106-龙眼保鲜功能微生物挥发性物质的分析

106-龙眼保鲜功能微生物挥发性物质的 1 龙眼保鲜功能微生物挥发性物质的分析 陈峥,刘波*,车建美,唐建阳,朱育菁 (福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003) 摘要:采用SPME-GC/MS的方法分析龙眼保鲜功能微生物“果立鲜”的挥发性物质成分。 果立鲜香气的挥发性总成分共20种。其中嘧啶1种～占总成份的40.67%～为2-氯-4-(4-甲 氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶,40.67%,。烷类14种～占总成分的18.05%～包括十四烷 ,2.35%,、4,8-二甲基-十三烷,0.47%,、4-甲基-十五烷,1.45%,、2-甲基-十二烷,0.65%,、 十八烷,0.44%,、2,6,10,14-四甲基-十五烷,1.50%,、正十七烷,1.82%,、4～6-二甲基 -十一烷,1.64%,、十六烷,3.27%,、2-甲基-十五烷,1.02%,、5-乙基-2-甲基-辛烷,0.50%,、 4-甲基-十五烷,1.45%,、4-环己基-十二烷,0.91%,、3-甲基-十四烷,0.58%,。烯类2 种～占总成份的1.36%～包括α-柏木烯,0.63%,、,+,-长叶烯,0.73%,。 关键词:气相色谱质谱联用,固相微萃取,果立鲜,挥发性物质 中国分类号: 文献标识码: Analysis of Volatile Components of Mrcrobial Longan Fresh-kepping Angent CHEN Zheng, LIU Bo, CHE Jian-mei, TANG Jian-yan, ZHU Yu-jing (Institute of Agrobiological Resources, Fujian Academy of Agricultural Sicences, Fuzhou, Fujian 350003, China) Abstract:The volatile components of mrcrobial Longan fresh-kepping angent were analyzed by SPME/GC-MS. Twenty componds were identified. The results showed that the main component was 2-Chloro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(4-nitrophenyl)pyrimidine, with relative amount of 40.67%. There were fourteen Alkene in the volatile, with relative relative amount of 18.05%, including, Tetradecane,2.35%,、Tridecane, 4,8-dimethyl-,0.47%,、Pentadecane, 4-methyl-,1.45%,、 Dodecane, 2-methyl-,0.65%,、Octadecane,0.44%,、Pentadecane, 2,6,10,14-tetramethyl,1.50%,、 Heptadecane,1.82%,、Undecane, 4,6-dimethyl-,1.64%,、Hexadecane,3.27%,、Pentadecane, 2-methyl-,1.02%,、Octane, 5-ethyl-2-methyl-,0.50%,、Pentadecane, 4-methyl-,1.45%,、 Dodecane, 4-cyclohexyl-,0.91%,、Tetradecane, 3-methyl-,0.58%,.There were two alkane in the volatile with relative amount of 1.36%～ including,1H-3a,7-Methanoazulene,2,3,4,7,8,8a-hexahydro-3,6,8,8-tetramethyl-, 2 [3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)]-,0.63%,、1,4-Methanoazulene,decahydro-4,8,8-trimethyl-9-methylene-, [1S-(1.alpha.,3a.beta.,4.alpha.,8a.beta.)]