反义单核细胞趋化蛋白1对大鼠系膜细胞增生的影响

反义单核细胞趋化蛋白1对大鼠系膜细胞增生的影响 反义单核细胞趋化蛋白1对大鼠系膜细胞增 生的影响 Februarv2oo7.Vol23,No.2 反义单核细胞趋化蛋白1对大鼠系膜 细胞增生的影响 张新萍易着文何小解何庆南朱敏周钢 【摘要】目的研究反义单核细胞趋化蛋白l(MCP—1)对系膜细胞MCP—1分泌及增生的 影响.方法用逆转录病毒感染体外培养的系膜细胞,得到转染反义MCP—l的系膜细胞, .脂多糖经PCR及Southern印迹鉴定外源基因在系膜细胞基因组DNA上的整合(LPS)刺激反 义MCP.1系膜细胞,以正常系膜细胞及转染空白载体的系膜细胞为对照,观察其增生情况. 用RT.PCR法检测MCP一1,CC趋化因子受体2(CCR2)的mRNA达.ELISA法检测细胞上清 中MCP.1蛋白的分泌.结果经逆转录病毒转染得到的反义MCP—l的系膜细胞,其基因 组DNA中有外源基因的整合.在正常的培养条件下,反义组与对照组系膜细胞的增生差异无 统计学意义;MCP.1,CCR2的mRNA均有少量表达;MCP—l的蛋白也有微弱表达.在LPS的刺 激下,反义组与对照组MCP.1的mRNA的表达均增高;MCP—l蛋白的分泌均增多.与对照组 比较,反义组系膜细胞的增生受抑制【(16.83?1.16)Xl~/ml比(19.63~1.85)X10/ml】,MCP—l 的mRNA的表达较少(0.424比0.866,P<0.O1),MCP—l蛋白的分泌减少.CCR2 的mRNA 表达与MCP—l的变化一致.结论(1)逆转录病毒载体pLXSN可有效地介导 MCP.1eDNA 在系膜细胞的转染.(2)反义MCP.1可降低系膜细胞MCP—l的转录和翻译.(3)反义 MCP—l的转 染可降低系膜细胞在炎症状态时的增生.(4)大鼠系膜细胞具有CCR2的表达,在炎 症状态时 形成MCP.1,CCR2的自分泌环路. 【关键词】单核细胞化学吸引蛋白质l;细胞增殖;趋化因子,CC;系膜细胞 ? 95? ? 基础研究? h岫u蛐ceoftmtiseuseMCP一1OnMCP一1productionandmesangialcellproliferation ZttANGXin-ping,YIZhu—wen,HEXiaoqi~,HEQng—n 珊,ZHUMin,ZHOUGang.Laboratoryof PediatricNephrology,theSecondXiangyaHospital,CentralSo~thUniversity,Changsha41 001J, China Correspondingauthor:YIZhu—lloen,Email:yu棚enoo.COtrt.cn 【Abstract】ObjectiveToexaminetheinflueneeofantisenseMCP.1OnMCP—l productionandmesangialcellproliferation.MethodsrheratglomerularmesangialceUswer e infectedwithretroviralsupernatantsofpLXSN—A—MCP—lcontainingantisenseMCP—landverified bySorthemblotanalysisandPCR.Lipopolysaeeharide(Lix3)stimulatedtheinfectedmesan gialcells. Cellgrowthwasmeasuredbycellcountingmethod.MCP—lexpressionwasdetectedbyRT—PCR andenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA1.ResultsSouthemblotanalysisandPCR