生物素标记蛋白操作方法

生物素标记蛋白操作方法 下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。 1、 溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。 2、 在打开之前，平衡生物素至室温。加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。（见下） 蛋白质 蛋白分子量 蛋白含量 mg/ml 溶液内所含的蛋白毫摩尔数 需加入生物素的毫摩尔数 生物素大约加入量 需加入生物素溶液的体积 IgG 150,000 10 6.7×10-5 8.0×10-4 0.4mg 20ul IgG 150,000 2 1.3×10-5 2.7×10-4 0.15mg 7ul               3、 室温30分钟，或冰上放置2小时。 4、 用30ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。 5、 以280nm的吸收值测定蛋白含量。 6、 生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。 HABA法检测生物素标记效果 试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mM Nacl　PH7.2） ②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mM　HABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。 比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比： 1、 吸取900ul　HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。 2、 测定该溶液在500nm处的吸收值并为“A500　HABA/Avidin”。 3、 吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500　HABA/Avidin/Biotin (数值必须恒定15s以上)如果A500　HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。 注：计算结果时必须考虑稀释度。 4、 计算Biotin/Protein摩尔比 ①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量 ②B=500nm处的吸光度变化 △A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin ③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程） ④Biotin/Protein摩尔比=C·10·稀释倍数/A