【word】 转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究

【word】 转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究 转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性 研究 第lO卷第5期 2011年9月 杭州师范大学(自然科学版) JournalofHangzhouNormalUniversity(NaturalScienceEdition) V0i.10NO.5 Sep.2011 DOI:10.3969/j.issn.1674—232X.2011.05.008 转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究 应奇才,徐祥彬,薛大伟,潘慧娟,王慧中 (杭州师范大学生命与环境科学学院,浙江杭州310036) 摘要:转wM2CP基因甜瓜的小鼠急性和亚急性毒性试验,致突变试验以及3Od喂养安全性分析试 验.其小鼠经口急性毒性半致死量LD.>90g/kg体重试验,明该转基因食品属实际无急性毒性物质;微核实 验和精子畸变实验及Ames实验均未发现有致突变作用;30d喂养试验,54,108,162g/kg体重各剂量组小鼠发 育,增重,食物利用率,血常规,脏体比及病理组织学等各项指标和基础对照组比较均无显着性差异.上述结果初 步表明转WMV-2CP基因甜瓜对小鼠没有毒性,属安全食品. 关键词:转基因甜瓜;WMV-2CP基因;毒性试验;致突变试验;喂养实验 中图分类号:S65l文献标志码:A 文章编号:l674232X(2011)05—0422-07 甜瓜(Cucumismelo)属葫芦科,一年蔓生草本植物,原产于非洲热带沙漠地区,大约在北魏时期随着 西瓜一同传到中国,明朝开始广泛种植.现在我国各地普遍栽培,果肉生食,止渴清燥,可消除口臭,但瓜蒂 有毒,生食过量,即会中毒.近年来,由于病毒病的危害,品质和产量不断下降,有些地区发病率高达 1009/6,造成较大经济损失.侵染甜瓜的病毒主要是西瓜花叶病毒2号,黄瓜花叶病毒和南瓜花叶病毒,其 中wMV一2是甜瓜病毒病中发病最严重的毒源,占田间病株90以上.随着基因工程技术的发展,将抗真 菌蛋白基因转入植物来提高农作物对真菌病害的抵抗能力.王慧中等口已将wMV一2病毒的外壳蛋白基 因(WMV-2CP)导人华南108甜瓜培育出甜瓜抗病新品种.攻毒试验表明,转基因的甜瓜对毒源有很强的 抗性;田间试种发现与未转基因对照相比,转基因株系较非转基因推迟wMV一2病毒发病时间,减轻发病 程度,显着减轻了病毒病造成的损失,具有良好的推广价值. 自20世纪9O年代中期抗除草剂转基因作物产业化以来,在政治家,社会活动家和消费者中间,特别 是在欧洲,对转基因食品的安全性忧虑不断增多.同样,转WMV-2CP基因甜瓜食品是否安全也须科学评 估,故本实验室在参考药物,食品添加剂的健康安全性评价的基础上],对转WMV-2CP基因华南108 甜瓜进行了毒性试验,致突变试验和小鼠30d喂养试验,获取了一些有效的实验数据. 1材料与方法 1.1实验材料 实验用ICR小鼠由杭州师范大学实验动物中心提供. 转’2CP基因甜瓜,未转基因华南108甜瓜由杭州师范大学生物化学与分子生物学重点实验室 收稿Et期:2011-o卜26 基金项目:浙江省自然科学基金项目(393105);钱江人才计划资助项目. 作者简介:应奇才(1965),男,浙江永康人,高级实验师,主要从事生物化学与免疫学研究.E-mail:yingqicai@163.corn *通信作者:王慧中(1962一),男,浙江义乌人,教授,博士,主要从事植物分子生物学研究.E-mail:whz62@163.com 第5期应奇才,等:转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究423 提供,实验前去皮去子,打成匀浆. 菌株TA.,TA.s,TA…TA由上海市劳动卫生与职业病防治研究所提供,生物学鉴定合格. 1.2急性毒性试验 选健康,成年,体重20g左右ICR小鼠40只,雌雄各半.随机分90g/kg体重转WMV-2CP基因甜瓜 剂量组和阴性对照组,每组20只,雌雄各半.取转WMV-2CP基因甜瓜匀浆,24h内灌胃分2次进行,而 后连续观察10d.10d后处死小鼠,观察小鼠的肝,肾,脾,胸腺等脏器的形态特征. 1.3亚急性毒性试验 选健康,成年,体重25g左右ICR小鼠4o只,雌雄各半.随机分转WMV-2CP基因甜瓜组和阴性对 照组,每组20只,雌雄各半.取转WMV-2CP基因甜瓜匀浆,每天灌胃1次,每次30g/kg体重,连续灌胃 14d,然后观察10d.10d后处死小鼠,观察小鼠的肝,肾,脾,胸腺等脏器的形态特征. 