得沉淀。重复上述操作, 直至无凝聚物生成。 丙酮洗涤脱水 将酒精沉淀物用丙酮洗涤脱水两次, 倒入放有干燥滤纸的培养皿中 (滤纸重0.98g) ,然后将培养皿放在 50? 的烘干箱中进行干燥 3h ,得到香菇多糖粗制品。 粗多糖纯化 Sephadex G-100凝胶充分溶胀后装柱，用蒸馏水平衡48h。取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度5mL/20min，200nm波长紫外检测，收集主要峰部分，冷冻干燥的白色香菇多糖，并称重。 【 Sephadex G-100凝胶】能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 (5) 主要生产设备: 烧杯(若干)，玻璃棒，温度计，锥形瓶(若干)，漏斗，水浴锅，称量天平，台式恒温振荡器,台式离心机，紫外线分光光度计。 (6) 关键过程与关键技术 多糖的提取 取香菇10g，于组织捣碎机内粉碎，加入20倍量水，90 ?水浴加热30min，抽滤，得滤液，加活性炭(1mg/mL)，搅拌吸附1h，抽滤，得滤液，用氯仿萃取(3次)以除尽蛋白质，萃余液中加无水乙醇，使其乙醇最终浓度为80%，沉淀12h后，于离心机中离心(4000r/min)30min,沉淀物分别用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤三次，既得香菇多糖提取物。 多糖纯化 凝胶柱层析原理:所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。 操作步骤: Sephadex G-100凝胶充分溶胀后装柱，用蒸馏水平衡48h。取上述香菇多糖提取物溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液上柱分离，用蒸馏水洗脱，洗脱速度5mL/20min，200nm波长紫外检测，收集主要峰部分，冷冻干燥的白色香菇多糖，并称重。 香菇多糖分析检测 定性分析——苯酚-硫酸法 酚-硫酸试剂:酚3g，浓硫酸5mL，溶于95mL无水乙醇中，喷后，110?,加热几分钟，糖显棕色。 定量分析——分光光度法 A 标准曲线的制备 精密称取60 ?干燥至恒重的甘露糖标准品0.1g，至于100mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，用移液管量取对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，再各精密吸取1mL，至于具塞试管中，准确移取8%苯酚溶液1mL，快速加入浓硫酸5mL，至于水浴中加热15min，取出冷却至室温，橘黄色由溶度从小到大而逐渐加深，将溶液于490nm波长的可见分光光度计处测定吸光度，绘制标准曲线。 B 样品多糖测定 精密城区香菇多糖10.0mg，加水溶解，定量转移入100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。准去吸取2.00mL，按上述实验方法显色，测定吸光度，计算香菇多糖含量。 (7) 该技术的优缺点: 优点:有可靠的生产数据，可大规模工业化生产，不易招致杂菌污染。 缺点: 能耗高，设备要求高，提取时间长，高温可能会使多糖水解。 (8) 该技术的改进之处: 增加浸提时间，使浸提过程得以充分;浸提后过滤时尽量趁热过滤，否则温度降低，物质间的粘度增大,过滤时间增长;浓缩过程受仪器影响较大，应选用较好的浓缩装臵，如旋转蒸发仪等。 在实际生产中，为降低成本，提高效率，以上方法可结合应用，如热水浸提结合超声波;复合酶解、 酸处理结合热水浸提法提取香菇多糖等等，这样提取效率比单一方法高许多。 注意事项 1 氯仿有毒使用时要注意安全 2 注意凝胶柱装柱时不要有气泡存在于凝胶柱中 3 注意分光光度计的使用方法(预热，比色皿的润洗等) 2013-6-16