demonstratedthatantisenseMCP-lcDNA—infectedmesangialcellswereestablishedsuccessfully. TreatedwithLPS,thegrowthrateofinfectedcellswassignificantlylowerthanthatofnormalc eils. nIelevelofMCP?1.CCR2mRNAformationandthelevelofMCP—lproteinsecretiondecreased comparedwiththoseofnormalcells.ConclusionspLXSNcantransferMCP—leDNAinto mesangialcells.AntisenseMCP—ldecreasesMCP—ltranscriptionandtranslation.AntisenseMCP—l 基金项目:国家自然科学基金(39970776);教育部高等学校博士学科点科研基金(20040533043);湖 南省"十五"重点学科建设项目基金 作者单位:410011长沙,中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室(张新萍,易着文,何小解,何庆南), 中南大学分子生物学研究中心(朱敏,周钢) 通讯作者:易着文.Email:yizhuwen@yahoo.con1.cn N decreasestheproliferationofmesangialcellsininflammation.CCR2alsoexpressesinmesan gial ceHs.MCP一1iSaautocrinechemokine. 【Keywords】Monocytechemoattractantprotein一1;Cellproliferation;Chemokines,CC; Mesangialcell 在炎症因子的作用下,系膜细胞可释放单核 细胞趋化蛋白1(MCP一1)Ill.单核细胞与系膜细胞 的接触,也诱导系膜细胞MCP一1的表达【21.人系 膜细胞自身可表达MCP一1的受体CCR2t1,MCP一1 可通过系膜细胞自身表达的受体而对系膜细胞 起作用.因此,MCP一1不但趋化单核细胞,对肾小 球局部的系膜细胞也有影响.但MCP一1对系膜细 胞的具体作用现在还不清楚.本研究通过抑制系 膜细胞分泌MCP一1,观察系膜细胞在炎症时的表 现,研究MCP一1对系膜细胞的作用及对肾小球病 理进程的可能影响.我们将构建的反义MCP一1 cDNA的逆转录病毒载体,转染体外培养的大鼠 系膜细胞,通过载体上所携带的反义MCP一1 cDNA进而观察MCP一1对大鼠系膜细胞MCP一1 表达及增生的影响. 材料与方法 一 ,主要试剂 1.LPS(美国Sigma);大鼠MCP一1定量ELISA 试剂盒(上海森雄),正义反义MCP一1基因逆转录 病毒载体重组质粒由本研究室构建【41,大鼠系膜 细胞MC53由本研究室保存.大鼠CCR2基因的 引物由北京奥科公司合成,序列如下:上游5' GGAATCCTCCACACCCTGrITITC3',下游5'ACC CAACTCACACfrI,c1-I,CCTCCC3',扩增产物402 bpt1.逆转录病毒上的neo基因引物序列:上游 5AGATGGAITGCACGCAGGTF3,下游5GAAG GCGATAGAAGGCGATG3,扩增产物767bp. GAPDH基因的引物序列:上游5'CTI'CACCAC CATGGAGAAGG3',下游5'CTI'ACTCCTI'GGAG GCCAT3',扩增产物为706bpt1. 二,方法 (一)逆转录病毒对系膜细胞的感染【1 本室构建的逆转录病毒假病毒颗粒为反义 pLXSN/MCP一1及pLXSN.大鼠肾小球系膜细胞常 规培养于含10%小牛血清(FCS)的DMEM培养 液中,置于37%1,5%CO培养箱中孵育,每周传代 1-2次.用逆转录病毒假病毒颗粒转染大鼠系膜 细胞:培养的大鼠肾小球系膜细胞在转染前24h 以50%融合的细胞密度传代于六孔板中.