1.4致突变试验 方法参照《实用毒理学手册》L5]. 1.4.1微核试验 选健康,成年,体重25g左右ICR小鼠160只,雌雄各半.小鼠随机分15,3O,60g/kg体重3个转 WMV-2CP基因甜瓜剂量组,15,30,60g/kg体重3个正常甜瓜剂量组, 一个阴性组(水)和一个阳性对照 组(环磷酰胺80mg/kg体重),每组2O只,雌雄各半.小鼠间隔24h连续灌胃2次,第2次灌胃后6h处 死.取胸骨骨髓制成骨髓片,Gimsa染色.每只小鼠记数嗜多染红细胞1000只,计算微核率. 1.4.2精子畸变试验 选取健康,成年,体重25g左右雄性ICR小鼠8O只,小鼠随机分15,3O,60g/kg体重3个转WMV- 2CP基因甜瓜剂量组,l5,3O,60g/kg体重3个正常甜瓜剂量组,一个阴性对照组(水)和一个阳性对照组 (丝裂霉素C0.004mg/kg体重),每组10只.小鼠分别用转WMV-2CP基因甜瓜匀浆及对照甜瓜匀浆连 续灌胃30d,最后一次灌胃24h后处死,分别取两侧附睾,制成吸滤液直接涂片,伊红染色,高倍镜下观察 精子形态并计数,每只小鼠计数完整精子1000条,计算精子畸形发生率. 1.4.3Arues试验 试验菌株采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TATA..(移码型突变株)和TA..,TA.(碱基置 换型突变株).转WMV-2CP基因甜瓜匀浆过筛200目,用TA菌株的非代谢活性系统进行预试,结果在 剂量为15000fig~fill时未出现明显的抑菌或增菌现象,正式试验时选 择试验浓度为200O0,15000, 10000,5000,1000,250g/皿6个转WMV-2CP基因甜瓜剂量组,外加阴性对照和阳性对照.采用标准 平板掺人法,需要代谢活化时加入用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活化系统,37?培养箱孵 育48h,计数回变菌落数.实验重复3次. 1.5小鼠30d喂养试验 选取健康,成年,体重18~22gICR小鼠140只,雌雄各半,小鼠随机分54,108,162g/kg体重3个转 WMV-2CP基因甜瓜剂量组(A),54,108,162g/kg体重3个正常甜瓜剂量组(B),另设一个基础对照组 (基础饲料),基础饲料含热能1.73kJ/kg,水分7.43,粗蛋白22.64,粗脂肪4.85,粗纤维3.35, 粗灰分6.97,钙1.33%,磷0.76%,食盐0.55,无氮浸出物55.63,每组1O只,雌雄各半. 基础饲料配方:麦粉18,面粉18,黄豆粉18,玉米粉18,米粉18,鱼粉8,骨粉1,酵母 粉1;36g/kg体重转WMV-2CP基因甜瓜剂量组饲料配方:基础饲料配方中的18米粉用转WMV- 2CP基因甜瓜匀浆(甜瓜匀浆中平均含水8O,85,18米粉用3倍的甜瓜匀浆配制后烘干)代替;72g/ 体重转WMV-2CP基因甜瓜剂量组饲料配方:基础饲料配方中的 18%米粉及18%面粉用3倍的转 WMV-2CP基因甜瓜匀浆代替;108g/kg体重转WMV-2CP基因甜瓜剂量组饲料配方:基础饲料配方中 的18米粉,18%面粉和18Ot,米粉用3倍的转WMV-2CP基因甜瓜匀浆代替;36,72,108g/kg体重3 个正常甜瓜剂量组饲料配方同于转WMV-2CP基因甜瓜剂量组饲料配方,只是用正常甜瓜匀浆代替转 424杭州师范大学(自然科学版)2011伍 WMV-2CP基因甜瓜匀浆. 小鼠2只每笼饲养,自由进食饮水,饲料配比为体重的1O.连续观察30d,每周体重和进食量 并计算食物利用率,实验结束时断头取血,处死,对每只小鼠进行脏器大体观察,同时取肝,肾称重并计算 脏体比,对血进行血象,血生化检查. 取肝,肾,胃,肠组织分别固定在10的福尔马林中,石蜡包埋,间断连续切片,切片厚5m,HE染 色,对照组和实验组的切片同时进行染色,然后光学显微镜下观察对比. 检验组织损伤判别标准:正常组织为”一”,变形的组织按损伤程度的轻与重分成为”+”和”++”二个等级. 1.6统计学方法 各组计量资料以z-4-_S表示,数据处理采用DPS3.01中文数据统计 软件进行方差分析和单因素多重 比较.以P%0.O1表示显着性差异. 2结果 2.1急性毒性试验结果 喂养期间,所有小鼠均未见明显症状,没有死亡;观察小鼠的肝,肾,脾,胸腺等脏器均无异常变化,病 理检查各脏器均无异常改变,证明转WMV-2CP基因甜瓜对雌雄小鼠经口LD..均大于90g/kg体重,说 明毒性极微或没有毒性. 2.2亚急性毒性试验结果 喂养期间,所有小鼠均未见明显症状,没有死亡;观察小鼠的肝,肾,脾,胸腺等脏器均无异常变化,病理 检查各脏器均无异常改变,证明转WMV-2CP基因甜瓜毒性极低或没有毒性,对小鼠来说食用是安全的. 