-,0.73%,。 Key words: GC/MS; SPME, GLX, volatile components 在研究龙眼微生物保鲜剂的过程中，福建省农业科学院农业生物资源所微生物研究中心筛选到一株具有龙眼保鲜功能的微生物FJAT-0809-GLX，经中科院微生物研究所鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX)。利用该菌株生产的龙眼微生物保鲜剂“果立鲜”，不仅对龙眼等多种水果具有很好的保鲜作用，同时具有特殊的挥发性香气。为了了解该菌株挥发性香气的成分，本研究利用固相微萃取法(SPME)，对菌株的挥发性物质进行了收集，用气相色谱质谱联用(GC/MSD)的方法对其进行分析。 关于微生物产生挥发性物质的分析 ，随着物质收集技术，检测手段、生物活性测定等体 [1]系的完善。国内目前对微生物的挥发性物质的研究较少，特别对于保鲜功能芽孢杆菌挥发性 [2]物质的研究为见报道。吴艳等(2007)报道了1 株组合Bacillus sp. CL-8的挥发性物质对立枯丝核菌的具有抑菌效果，揭示了挥发性抑菌物质也是参与其在田间发挥抗病作用的重要成分。 本实验采用固相微萃取SPME-GC/MSD的方法分析发酵液的挥发性成分，初步尝试从挥发性成分方面探索“果立鲜”的气味组成，以及探索挥发物中是否含有抗病物质成分。 1 与方法 1.1材料 供试生防菌短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX(Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX)，实验室分离保存。种子培养基:淀粉 1%，牛肉膏 0.5%，蛋白胨 0.3%，蔗糖 1%，酵母粉 0.5%，CaCl 20.5%，pH 7.0。发酵培养基:淀粉 0.8%,豆饼粉 3%，蛋白胨 0-2%，蔗糖 2%，CaCl 0.5%，消2泡剂 0.17%, pH 7.0。实验试剂:AR丙酮。实验仪器:主要实验仪器采用美国Agilent公司制造的7890A/5975C气质联用仪(GC/MSD);SPME萃取柄(美国Supleco公司)，100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取头(美国Supleco公司);电子天平(Navigator NO4120);恒温摇床(HZQ-F160);pH计。 1.2方法 SPME老化方法:使用前将SPME萃取头旋入萃取柄，用丙酮浸泡萃取头1 h后，将SPME萃取头在气质联用仪的进样口250 ?老化30 min。挥发性气味收集:将1 L果立鲜于4 ? 6000 r/min 离心30min，取上清液400 mL于1000 mL三角瓶内。在橡皮塞上打孔并用封口膜包裹后插入SPME的萃取柄。CK为不装样品的三角瓶。采样时，将橡皮塞塞入三角瓶，将萃取头旋出。收集2h后将萃取头收起，后进气质联用仪。GC-MS分析条件:GC-MS分析条件:进样方式: 3 手动进样。色谱条件:采用HP5-MS色谱柱，进样口温度250 ?，压力4.5338 psi，总流量104 mL/min，隔垫吹扫流量3 mL/min，不分流。升温程序为:50 ?保持2 min，以5 ?/min上升到280 ?保持3 min。质谱条件:采集模式:全扫描;EMV模式:相对值;全扫描参数:开始时候的质量数50.00 amu，结束时的质量数550.00 mu;MS温度:离子源230 ?，MS四级杆150 ?。 2结果与讨论 2.1、龙眼保鲜功能微生物香气挥发性物质的总离子流图 对果立鲜的挥发性物质进行了GC-MSD定性分析，得到果立鲜和对照CK的挥发性成分的总离子流图，见图1，图2。在果立鲜中峰面积较大的六个色谱峰为十甲氧基五硅氧烷、2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、十二甲氧基五硅氧烷、Silane, [[4-[1,2-bis [(trimethylsilyl) oxy]ethyl]-1,2-phenylene]bis(oxy)]bis[trimethyl-、2,6,10,14-四甲基-十五烷。在空白对照中两个峰面积较大的色谱峰为十甲氧基五硅氧烷、2,6-二叔丁基对甲酚。