加入含 10%FCS的DMEM2ml,于37~C5%CO2孵箱培 养至细胞达80%融合.转染前再用无血清培养基 清洗细胞2次,加入含10%FCS的DMEM2ml. 分别取空载体和表达载体的假病毒颗粒100Ixl, 加入六孔板的细胞中,同时加入polybren4mg/L. 24h后换用含10%FCS的DMEM2ml继续培 养.48h后将细胞以1:20稀释,用G418(质量浓 度为800mg/L)筛选转染MCP一1的系膜细胞阳性 克隆.3d换1次培养液,培养2周.筛选出克隆 后放大培养. (二)PCR方法检测转染的系膜细胞 将细胞分为3组:正常大鼠系膜细胞未转染 对照组,pLXSN空载体对照组,反义MCP一1转染 组.细胞基因组DNA的提取按文献【4】.PCR检测 neo基因及MCP一1cDNA在大鼠系膜细胞上的整 合:应用PCR方法扩增载体上的neor基因,反应 条件:变性94?30S,退火6O?45S,延伸72~C, 1min,共35个循环,最后于72?延伸7min.应 用PCR方法扩增MCP一1目的片段. (三)Southern印迹检测neor的整合 1.标记探针:PCR反应体系:HO38l, pLXSN质粒模板5l,上游引物1l,下游引物 1,10×Buffer5,dNTP(10mmol/L)1Ixl, dCTP(0.1mmol/L)1l,0【一32pdCTP(10Ci/m) 7Ixl,Taq酶1l.反应条件:预变性95?3min, 94?30S,56oC30S,72oC30S,共35个循环. 用等体积的乙酸铵(4mol/L)和2.5倍体积的乙醇沉 淀DNA,放置于一7O?20min.4~C13000r/min 离心5min,收集沉淀.用SephadexG一75离心柱 层析除去残存的未掺入的dNTP和寡核苷酸引 物. 2.Southern印迹:用EcoRI完全酶切基因组 DNA30g,体系如下:DNA50l,10xBufferB 1Ol,EcoRI8l,ddH2O32l,离心混匀,37? 酶切过夜.将酶切产物以电压2V/cm进行1%琼 脂糖凝胶电泳1h,分离DNA片段,紫外灯下测 量分子最DNA迁移的距离缝0.5mol/L NaOH溶液中虢变rI.中和液5nml/I TrIICI.nH7.0,I.5nlI】I,La':…p和后,将凝 胶底面朝上.以2OxSSC溶液f03mol/LNaCI, 0.3m,?柠檬酸--钠I把DNA过l使转移刮JE龙 膜卜. 3uthem膜的预杂交和杂交:把已转移 DNA的尼把膜于热封口嗵料袋中,JJu人杂交液 f含5xDen[1trdt5xSSC.10nm'ml/ITris—HCI. O1%SDS,100ng,【ss1)NA)1011qI,68预杂交 4I1.再加八P标记DN,4探针,68?杂交过瘦,杂 交后重复洗膜,去陈未杂交L的同1素破劓自 显影,观察杂交结果 (四)反义MCP.1对系恒细胞的影响 1.筛选大鼠肾小球系膜细胞的分组:体外培 养的正常犬鼠肾小球系膜细胞为X,I-~Y,?II;筛选出 的已导人宅向载体的大鼠肾小球系膜细胞为空 向组;筛选卅的已导入反义载诈的大鼠肾小球系 膜细胞为反义组. 2.符组缃胞生长fff1线的测定:f]1分别将3组 系膜细胞以1个】的密度传代于24孔板,每 日计数细胞+每次每组随机选6L.胰酶消化后 用Jfll邦{胞计数器计数:每L计数3次,5d.f2) 分别将3组系膜缃胞以lO个/ml的密度传代于 24孔板.培养液中加入【Ps.终质量浓度为Im~ffL. 同样按述方法每F『计数细胞.. 3.大鼠系膜胞及上清液的收集:将3组大 鼠系膜细胞分别种入50mI培养帆,(2-4}×104 个/1,11,培养于含l0%小牛m清的DMEM培养液 中.并加人LPs,终质量浓度lmg/1,5%(O孵 箱.37分别培养0,2448,72h,收集卜清l—n1. 