BHK21细胞培养平台在疫苗中应用（可编辑）

BHK21细胞培养平台在疫苗中应用（可编辑） BHK21细胞培养平台在疫苗中应用 BHK21 细 胞 培 养 平 台 在 疫 苗 中 的 应 用 高 飞 //0>.@merckgroup 默克密理博隶属于德国默克集团 主要内容 ? BHK21细胞培养技术平台 ? BHK21细胞培养口蹄疫病毒应用 ? BHK21细胞培养兽用狂犬病毒应用 2 2 2细胞培养技术平台细胞代谢 指谱 葡萄糖、 氨基酸 、乳 酸、氨 、 渗透压 等个性化细胞培养基 细胞系发 展 培养基优 化 生物反应器培养系统 稳定的高 产细胞 株 、细胞 无血清 、 无蛋白 、化学 限适应驯化 、驯 化 、改造 定培养基 细胞适应、驯化培养细胞培养工艺 细胞培养技术发展 生物反应器放大培养 过程优化 一次性物 品应用 过程控制 培养参数 、过程 模式 培养液袋 、取样 、接种 、快连接等 ……反应器优 化 热传递 、 剪切力 、混合 形式 、氧 传递效 率 根据“Mammalian Cell Culture Technology:An Emerging Field ”, D. Eibl, R. Eibl, 2009 整理 3 细胞培养技术平台 个性化培养基应用 清大天一 对应 清大天一 个性化CCM CCM 序号 细胞株 疫苗品种 常用基础基础CCM 代码 ( 低血清/ 无血清) DMEM MD202MD210 1 Marc-145 猪蓝耳 MEM MD600 MD611 2 ST 猪瘟 / 猪细小 MEM MD600 MD611/MD614 MEMMD6003 PK-15 猪圆环/ 猪细小 MD611DMEM MD202 MD611(转瓶贴壁培养) 口蹄疫/ 兽用狂犬 / 猪伪 4 BHK21 MEM MD600 MD910 (低血清悬浮) 狂 犬/ 猪乙型脑 炎 SAF200 (无血清悬浮) MEMMD600 MD611狂犬/ 甲肝 / 轮状病毒 / 5 Vero DMEM MD202 199 低血清培养基(MD503 、 手足口/ 乙脑 / 禽用疫苗 199MD500 MD504 、MD505 )二倍体 (MRC-5 、WI- 6 人用疫苗 MEM MD600 MD610 38 、2BS 、KMB17 ) 7 地鼠肾 (PHKC ) 人用狂犬 MEM MD600 MD504/MD611 8 鸡胚成纤维 (CEF) 猪伪狂犬 MEM MD600 MD611 无血清培养基/CD SAF108 、SAF110 、SAF112 9 CHO 重组蛋白/ 单抗 / 培养基 Cellvento CHO200/Feed-2004 细胞培养技术平台 个性化培养基-低血清培养基? 低血清培养原理 血清的作用提供有利于细 胞生长增殖所需 营养丰富的培养基是维持细胞活性 的各种生长因子和激素 及高密度生长的基础,营养缺乏容易提供有利于细胞贴壁所需的贴引起细胞 凋亡 附因子和伸展因子 新生牛血清中所含大部分营养成分提供可识别金属、激 素、维生可以通过化学成分明确的营养物质如 素和脂类的结合蛋白 氨基酸、维生素等成分组合取代 提供细胞生长所必需的脂肪酸 和微量元素 5 细胞培养技术平台 低血清培养Vero细胞 低 血 清培养 基与普 通199 培养基转 瓶培养Vero 细胞比 较 项目 MD504 普通199 小牛血清添加量 3% 10% 4 4接种细胞密度 (个/ 5×10 5×10 ml ) 细胞形态 梭形个体增大 梭形 8 平均细胞数 (×10 ) 8.8 6.2 6 细胞培养技术平台 低血清培养贴壁BHK21 细胞7 MD611 培养基 培养BHK21 细胞 的生长 情况( ×10 ) 细 胞 接种量 细 胞 数量 细 胞 数量 细 胞 数量 连 续 传代次 组别 (0h ) (24h ) (48h ) (72h ) 数 MEM 培养基 0.462 0.83 1.86 2.51 30 代 +10 %血清(对照组)MD 611 +2 0.387 0.68 1.84 2.2 30 %血清 代 MD 611 +3 %血清 0.403 0.752 2.28 2.04 30 代 9 15L转瓶细胞长满的数量可达3-4x10 个/ 瓶 7 细胞培养技术平台 低血清培养贴壁BHK21 细胞MD611 