其中十甲氧基五硅氧烷、十二甲氧基五硅氧烷、Silane, [[4-[1,2-bis[(trimethylsilyl)oxy]ethyl]- 1,2-phenylene] bis(oxy)]bis[trimethyl-可能是色谱柱的柱流失成分。 图1 果立鲜的挥发性物质总离子流图 Fig.1 Total ion chromatogram of volatile constituent of GLX 图2 CK的总离子流图 Fig.2 Total ion chromatogram of volatile constituent of of CK 2.2、龙眼保鲜功能微生物香气挥发性物质总成分 果立鲜香气的挥发性总成分共20种，见1，(测出成分为24种，其中4种可能为柱流 4 失的成分或其他干扰)。其中嘧啶1种，占总成份的40.67%，为2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶(40.67%)。烷类14种，占总成分的18.05%，包括十四烷(2.35%)、4,8-二甲基-十三烷(0.47%)、4-甲基-十五烷(1.45%)、2-甲基-十二烷(0.65%)、十八烷(0.44%)、2,6,10,14-四甲基-十五烷(1.50%)、正十七烷(1.82%)、4，6-二甲基-十一烷(1.64%)、十六烷(3.27%)、2-甲基-十五烷(1.02%)、5-乙基-2-甲基-辛烷(0.50%)、4-甲基-十五烷(1.45%)、4-环己基-十二烷(0.91%)、3-甲基-十四烷(0.58%)。烯类2种，占总成份的1.36%，包括α-柏木烯(0.63%)、(+)-长叶烯(0.73%)。醇类1种，占总成份的1.03%，为2-十四烷氧乙醇(1.03%)。酯类1种，占总成份的0.70%，为2-丙基-十四烷-亚硫酸酯(0.70%)。酚类1种，占总成份的0.45%，为2,4-二叔丁基苯酚(0.45%)。酮类1种，占总成份的0.31%，为6,10-二甲基-2-十一酮(0.31%)。 表1 龙眼保鲜功能微生物的挥发性成分 保留时间 名称 分子式 分子量 匹配度 相对含量 备注 2.109 C3H6O 58.04 64 0.08 英文名:Acetone 清洗萃 中文名:丙酮 取头残 留 13.467 C10H30O5Si5 370.09 95 2.26 英文名:Cyclopentasiloxane, decamethyl- 可能是 中文名:十甲氧基五硅氧烷 柱流失 17.643 C17H12ClN3O3 341.06 37 40.67 - 英文名: 2-Chloro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(4-nitrophenyl)pyrimidine 中文名:2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶 18.560 C13H26O 198.20 43 0.31 - 英文名:2-Undecanone, 6,10-dimethyl- 中文名:6,10-二甲基-2-十一酮 19.284 C14H30 198.24 96 2.35 - 英文名:Tetradecane 中文名:十四烷 19.691 C15H24 204.19 99 0.73 - 英文名: 1,4-Methanoazulene,decahydro-4,8,8-trimethyl-9-methylen e-, [1S-(1.alpha.,3a.beta.,4.alpha.,8a.beta.)]- 中文名:(+)-长叶烯 19.829 C15H24 204.19 94 0.63 - 英文名: 1H-3a,7-Methanoazulene,2,3,4,7,8,8a-hexahydro-3,6,8,8-t etramethyl-, [3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)]- 中文名:α-柏木烯 20.372 C18H36 252.28 58 0.91 - 英文名:Dodecane, 4-cyclohexyl- 中文名:4-环己基-十二烷 20.550 C15H32 212.25 74 0.47 - 英文名:Tridecane, 4,8-dimethyl- 中文名:4,8-二甲基-十三烷 20.647 C16H34 226.27 