冻存备用系膜纽『胞在72h计数后刖以提取 n1RNA 4半定齄R丁.PCR榆删系膜细胞MCP—l, CCR2mRNA表达变化:提取各组大鼠肾小球系 膜细胞RNA.逆转录合成clJ)NA的第l链.取合 成的MCP+l或CCI/2-DNA7,大鼠~'ICP—l与 CCR2eDNA序列上游及下游特异引物各1 (20pmo|),大鼠GAPDH序列上游及下游特异引 物各1l,10×11aq酶缓冲液5,rl,PPf】0 mnml/L)2tz1.氯化镁(25retool/L)3ttl,Ta({酶 (2.5U)】I,加入无桉酶水至反应总体手J!为 50,按j{{{94:30s,5645s,7211tT1;n的 顺序共循环3O次;取f述扩增产物10,qt I.5%的琼脂糖凝胶电泳.紫外透射成像系统摄 像,美国Bi.Rad影像系统剥条带扫描分析. 计算MCP.I,CCR2与(;APDH暇光度之比伉+作 为MCII,CCR2tuRNA的棚划禽屉 5.ELISA法检测大鼠系膜细胞MCP—l蛋白 的表达:ElISA法榆测MCl】_】蛋白在各卦I大鼠系 膜细胞培养l"i'ff中的表述,具体拨}【cl试刺盒说明 f5进行,j结果鲶细胞数校正后,以?表示 ,统计学分析 采用SPSSl00统计软件.在计算机E进行 统计分析.计结果以表示.两组删均数比 较采用t检骑,多组问均数比较进行困素方差 分析. 结果 l系艇细胞克隆的}长:转染两种病毒颗精 n9系膜细胞在(4】8的筛选F.均柯克隆生K.. 2?c?基冈及MCP一1在大鼠系噗细胞c-I)NA 的整合:PCR扩增系膜细胞螭fDNA中转 染的pLXSN载体f的n序列,无外基因转染 的lE常大鼠系膜细胞未见阳性条带,卒城体技反 义MCF'I转染的大鼠系膜细胞均见767}I『】的刚 性条带图1PCR扩增系艇胞黛组DNA 中f}々MCP.I片段.反义MCP一1转染的大鼠系膜 细胞527hp的…性条带.崩所设nqbtCP】 的引物只特异地扩增11J转染的~'ICP—lDNA, 而能扩增大鼠基因U中的MCP—I睡f.这晚 叫外源的MCP—lt【)NA稳定地整台刮大鼠系膜 细胞.『}I2 3.,qoulllelII杂交证明外源nP基冈在尢鼠 系膜细胞的整合:系膜细胞基组DN^经 800Il 【hp 3]lip 图I各川噗细胞neo墙丧丛-R'I.PCR 1234 ;3厦义组;4:Markr I:引麒封I:2:空r1纽 图2荐绑系膜细胞Mcnl革园表逃tR1.H EcoRl酶切.转膜后杂交结果表州璃毒感染的 大鼠系瞑卸j胞I町阳性条带.说明外源基因整 合到大鼠系膜细胞基【1),A中,圈3 -ira4, 1:对j;2:门封l:3埂|z' 图扦系II~i'lll胞【1)^稿li,-l硬?-ithorn隶交'f 4.各组细胞MCI.1mI/NAfI勺变化:各组绑胞 在Ll作用72h后均有…一III1RNA的表达. 其中反义系膜细胞的表达减少.见4各 MCP1条带的mR,A}1{=羟扫描.结果经t;APDH 的丧达修l】:后.反义组系模绑胞的表达 10.424)为对州组细胞(0.866)的49僻,址向纰 10830)的51%.与对组及空白比较.薰异均 有统汁.:意义(P均<0OII 8011bp 3C)0bl- M 图 c^Il MCL' Markllr;l刊『l州;2:申门:3眨殳引l 存n糸幢细脆,1._l1II1h^文(1trP【E 5EusA法榆洲MCP—l蛋白的表丛:划. 时间的胞培养清ELISA方法榆测其巾 MCP.1的岔量.分圳州100050025c),】25,625, 3l,l56ng/L的标准浓度绘制标准曲线,得Y= 479.4I8X一67.467.r=0875.计算各MCP一1n勺浓 度.见罔5培养l_l勺大鼠系膜细胞在IJPs的刺澈 台成与分泌MCP—l,具自H,J问依赖性特LPS刺 激2.4lh后.各组细胞七清中MCP一】的含量均升 高.48h升高明屁,72h达高峰各组细胞的分泌 景在组内比较,差异均有统汁学意义【P< 0.05)在每一时问点f,各组细胞I清中MCP一1 的翕量不同反义组系膜细胞在4872._分泌量 下降.