2.3致突变试验结果 2.3.1微核试验结果 转WMV-2CP基因甜瓜和正常甜瓜对小鼠微核率的影响见表1. 表1转基因和正常甜瓜对小鼠微核率的影响 Tab.1EffeetoftransgenicCucumismeioonmicronucleirateofmice 性别组别量鼠数嗜多红细胞数微核细胞数微核率 /bLg,n-5~3 雌性 雄性 阴性对照 转基因甜瓜 未转基因甜瓜 阳性对照 阴性对照 转基因甜瓜 未转基因甜瓜 阳性对照 2.1 1.8 1.9 2.0 1.8 2.1 1.9 36.4 1.9 2.0 2.1 2.1 1.8 2.1 2.2 35.8 加州加娜 OOOOOOOOO0OO0OOO???????????????? 加 0?????0????? 第5期应奇才,等:转WM2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究425 雌雄各剂量组(包括转M2CP基因甜瓜各剂量组和正常甜瓜各剂量组)与阴性对照组之间的微 千分率经t检验,P均>O.05,显示微千分率在雌雄各剂量组与阴性对照组之间无显着性差异;阳性对照 组的微千分率显着高于阴性对照组,经t检验,P<0.01,显示其差异有非常显着性意义.表明转WMV- 2CP基因甜瓜对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率未见明显影响,结果显阴性. 2.3.2小鼠精子畸形试验结果 转WMV-2CP基因甜瓜和正常甜瓜对小鼠精子畸形发生率的影响见表2.各转WMV-2CP基因甜 瓜剂量组与阴性对照组之间的精子畸形发生率经t检验,P>0.05, 显示小鼠精子畸形发生率在各转 WMV-2CP基因甜瓜剂量组和阴性对照组之间均无显着性差异;各 转WMV-2CP基因甜瓜剂量组与相 应正常甜瓜对照组之间的精子畸形发生率经t检验,P均>0.05,显示小鼠精子畸形发生率在转WMV- 2CP基因甜瓜各剂量组与相应正常甜瓜对照组之间均无显着性差异;阳性对照组与阴性对照组之间, 经t检验,P均do.o1,显示阳性对照组与阴性对照组之间达显着性差异.转基因甜瓜检测结果为阴性. 表2转基因甜瓜对小鼠精子畸形发生率的影响 Tab.2Effectoftransgenicwatermelononaberrantspermsrateofmice 驯鼠数精子数 畸形精子 无定形无钩胖头香蕉双头合计 畸变率/% 阴性对照0 转基因甜瓜15 30 6O 未转基15 因甜瓜 3O 6O 1O100OO16O765 丝裂霉素0.4×10101000050517312 2.3.3Arues试验结果 各菌落回变菌落数结果如表3所示.从表3可知,不同浓度受试物在加和不加s9条件下的回变菌落 与阴性对照组相近,阳性对照回变菌落数高于阴性对照回变菌落数2倍以上.转基因西瓜Ames试验检测 结果为阴性. 2.4小鼠30d喂养试验结果 结果如表4所示,试验期间小鼠生长良好,无异常征状和体征,也无死亡;血常规检查显示白细胞,血 色素均在正常范围内;生化指标(谷丙转氨酶,血清总蛋白,清蛋白,尿素氮,血糖)均在正常范围内_6];解剖 时大体观察未见异常,脏器系数各剂量组与阴性对照组比较无显着性差异. 2.5组织病理学观察结果 在光学显微镜下观察对照组和各剂量组小鼠的肝,肾,胃肠均未见有意义的病理改变(表5). 11111117 5887O859”“““n 5342551( 3O633O 5354O2 224653 59O259 566565 1111l1l 0OO0OO OOOOO0 OOOOOO OOOOOO {} OOOOOO 1l111l 9AA 2.7AF NaN3 2AAF 25O179?1O.2195?8.635--F_3.243?6.3159--+_12.3169~13?8251?12?3 30O?l7?z 1OOO173?1O.82O1?l3.836+_3.941--+-_5.4160~11.2178::E12?4233? 16?53O5?l5?l 5OOO179士15.62O8~12.63214.34O_+7.1155~14.6170~10-9245?12-529O?l8?9 1OO.O188?11.9196士 1O.937~3.746~----b4.2159~12.8171_+8?9252?14?3298?14?6 15OOO182土13.9193?15.731~4.139~3.O150_+15.4160~12?6251?12?9289?15?8 20OOOl7O?9.82O5?16.932~2.545?5.7162~12.9172~11?6239?15?43 O2?l8?4 25 20 1.5 10 MMC5 >300 >1000 转基因甜瓜54 108 162 未转基因甜瓜54 lO8 162 雄性基础对照 转基因甜瓜 未转基因甜瓜 162 11.2?5.526.8?4.152.74-_8.672.5?2.2534.2~1.427?O2?O?786?32?O?86 l1.4土 4.925.7?3.749.8~10.273.4~2.6831.8~1.247?32?O?856?98?O?79 11.8?3.826.3+4.554.6?11.272.9--+-_2.3532.7~1.227?52_+O?656?58?O_71 1O.9?4.227.13-3.952.8~10.874.6_-!