培养基培 养BHK21 细胞繁 殖口蹄 疫 病毒 的效价 第 一 次试验 第 二 次试验 第 三 次试验 平均值 组别 TCID LD TCID LD TCID LD TCID LD 50 50 50 50 50 50 50 50MEM 培养基 7.5 8 7.61 7.67 7.5 7.5 7.54 7.72 +10 %血清(对 照组) MEM SLM(MD611 ) 7.61 8.5 8.17 8 7.83 7.67 7.87 8 +2 %血清 MEM SLM MD611 8 8.33 7.83 8 7.61 7.67 7.83 8 ( ) +3%血清 8 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台个性化细胞培养基 BHK21 细胞低血清悬浮培养基(MD910 & MD920 ) 产品配方不含动物来源成分MD910 培养BHK21 细胞血清浓度可降低至2-3% MD920 用于病毒无血清维持培养BHK21 细胞无血清培养基(Cellvento? BHK-200 )不含动物来源成分实现细胞/ 病毒培养全过程零血清 BHK21 细胞无血清培养基 Cellvento? BHK-200 9 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 细胞选择、适应培养 BHK21 细胞贴壁 悬浮驯化、适应培养BHK21 细胞无血清悬浮驯化、适应培养 BHK21 细胞克隆 筛选BHK21 细 胞无血清连续适应培养 10 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 细胞培养工艺 培养模式 批培养 流加培养 灌注培养 BatchFed -Batch Perfusion 培养参数 搅拌转速、温度、pH 、DO 合适的接种密度、最佳 的细胞培养密度 11BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 生物反应器放大培养 工作细胞库 10L 1200L120L摇瓶 反应器 反应器 反应器 650L 反应器 4000L反应器 12 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 生物反应器培养过程 CIP SkidMuse Cell Analyzer 在 线 清 洗系 统 细 胞 自 动分析仪Integritest? 4NovaSeptum 滤 器 自 动完整性测试仪 一 次 性 无菌取样袋 13 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 生物反应器低血清悬浮培养BHK21细 胞 4000L 反应 器低血 清批培 养BHK21 细胞 70 100% 90% 60 80% 50 70% 40 60% 30 50% 20 40% Cell density 10 30% Cell viability 0 20% 0 24 48 72 96 时间小时 细胞培养48h 增殖了11 倍 1 4 5 活 细 胞 密度10 /ml 细胞活力 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 生物反应器无血清培养BHK21 细胞放大培养过程中各级反应器细胞的情况 反应器 起始体积L 接种密度 培养时间 h 培养体积L 细胞密度 增殖倍数 cells/ml cells/ml 10L 6 6 流加 3 0.62x10 48 7 2.84x10 10.7 120L6 6 流加 58 0.45x10 46 100 2.9x10 11.1 650L 6 6 400 0.54×10 48 400 5.8×10 10.7 批式 6 6 4000L 3000 0.5×10 48 3000 5.75×10 11.5 批式15 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 4000L反应器无血清培养BHK21 细胞生长曲线4000L 反应 器无 血 清培 养BHK21 细胞 80 100% 70 90% 60 80% 50 70% 40 60% 30 50% 20 