奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的研究现状(综述)

新疆农业大学 专业文献综述   目: 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的研究综                                述                                    姓  名: 郭强强                                    学  院: 动物医学学院                                    专  业: 动物医学                                    班  级: 预防084班                                    学  号: 083631441                                    成  绩：                                     指导教师: 苏战强            职称:  讲师            2011年11月22日 新疆农业大学教务处制 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的研究现状               　作者：郭强强  　指导教师：苏战强 摘要：金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) ，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），是奶牛乳房炎的一种重要病原菌，可引起多种严重感染。有“嗜肉菌"的别称，金黄色葡萄球菌是乳房炎感染常见的病原菌之一。其引起的奶牛乳房炎给奶牛养殖业造成了极大的经济损失,尽管牛场环境、挤奶操作和奶牛干奶期治疗等方面有了很大改善,金葡菌引起的乳房炎仍然被国内外牛场视为一种难以防治的疾病。  关键词：生物学特性、致病性、检验、分子生物学 一、生物学特性 　　典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。[1] 血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。 二、致病性 金黄色葡萄球菌是奶牛化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 美国头例耐甲氧西林金黄色蒲萄球菌发现于1968 年, 1975 年耐甲氧西林金黄色蒲萄球菌在临床分散出的金葡菌中仅占2. 4% ,而1991 年则快速增至29% [2 ]。此刻美国的某些病院在临床分散出的金葡菌中可以占到30%-50%。一样在欧罗巴洲的蒲萄牙和意大利,耐甲氧西林金黄色蒲萄球菌在临床分散出的金葡菌中占50%;土耳其和希腊30%[3]。荷兰很是低,只有2%,这归功于荷兰人行之有用的节制计谋[4]。在欧罗巴洲的查询拜访中,瑞士的风行率最低(1.8%)[5]。 另外，据新华网洛杉矶12月27日电（记者高原）美国近来发生数起金黄色葡萄球菌食物中毒事件。据美国食品和药物管理局日前通报，截至目前已有100人感染，但尚未接到人员死亡。据药管局通报，在11月和12月，美国威斯康星州和伊利诺伊州相继报告4起金黄色葡萄球菌食物中毒事件，共计已有100人染病。根据初步调查，这几起食物中毒事件都源于伊利诺伊州一家生产西式糕点的工厂，该厂生产的甜点疑被污染。[6] 在国内，经研究发现金黄色葡萄球菌主要分离自分泌物、脓液和痰（72.1%），可见对于此类疑是金黄色葡萄球菌的感染患者，临床应考虑社区感染的可能；同时社区感染的金黄色葡萄球菌主要分离自青壮年（63.9%），与报道一致[7]。社区感染金黄色葡萄球菌的分离率为54.6%，高于国内外报道[8]。国外不断有报道致病性较强的社区感染金黄色葡萄球菌引起的暴发流行，已发现很多流行克隆株[9]。CA-MRSA感染及其在社区中的播散是近年出现的新问题，其流行病学、传播途径、发病机制、病原菌的发生和演变、治疗和预防等尚需进一步研究。 近期，国外学者就金黄色葡萄球菌发病情况做了一项研究。他们在2008年7月至2009年7月间调查了所有金黄色葡萄球菌感染患儿，均在其父母或监护人同意下作了心脏超声检察。心内膜炎按改良的Duke进行分类。结果在调查期间有51个儿童发生金黄色葡萄球菌感染，其中10个儿童发生感染性心内膜炎，大多数儿童是由于血管内装置的感染而患感染性心内膜炎的，患先天性心脏病的儿童较心脏结构正常的儿童发生感染性心内膜炎的机会要高。伴有感染性心内膜炎的死亡率高于不伴有感染性心内膜炎者。在这项研究中，金黄色葡萄球菌感染的儿童患感染性心内膜炎的发病率为12%，往往与先天性心脏病及多种血培养阳性有关。金黄色葡萄球菌感染且伴有感染性心内膜炎的儿童的死亡率高。[10] 三、检验 （1）PCR方法检验 采用的研究、试验方法和技术路线（包括工艺流程） 提取各个标准菌株 的基因组DNA ↓ 采用标准金黄色葡萄球菌菌株 对设定引物的PCR反应条件 进行选择和优化 ↓ 用表皮葡萄球菌、 木糖葡萄球菌、 甲型溶血性链球菌、 乙型溶血性链球菌、 蜡样芽胞杆菌作对照 进行PCR扩增 检测引物对 金黄色葡萄球菌特异性 ↓ ↓——————————↓ ↓                    ↓ 采用标准金黄色葡萄球菌菌株          采用生理生化的方法 探寻从乳样品中直接获取            乳中金黄色葡萄球菌分离鉴定 金黄色葡萄球菌DNA                    ↓ 的有效方法                    建立以乳源为主的 ↓                金黄色葡萄球菌菌种数据库 ↓                          ↓ ↓        提取金黄色葡萄球菌各个菌株DNA(做模板) ↓                          ↓ ↓                  用引物进行PCR扩增 ↓          检测引物对乳中分离出的金黄色葡萄球菌           ↓                  不同菌株的普遍适用性 ↓                          ↓ ↓--------------------------↓      ↓ 根据已总结出的从乳样品中直接获取金黄色葡萄球菌DNA模板的方法， 对从乳中分离出的金黄色葡萄球菌各个菌株分别处理获取模板， 进行PCR扩增,检测引物对金黄色葡萄球菌不同菌株的灵敏度 (2)Elisa方法检测 金黄色葡萄球菌肠毒素ELISA检测试剂盒 操作步骤 1 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。 