91 1.45 - 英文名:Pentadecane, 4-methyl- 中文名:4-甲基-十五烷 20.812 C15H32 212.25 76 0.58 - 英文名:Tetradecane, 3-methyl- 中文名:3-甲基-十四烷 21.433 C12H36O4Si5 384.15 28 33.52 英文名:Pentasiloxane,dodecamethyl- 可能是 中文名:十二甲氧基五硅氧烷 柱流失 21.738 C14H22O 206.17 87 0.45 - 英文名:Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl) 5 保留时间 名称 分子式 分子量 匹配度 相对含量 备注 中文名:2,4-二叔丁基苯酚 22.389 C11H24 156.19 55 0.50 - 英文名:Octane, 5-ethyl-2-methyl- 中文名:5-乙基-2-甲基-辛烷 22.558 C16H34O2 258.26 60 1.03 - 英文名:Ethanol, 2-(tetradecyloxy)- 中文名:2-十四烷氧乙醇 22.732 C16H34 226.27 95 1.02 - 英文名:Pentadecane, 2-methyl- 中文名:2-甲基-十五烷 22.884 C17H36O3S 320.24 91 0.70 - 英文名:Sulfurous acid, 2-propyl tetradecyl ester 中文名:2-丙基-十四烷-亚硫酸酯 23.463 C16H34 226.298 3.27 - 英文名:Hexadecane 7 中文名:十六烷 24.423 C13H28 184.22 74 1.64 - 英文名:Undecane, 4,6-dimethyl- 中文名:4，6-二甲基-十一烷 24.821 C16H30O4Si3 370.14 47 3.03 英文名: 可能是 Silane, 柱流失 [[4-[1,2-bis[(trimethylsilyl)oxy]ethyl]-1,2-phenylene]bis(oxy) ]bis[trimethyl- 中文名: 25.391 C17H36 240.28 96 1.82 - 英文名:Heptadecane 中文名:正十七烷 25.506 C19H40 268.31 93 1.50 - 英文名:Pentadecane, 2,6,10,14-tetramethyl 中文名:2,6,10,14-四甲基-十五烷 27.222 C18H38 254.30 95 0.44 - 英文名:Octadecane 中文名:十八烷 27.387 C13H28 184.22 86 0.65 - 英文名:Dodecane, 2-methyl- 中文名:2-甲基-十二烷 2.3、龙眼保鲜功能微生物挥发性物质高含量成分 果立鲜的挥发性物质中相对含量在1.00%以上的物质有10种，见表2，分别为2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、十六烷、1,2-phenylene]bis(oxy)]bis[trimethyl-1, 2-phenylene]bis(oxy)]bis[trimethyl-、十四烷、正十七烷、4，6-二甲基-十一烷、2,6,10,14-四甲基-十五烷、4-甲基-十五烷、2-十四烷氧乙醇、2-甲基-十五烷。 表2 龙眼保鲜功能微生物挥发性物质高含量成分 峰号 保留时间 名称 匹配度 相对含量 3 17.643 37 40.67 英文名: 2-Chloro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(4-nitrophenyl)pyrimidine 中文名:2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶 18 23.463 98 3.27 英文名:Hexadecane 中文名:十六烷 20 24.821 47 3.03 英文名:Silane, [[4-[1,2-bis[(trimethylsilyl)oxy]ethyl]- 1,2-phenylene]bis(oxy)]bis[trimethyl- 5 19.284 96 2.35 英文名:Tetradecane 中文名:十四烷 6 21 25.391 96 1.82 英文名:Heptadecane 