40% Cell density 10 30% Cell viability 0 20% 0 24 48 72 96 时间小时 16 5 活 细 胞 密度10 /ml 细胞活力 BHK21 细 胞 培 养 技 术 平 台 4000L反应器无血清培养 BHK21细胞BioCRAD培训 650L 反 应器细 胞转移 至 4000L 反应器培养 现场 4000L 反应器现场 操作 17 BHK21 细 胞 培 养 平 台 应 用 广泛应用于动物疫苗的研究与生产 口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus ,FMDV ) 兽用狂犬病毒(Veterinary rabies virus ,RV 乙型脑炎病毒(Japanese B encephalitis virus ,JEV伪狂犬病毒(Pseudorabies virus ,PRV 18 主要内容 ? BHK21细胞培养技术平台 ? BHK21细胞培养口蹄疫病毒应用 ? BHK21细胞培养兽用狂犬病毒应用 19 19 19BHK21 细 胞 培 养 口 蹄 疫 病 毒 应 用 生物反应器低血清培养BHK21细胞应用应用生物反应器低血清悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒工艺技术于2008 年 成功实施了转让、应用开启了国内应用生物反应器生产兽用病毒疫苗的先河 20 BHK21 细 胞 培 养 口 蹄 疫 病 毒 应 用 生物反应器低血清培养BHK21细胞应用 细胞库细胞 细胞库细胞特点及经济效益比较 200ml 、2L 、 250ml 摇瓶 4L 搅拌瓶 项目 国外典型 工艺 低血清培 养工艺 30L反应器 10L 反应器 培养液 EMEM/GMEM+ MD910+2-3%NBS 5-10%NBS+TPB 100L 反应器 120L 反应器 放大比例 小(3-5 倍) 大 (5-10 倍) 300L 反应器 650L 反应器 生产周期 较长 短 1000L 反应器 4000L 反应器 反 应 器 低血清培养工艺 3000L 反应器 国 外 典 型放大程序 21 BHK21 细 胞 培 养 口 蹄 疫 病 毒 应 用 生物反应器无血清培养 BHK21 细胞应用应用生物反应器无血清悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒工 艺技术于2010 年 成功实施了转让、应用国际上首次实现应用无血清培养口蹄疫疫苗含血清培 养工艺 沉降排上清、更换维持液 病毒接种、维持培养 收获、下游工艺 细胞培养终端反应器 无血清培养工艺 无 需 换液, 过程更 加简便 ! 22 BHK21 细 胞 培 养 口 蹄 疫 病 毒 应 用? 生物反应器无血清培养 BHK21 细胞应用 优势 更高的安全性和 符合 监管 要求 无动物源性成分 更好的 过程稳定性 成份较为限定 的细胞培养基 较高的病毒滴度 无抗病毒抗体 缩短处理时间 无需检 测不同批次的血清 缩短处理时间 病毒培养前无需更换培养液 减少动物副反应 风险 更好的疫苗质量 下游纯化更 便利 上游简单 23 BHK21 细 胞 培 养 口 蹄 疫 病 毒 应 用 特点及经济效益比较 反 应 器无血 清悬浮 培养与 反应器 低血清 、转瓶 培养BHK21 细胞 经 济效 益对比 项目 转瓶培养 反应器低 血清悬 浮 培养 反应器无 血清培 养 血清使用 量3-10% 3-5% 0 毒价TCID /LD 7.0/7.5 7.25/7.2550 50 7.0/7.5 6 6 6 细胞密度 cells/ml 2.5-3.5 ×10 3×10 3×10 工作体积 1.5L 3000L3000L均一性 培养体积 小 ,需混合,批 培养体积 大 , 无 需 混合 ,批 培养体积 大 ,无 需 混合 , 批 间差间差大 间差小 小产品效力 不可控 稳定可控可控蛋白纯化 含血清 , 杂蛋白 含 量高 , 无血清 , 杂蛋白 含 量低 , 纯 化简 含血清, 纯化复 杂 纯化复杂 单配苗比例 需浓缩 稀释配苗 稀释配苗 产品质量 产品质量 较低 杂蛋白含 量低 , 产 品质量较 高 产品质量 较高劳动力需 求 多 少 少车间条件 