与xCgd.组技空白组系膜圳胞组比较差异均 有统计学意义(P<005)对照组利宅门系膜 细胞的分泌量窿各时间点差异均尤统计学意义: 6系膜细胞的牛}乏曲线:在倒置微镜, , ?2448 别 图5符最膜盘e胞McI噩 转染反l殳MCP—l基的绑胞,形怎求见I调显差 异在降通培养液(19条件下,I胞计数显示,粹组 细胞:长速发无明显差井在IJI的作用r.各 ?R绑[胞的生长速度井中H.其中反义系脱}删包 的生K速度较对照绀细胞和虮细胞的生}乏 悭在第2,3,4天反_艾系膜圳胞的l长速度J其 它两组组lJ旭比较差异宵统汁学意义,表1 表III作用后最胞蛐I胞戡l×1/m1.i?^ 7各组细胞CC112m】{NAn々表达:各组胞 存IPs怍州72h后均有CCR2nIRN^的表达. 图6其t『1反义组系膜绑胞的表达减少,备条骷的 DNA艟经『捕.坫粜经(,APDH的挺逃量修正后, 反义组系膜圳胞CCR2retINA的表达量f0878) 为常细胞(1096)的80%,娃空门对照组 (1.】49)的76%,与刈照厦峰门绢比较.差异有 统计学意义fP均<005} :^J1)? :l}i! M:mnrk~r:1:埘曩虮;2:盘rI:3:_{ 图6特L乐雌I11崛cc"2的nlJl~,A的柱 8)bp 饿鼢翰隧 ????????? 圈翻鳕 ??????? . I '=== 一[J隧? S^42n 一ll一一了二= 的 nJNeDhrol,February2007Vol23No 讨论 反义技术即根据碱基互补原理,用人工合成 或生物合成的特定互补的DNA或RNA序列,导 人靶细胞,形成mRNA—DNA或mRNA—RNA杂交 双链,从而抑制或封闭基因表达,使其丧失活性, 达到基因控制和治疗的目的『8].反义核酸具有特 异性强,操作简单的特点,只与特定mRNA结合 阻断靶基因的翻译表达,不改变基因结构,最终 会被RNA酶水解,不残留[91.反义DNA可抑制大 鼠的动脉平滑肌细胞MCP.1的分泌,进而影响单 核细胞在血管壁的浸润『lO].应用MCP一1的反义核 苷酸可减少大鼠损伤脑组织的MCP.1表达,单核 细胞的浸润减少30%[hi.反义DNA能够抑制 Goodpasture综合征大鼠肾小管上皮细胞MCP一1 的产生,减少单核细胞的浸润并改善肾小管间质 的炎症【1.在肺的内皮细胞,反义DNA也可抑制 MCP一1的合成『I1. 逆转录病毒具有独特的生活特性,它可将外 源基因稳定整合到宿主细胞基因组,并随细胞分 裂而传给子代细胞….本研究构建的逆转录病毒 载体,经PA317细胞包装后产生高滴度的病毒上 清,我们利用病毒上清感染大鼠肾小球系膜细 胞,经过G418筛选,得到阳性系膜细胞克隆,经 PCR及Southern印迹鉴定,证实在阳性系膜细胞 克隆基因组DNA中有外源MCP一1DNA的存在, 说明本实验使反义MCP一1基因成功地整合到系 膜细胞中.在实验中,反义组系膜细胞在LPS作 用72h后,其MCP.1mRNA的表达量为正常细 胞的49%,空白对照组的51%,说明反义MCP.1 可显着抑制LPS诱导的系膜细胞MCP.1mRNA 表达.各组系膜细胞在LPS刺激后,在每一时间 点上,细胞上清中MCP.1的含量不同.反义组系 膜细胞在48,72h分泌量下降,与对照组,空白 组系膜细胞有显着差异.证实反义MCP.1不但可 抑制系膜细胞MCP一1的mRNA表达,并影响系膜 细胞MCP.1蛋白的分泌.许多物质能刺激系膜细 胞,使之活化,进而收缩,增生,并释放多种炎症 介质及基质成分,促进肾小球炎症和硬化.病理 状态下系膜细胞作为一种活性代谢细胞,能合成 一 系列的炎症介质主动参与这个过程,其中细胞 因子作为近年来研究较多的一大类炎症介质,它 们以自分泌或旁分泌的方式,发挥致炎或者抗炎 的作用,从而维持机体免疫系统的平衡Ds].