-2.6833.1~1.637?23?O?626?96?O?93 lO.6?4.626.7?4.O55.3~9.673.14-I.9635.8~1.957?9l?l?O37?42?O?65 l1.9?3,924.3_--+-3.O57.8?1O.574.gig.0134.8~1.556?85~O?697?26?O?81 l5.8?4.536.7~4.281.4~10.872.34-I.6234.8~I.875?83~0,916?73?O?65 l4.2?3.337.5--+_5.O72.5?9.671.5土 1.7837.1?2.O16?35~1.237?2O?O’89 14.8?3.836.9~4.369.8?8.969.5?1.3437.5~2.586?45?1?186?59?O?76 14.7?2.736.4~4.O7O.6j=7.871.4~1.7836.5~2?347?O1?O?846?95?O_91 14.1?5,237.3?5.671.3-}=10.370.5?1.4935.1~3.126?81~0.947?28?O?7l 15.2?2.937.1~4.663.7?11.771.4--+-_1.4234.2土 1?967?1O?1?247?O1?O?48 14.5士4.O35.7?6.165.8~1O.569.8~2.2135.73--__2.166.58~0 一 .8 — 56,91 — +0,66 82崾 . 第5期应奇才,等:转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究427 雌性 雄性 基础对照 转基因甜瓜 未转基因甜瓜 基础对照 转基因甜瓜 未转基因甜瓜 3讨论 转基因食品(geneticallymodifiedfood,GMfood)是指利用基因工程技术改造基因组构成的食品L7], 为解决粮食短缺,资源匮乏,环境污染等问题提供了契机. 转基因食品在给人类带来巨大利益的同时,也给人类健康和环境安全带来潜在的风险.自斑蝶事 件【8报道以来,引起了人们的极大关注.因此,转基因食品的安全管理受到了世界各国的重视,其安全性 评价是安全管理的核心和基础之一.其中,转基因食品的毒理学评价,如免疫毒性,神经毒性,致癌性,繁殖 毒性以及是否有过敏源等是安全性评价的重要内容之一l-1... 当前转基因食品的安全性评价主要集中在水稻,玉米等粮食作物上,转基因甜瓜的安全性评价还未见 报道.通过对小鼠的急性毒性实验,微核实验,精子畸变实验及Ames实验发现,转抗除草剂基因(bar)水 稻属实际毒性极微或无毒类物质,表明转bar基因水稻对小鼠是安全的口.同样在转耐盐基因水稻和西 瓜中也得到相似结果[1?].但是据Finamore等口研究,在食用含5O转基因玉米(Mon810)饲料后, 断奶幼鼠(出生21d)和成年鼠(出生18,19个月)的肠和外周免疫反应出现了异常.其中,断奶幼鼠在连 续30d食用含转基因玉米饲料后,淋巴细胞,脾和血淋巴细胞的免疫表型都出现异常.成年鼠也在连续 90d食用含转基因玉米的饲料后,淋巴细胞和血淋巴细胞的免疫表型也出现异常,这意味表明转基因玉米 食品也可能会给人类健康带来不良影响.因此对转基因食品的商业化审批必须谨慎,同时应加强对转基因 食品安全性评价的研究. 通过转WMV-2CP基因甜瓜对小鼠的急性毒性试验,亚急性毒性试验,致突变试验和小鼠30d喂养 试验的结果表明,转WMV-2CP基因甜瓜对成年小鼠来说食用是安全的.该研究结果只是一个初步结论, 还需要对断奶幼鼠,成年鼠及连续多代食用转WMV-2CP基因甜瓜安全性作进一步的研究. 其实,转基因作物最大的危害是对作物本身.由于转基因技术的发展,各种优势基因都可以非常容易 地转到目标作物上,这对植物的多态性是一种伤害.而且,如果人类对植物的多态性保护不够,这种伤害是 不可逆的. .弘.弘 428杭州师范大学(自然科学版)2011钲 参考文献: [1]王慧中,李亚南,赵培洁.根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生[J].浙江大学:农业与生命科学版,2000,26(3): 287—290. E2]王慧中,赵培洁,周晓云.转基因甜瓜植株的获得及其抗病性[J].