要求 培养室面 积大 , 需 恒温 培养室面 积小 , 无 恒温要求培养室面 积小 , 无 恒温要求 设备与自 动化程 度 作坊式半 开放人 工 操作 全封闭管 道化的 自 动化控制全封闭管 道化的 自 动化控制24 主要内容 ? BHK21细胞培养技术平台 ? BHK21细胞培养口蹄疫病毒应用 ? BHK21细胞培养兽用狂犬病毒应用 25 25 25BHK21 细 胞 培 养 兽 用 狂 犬 病 毒 应 用 我国狂犬病情况 每年约有2000 人死于狂犬病 我国施行人员和动物平行免疫策略,消费了全世界约75-80 %人用狂犬病疫苗 国外免疫实践明,对狗进行全面免疫可有效控制狂犬病疫情 我国兽用狂犬病疫苗市场状况 大多使用转瓶培养BHK21 细胞生产, 无下游纯化手段,宠物疫苗市场基本被国外 疫苗厂商垄断 国内目前有10 多家兽用狂犬疫苗生产单位,但疫苗效力较低 我国目前约有1.3 亿只犬,2012 年批签发3900 万头份疫苗,免疫率仅30%* 灭活疫苗及纯化需求,需要大量的抗原 *根据2012 年中国疾病预防控制中心(CDC )及中国兽医药品监察所数据整理 26BHK21 细 胞 培 养 兽 用 狂 犬 病 毒 应 用 适应BHK21 细胞培养 的狂犬 固定毒 株 国际上兽用狂犬疫苗生产 病毒株 疫 苗 类型 备注 部分采用BHK21 细胞 PV-12 灭活苗 Pasteur virus strain 细胞培养与口蹄疫生产过程相似 CVS-11 灭活苗 Challenge virus strain 大体积搅拌式反应器培养 Flury LEP 减毒活苗 Low egg passage, 40-50 灭活苗 passage ERA 减毒活苗 Evelyn Rokitniki Abelseth SAD 减毒活苗 Street-Alabama-Dufferin 灭活苗 HK: Hamster kidney;BHK: baby hamster kidney; CEF: chick embryo fibroblast;DK: dog kidney;PK: pig kidney;bPL: b-propiolactone; EI: ethylenimine;AEI:acetylenimine; BEI: binary-ethylenimine;I: injectable; O: oral27 引自“Production methods for rabies vaccine ”, O Pe ?rez and CC Paolazzi,1997 BHK21 细 胞 培 养 兽 用 狂 犬 病 毒 应 用 国际上兽用狂犬疫苗生产 生 物 反 应器培养兽用狂犬病毒 (Biovet, Brazil ) 28BHK21细胞培养兽用狂犬病毒研究进展 无血清培养BHK21细胞 细胞:BHK21C13 (ATCC CLL10 ),结团式培养培养基:MDSS2 病毒:PV-Pairs 培养方式:灌注 病毒滴度检测:等效蚀斑形成单位(Equivalent plaque forming units, EPFU )实验组 对照组 29 BHK21 细 胞 培 养 兽 用 狂 犬 病 毒 应 用 低血清培养病毒敏感性实验 细胞:已适应低血清悬浮培养 的BHK21C13 细胞 培养液:BHK21 细胞低血清悬浮培养基+3%NBS 病毒:Flury LEP 结果 病毒最高效价达4.5lgLD /0.03ml 50? 无血清培养实验实验正在进行中 正常的BHK21 细胞接种病毒96h 的细胞 30反应器悬浮培养BHK21细胞生产兽用狂犬病毒工艺流程 复苏BHK21 细胞? 关键技术 BHK21 细胞悬浮培养基 摇瓶培养BHK21 细胞 狂犬病毒种毒 BHK21 细胞悬浮适应 病毒适应培养 10L 反应器培养BHK21 细胞 过程控制 病毒培养条件 120L 反应器培养BHK21 细胞 适应 BHK21 悬浮 培养的狂犬固定毒 650L 反应器培养BHK21 细胞 预计产能估算 (10L-120L-650L 单生产 线) 单批收获 500L 病毒悬液 650L 反应器培养狂犬病毒 生产周期 7 天/ 批 生产时间 300 天/ 年 下游灭活 、 纯化、配苗、 分装 年生产量 500L ×300 ?721000L2100 万ml 31