本实 验发现,体外培养的系膜细胞在正常培养的情况 下,MCP一1的分泌量极少,在LPS的刺激下分泌 MCP一1明显增多,说明MCP一1是系膜细胞炎症时 分泌的细胞因子之一. MCP一1对细胞产生作用是通过其受体CCR2 而完成的D6].本实验研究发现,大鼠的系膜细胞 均存在CCR2的mRNA表达,但反义组系膜细胞 的表达减少,为对照组细胞的80%,是空白组的 76%.与MCP一1mRNA的变化具有相同的变化趋 势.在LPS的刺激下,正常的系膜细胞的MCP一1 和CCR2的表达经历了相同的升高过程.在反义 系膜细胞,MCP.1的表达降低,CCR2的表达也有 相同的下降.提示2者之间的正反馈关系.由此 可以推论,MCP一1在大鼠系膜细胞中是以自分泌 形式进行分泌的. 系膜细胞在炎症时产生MCP一1,导致炎症细 胞在肾小球的浸润,但是系膜细胞自身对MCP一1 的反应还不清楚.为此,本实验应用反义技术抑 制MCP一1的产生,观察MCP一1的分泌量的变化 对细胞增生的影响.研究发现,正常培养条件下, 经反义MCP一1转染的系膜细胞的生长速度与其 它两组细胞的生长速度相同,说明转染反义 MCP.1基因本身对细胞生长没有明显影响.但在 LPS刺激的情况下,正常细胞的生长速度增高,转 染反义MCP.1的系膜细胞的生长速度相对降低, 说明炎症刺激可导致系膜细胞增生,而反义的 MCP一1可降低炎症刺激诱导的系膜细胞增生.转 染的系膜细胞增生低于正常组与空白组系膜细 胞,其原因应是反义MCP一1转染的系膜细胞 MCP.1的表达减少,由此可见,MCP.1蛋白水平 的降低,可降低炎症时系膜细胞的增生.从另一 方面来说,减少MCP一1的产生可以抑制在炎症状 态时系膜细胞的增生. MCP.1的作用主要是趋化单核细胞到炎症 部位,肾小管上皮细胞,血管平滑肌细胞在 MCP一1的刺激下,也可表现为增生及分泌白细胞 介素6增加【17A81.在对支气管上皮细胞研究中发 现,应用MCP.1可加快上皮细胞的增生及趋触 性,而应用CCR2的抗体则可起抑制作用ll9】.目前 也有研究证明在人的系膜细胞上有CCR2受体的 存在,IFN.^y和高糖状态可诱导细胞表达 CCR2t3,20,21].这些研究发现,经反义MCP.1转染的 系膜细胞其MCP.1,MCP.1mRNA,CCR2mRNA ? l00?2007年2月第23卷第2F 表达趋势与脂多糖诱导的系膜细胞增生变化趋【12] 势一致,说明反义MCP.1可通过抑制CCR2 mRNA表达抑制大鼠的系膜细胞增生. 【2】 【3】 【4】 【5】 【6】 【7】 【8】 【9】 【l0】 【11】 参考文献 RovinBH,YoshiumuraT,TanL.Cytokine-inducedproduction ofmonoeytechemoattractantprotein-1byculturedhuman mesangialcells.JImmunol,1992,148:2148-2153. HisadaY,SakuraiH,SugayaT.Celltocellinteraction betweenmesangialcellsandmacrophagesinducesthe expressionofmonocytechemoattractantprotein-lthrough nuclearfactor-kappaBactivation.BiochemBiophysRes Commun,2000,269:309-316. JanssenU,SowaE,MarchandP,eta1.Differential expressionofMCP-landitsreceptorCCR2inglucose primedhumanmesangialcells.Nephron,2002,92:797-806. 张新萍,易着文,何小解,等.正义,反义MCP.1基因逆转 录病毒载体重组质粒的构建和包装.生命科学研究, 2004,8:237-241. 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