2 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。 3 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。 4 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。 6 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 7 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。       8  取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。       9  在450nm波长处测定各孔的OD值。 (3)一般检验方法：   金黄色葡萄球菌的检验   样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。   增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。   分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24~48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2~3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。   染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5~1μm。   血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌试液浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。   耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。   四、分子生物学研究     近年来，在分子生物学和免疫学方面所取得的一些成果对于研制新一代有效的DNA疫苗起了很大的推动作用。在过去的几年当中，报道了许多有关预防本病的疫苗，但都由于缺乏广泛的有效性、生产成本以某些情况下的不稳定性，未能广泛应用。随着对金黄色葡萄球菌致病机制的认识，人们开始对金黄色葡萄球菌的黏附素开展研究，希望得到能有效的预防由金黄色葡萄球菌引起的乳房炎。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus;简称金葡菌)是临床上引起化脓性感染和医院内感染常见的病原菌，严重地危害人类生命健康。耐药菌株，尤其是多重耐药菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus; MRSA)的出现和广泛传播，更成为临床治疗棘手的难题［12］。防治金葡菌感染，必须采取有效、快速的检测手段进行病原体鉴定和分型，以寻找感染源，切断传播途径。既往多采用噬菌体分型金葡菌，但此方法依赖于噬菌体库的建立，操作方法较繁琐，可分型性较低，不能满足临床需要。近年来，国内外学者均试图应用分子生物学方法进行金葡菌的基因分型。目前常用的方法有：质粒图谱分型、限制性酶切分型、核糖体分型、聚合酶链分型(Polymerase Chain Reaction; PCR)+酶切分型、脉冲凝胶电泳分型(Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE)及随机扩增多态性DNA分型(Randomly Amplified Polymorphic DNA; RAPD)［13］。这些方法中因后两者的可分型性、重复性和分辨力均较好，更为常用。本文拟采用三种随机引物分别进行临床分离的26株金葡菌的RAPD分型研究，旨在建立一种简便实用的分子生物学分型方法。 1　材料与方法 1.1　菌株　分离金葡菌26株，均经形态学和生化试验鉴定证实，菌株编号为CHXY 9601～9626。 1.2　方法   1.2.1　样本DNA的分离　参照Boom R等的方法应用Celite进行金葡菌染色体DNA分离［14］。测定抽提后DNA的浓度，置-20℃冰箱保存备用。   1.2.2　RAPD分型　参照Alex van B等的方法［15］。取5 ng样本DNA于PCR反应缓冲液，内含10 mmol Tris.HCl pH8.0, 50 mmol KCl, 2.5 mmol MgCl2, 0.1%明胶，0.1% Triton X-100,0.02 mmol dNTP, 0.2 U Taq酶及50 pmol引物。三种引物序列分别为：ERIC-2 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；Ap1 5′-GGTTGGGTGAGAATTGCACG-3′；Ap7 5′-GTGGATGCGA-3′。PCR反应液覆盖50 μl矿物油后进行扩增，先94℃预变性5 min，然后94℃ 1 min，25℃ 1 min,74℃ 2 min。40个循环后取20 μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物带型经紫外反射仪上观察并摄片。 五、奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的症状 急性病例：最急性病例常见于最近犊牛的母牛或感染期乳牛。其表现为高热（40.5-41.6）,精神沉郁，食欲不振，乳区发炎肿胀、坚实疼痛。病牛因乳腺炎症避免腿与乳房摩擦而出现跛行。坏疽性乳腺炎发生于新近产犊牛，是金黄色葡萄球菌性乳腺炎的最坏结果。发生坏疽时毒血症症状加重，坚实的乳区在几小时内由粉红色、红色变为紫色，再有紫色变为蓝色。病牛心跳极快，发热（休克发热后逐渐减轻），深度的毒血症，精神沉郁，食欲废绝。乳房的坏疽区皮肤与周边正常皮肤之间常见明显的分界线。 患金黄色葡萄球菌性乳房炎的产犊小母牛，感染乳区的分泌物中常有米粒样凝块或浓汁。该乳区坚实、水肿、发热，但由于围产期水肿，难以通过视诊识别出感染。     慢性病例： 慢性金黄色葡萄球菌性乳腺炎会导致乳腺纤维化。这种纤维化可作为早期乳腺炎控制的主要诊断依据。虽然根据异常乳或急性发作，可以怀疑许多乳牛有慢性金黄色葡萄球菌感染，但另一些牛是亚临床的，不易发现。触诊乳腺实质和间质的纤维化有助于诊断，并可确定对生产永久性破坏的程度。