中文名:正十七烷 19 24.423 74 1.64 英文名:Undecane, 4,6-dimethyl- 中文名:4，6-二甲基-十一烷 22 25.506 93 1.50 英文名:Pentadecane, 2,6,10,14-tetramethyl 中文名:2,6,10,14-四甲基-十五烷 10 20.647 91 1.45 英文名:Pentadecane, 4-methyl- 中文名:4-甲基-十五烷 15 22.558 60 1.03 英文名:Ethanol, 2-(tetradecyloxy)- 中文名:2-十四烷氧乙醇 16 22.732 95 1.02 英文名:Pentadecane, 2-methyl- 中文名:2-甲基-十五烷 2.4、龙眼保鲜功能微生物香气挥发物中高匹配度成分 果立鲜香气挥发物中匹配度在85%以上的成分有12种，包括(+)-长叶烯(99%)、十六烷(98%)、十四烷(96%)、正十七烷(96%)、2-甲基-十五烷(95%)、十八烷(95%)、α-柏木烯(94%)、2,6,10,14-四甲基-十五烷(93%)、4-甲基-十五烷(91%)、2-丙基-十四烷-亚硫酸酯(91%)、2,4-二叔丁基苯酚(87%)、2-甲基-十二烷(86%)。结果见表3。 表3 果立鲜挥发性物质高匹配度成分 峰号 名称 匹配度 相对含量 理化特性 英文名:1,4-Methanoazulene, decahydro-4,8,8-trimethyl-9-methylene-, 天然香料，具有松节6 [1S-(1.alpha.,3a.beta.,4.alpha.,8a.beta.)]- 99 0.73 油样的香气。 中文名:(+)-长叶烯 英文名:Hexadecane 18 98 3.27 - 中文名:十六烷 英文名:Heptadecane 21 96 1.82 - 中文名:正十七烷 英文名:Tetradecane 5 96 2.35 - 中文名:十四烷 英文名:Octadecane 23 95 0.44 - 中文名:十八烷 英文名:Pentadecane, 2-methyl- 16 95 1.02 2-甲基-十五烷 英文名:1H-3a,7-Methanoazulene, 2,3,4,7,8,8a-hexahydro-3,6,8,8-tetramethyl-, 具有柏木、檀香香气。 7 94 0.63 [3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)]- 中文名:α-柏木烯 英文名:Pentadecane, 2,6,10,14-tetramethyl 22 93 1.50 - 中文名:2,6,10,14-四甲基-十五烷 英文名:Sulfurous acid, 2-propyl tetradecyl ester 17 91 0.70 - 中文名:2-丙基-十四烷-亚硫酸酯 英文名:Pentadecane, 4-methyl- 10 91 1.45 - 中文名:4-甲基-十五烷 7 峰号 名称 匹配度 相对含量 理化特性 英文名:Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl) 是多种光稳定剂、抗13 87 0.45 中文名:2,4-二叔丁基苯酚 氧化剂的重要中间体 英文名:Dodecane, 2-methyl- 24 86 0.65 中文名:2-甲基-十二烷 在高匹配度的成分中，有三种化合物具有生物活性，分别为(+)-长叶烯、α-柏木烯(+)、2,4-二叔丁基苯酚。其中(+)-长叶烯(CH)、α-柏木烯(CH)这两种化合物是具有香气的15241524 成分，为天然的香料。2,4-二叔丁基苯酚(CHO)是多种光稳定剂、抗氧化剂的重要中间体。 1422 (1)(+)-长叶烯 匹配度为 99%，相对含量为0.73 ，分子式C15H24，分子量204.19，分子 结构式见图3。 常温常压下，为黏稠油状液体，折光率1.42,相对密度0.935，熔点156.2?， 沸点 250,265?。长叶烯是从重级松节油提取出来的一种天然香料，具有松节 油样的香气，具有特殊的化学活性，是合成树脂、合成香料、浮选剂和有机合图3 (+)-长叶烯结构 成的原料，利用长叶烯可生产制造异长叶烯，异长叶烯酮等产品，用于香精的 调配可代替某些价格昂贵的香料。 长叶烯具有木香气味，溶于甲苯，不溶于水， 是合成香味的一种极好的廉价材料，广泛用于长叶烯酯、长叶烷酮、长叶烷醇 等木香系香料的合成。 (2)α-柏木烯 匹配度为 94%，相对含量为0.63，分子式C15H24，分子量204.19，分子结 构式见图4。 主要存在于柏木油中，有α-，β-两种异构体。为微黄色液体。不溶于水， 溶于乙醇等有机溶剂。沸点262,263?(101.3kPa)。具有柏木、檀香香气。用途: 主要作为合成系列的柏木油衍生物，如柏木酮。柏木烯醇等香料。除此之外可图4 α-柏木烯结构 作为紫罗兰型、桂花型，素心兰型、东方型、皂用茉莉与香薇型的辅助原料， 是香精的一种合剂。 (3)2,4-二叔丁基苯酚 o 匹配度为87%，相对含量为0.45，分子式C14H22O，分子量206.17，分子结图5 2,4-二叔丁基苯酚构式见图5。 结构 无色至淡黄色结晶。物化性质，结晶点54-58?，沸点:265?，熔点:56?。 易溶于醇类、酯类、烷烃、芳香烃等有机溶剂，如乙醇、醋酸丁酯、汽油、甲 苯等。在水中的溶解度几乎为零。本品具有酚类物质的共同特性，遇光、受热、 接触空气时，色泽逐渐加深。主要用于制造天然橡胶及合成胶防老剂，塑料抗 氧剂，燃料稳定剂，紫外线吸收剂及农药、染料中间体等。本品在常温下气味 很小，随着温度上升，挥发性增加，有特殊的烷基酚气味。 8 3 结论与讨论 采用SPME-GC/MSD的方法分析果立鲜的挥发性物质成分。果立鲜香气的挥发性总成分共20种。其中嘧啶1种，占总成份的40.67%，为2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶(40.67%)。烷类14种，占总成分的18.05%，包括十四烷(2.35%)、4,8-二甲基-十三烷(0.47%)、4-甲基-十五烷(1.45%)、2-甲基-十二烷(0.65%)、十八烷(0.44%)、2,6,10,14-四甲基-十五烷(1.50%)、正十七烷(1.82%)、4，6-二甲基-十一烷(1.64%)、十六烷(3.27%)、2-甲基-十五烷(1.02%)、5-乙基-2-甲基-辛烷(0.50%)、4-甲基-十五烷(1.45%)、4-环己基-十二烷(0.91%)、3-甲基-十四烷(0.58%)。烯类2种，占总成份的1.36%，包括α-柏木烯(0.63%)、(+)-长叶烯(0.73%)。醇类1种，占总成份的1.03%，为2-十四烷氧乙醇(1.03%)。酯类1种，占总成份的0.70%，为2-丙基-十四烷-亚硫酸酯(0.70%)。酚类1种，占总成份的0.45%，为2,4-二叔丁基苯酚(0.45%)。酮类1种，占总成份的0.31%，为6,10-二甲基-2-十一酮(0.31%)。 果立鲜的挥发性物质中相对含量在1.00%以上的物质有10种，分别为2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、十六烷、1,2-phenylene]bis(oxy)]bis[trimethyl-1, 2-phenylene]bis(oxy)]bis[trimethyl-、十四烷、正十七烷、4，6-二甲基-十一烷、2,6,10,14-四甲基-十五烷、4-甲基-十五烷、2-十四烷氧乙醇、2-甲基-十五烷。 果立鲜香气挥发物中匹配度在85%以上的成分有12种，包括(+)-长叶烯(99%)、十六烷(98%)、十四烷(96%)、正十七烷(96%)、2-甲基-十五烷(95%)、十八烷(95%)、α-柏木烯(94%)、2,6,10,14-四甲基-十五烷(93%)、4-甲基-十五烷(91%)、2-丙基-十四烷-亚硫酸酯(91%)、2,4-二叔丁基苯酚(87%)、2-甲基-十二烷(86%)。 其中(+)-长叶烯(CH)、α-柏木烯(CH)这两种化合物是具有香气的成分，为天然的15241524 香料。(+)-长叶烯具有木香香味，具有特殊的化学活性，用于香精的调配可代替某些昂贵的香料。α-柏木烯具有柏木、檀香香气，主要作为合成系列的柏木油衍生物，可作为香精的合剂。而另一种化合物2,4-二叔丁基苯酚(CHO)是多种光稳定剂、抗氧化剂的重要中间体。在温1422 度高于常温时，具有特殊的烷基酚气味。该微生物产品具有很好的保鲜作用，且具有芳香的气味，是否与这三种化合物有关，还待进一步的研究。 参考文献: [1]梁建根.微生物挥发性物质的研究进展.现代农业科技[J],2008,23:172-173. 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