植物保护,2000,27(2):I26一l3O. [3]WHO.Healthaspectsofmarkergenesingeneticallymodifiedplants.[C]// RaportofaWHOWorkshop,Greneva:1993. [4]贾士荣.转基因植物的环境及食品安全性[J].生物工程进 展,1997,1(6):37—42. [5]纪云晶.实用毒理学手册[M].北京:中国环境科学出版 社,1991:93—121. [6]涂新明,木内吉宽.无菌ICR小鼠和普通ICR小鼠血液中生化正常值的测定和比较[J].中国实验动物学杂志,1996,6(2):91-93. [7]樊龙江,周雪平.转基因作物安全性争论与事实[M].北京:中国农业出版社,2001:1—2. [8]EwenS,PustaiA.Effectofdietscontaininggeneticallymodifiedpotatoese xpressingGalanthusnivalislectinonratsmallintestine[J]. Iancel,l999,354(9187):l353,1354. [9]LoseyJE,RayorIS,CarterME.Transgenicpollenharmsmonarch1arvae[ J].Nature,1999,399(6733):214. [10]邓平建.农业转基因生物食用安全性要示与评价[M].北京:人民卫生出版社,2008:46—63. [11]薛大伟,马丽莲,姜华,等.抗除草剂转基因水稻的安全性评价口].农业生物技术,2005,13(6):723727. [12]陈河,王慧中,赵文华,等.转mtlD/gutD基因稻米对大鼠性腺毒性的实验研究I-j].中国水稻科学,2007,21(4):341344. [13]王慧中,应奇才,钟国庆,等.转mtlD/gutD双价基因稻米对大鼠的毒性试验口].中国水稻科学,2004.18(3):208—212. [14]应奇才,薛大伟,徐祥彬,等.转WMV22CP基因西瓜的安全性评价[J].浙江农业科学,2009(5):966—970. [15]FinamoreA,RoselliM,BrittiS,ela1.IntestinalandperipheralimmuneresponsetoMON810maizeingestioninweaningandoldmice 11539. [J].JAgricFoodChem,2008,56(23):11533— SafetyAssessmentofTransgenicCucumisMelowithWMV-2CPGene YINGQi—cai,XUEDa, wei,XUXiang—bin,PANHui—juan,WANGHui—zhong (CollegeofLifeandEnvironmentSciences,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310036,China) resistanttransgenicCucumismelowa Abstract:Safetyassessmentofvirus— scarriedout.Toxicityexperiments,mutation experiments,and30一 dfeedingtestwereconductedonmicewithtransgenicCucumismelobearingWMV-2CPgene.The resultsshowthatoralLD5oformiceislargerthan90g/kgsothatthetransgenicCucumismelobelongstonontoxicfood.No mutationisfoundinmicronucleustest,spermiumaberrationtestorAmestest.Themicegroupswith54,108,162g/kg dosagehavegooddevelopmentin30dayfeedingtest.Noobviousdifferencesarefoundintheindexofweight,food utilizationrate,routinebloodtest,rateoforgantobody(weighttoweight),andpatho—histologicalobservationsbetween micefedwithorwithoutthetransgenicCucumismelo.Itshowsthattransgenic watermelonwithWMV-1CPgeneissafeto mice. Keywords:transgenicCucumismelo;M2CPgene;toxicityexperiment;mutationexperiment;feedingtest