共调节因子介导氯氰菊酯抗雄激素效应的机制研究

共调节因子介导氯氰菊酯抗雄激素效应的机制研究 研究生个人简介 性别:女 年龄: 英语:大学英语六级 已修学分:. 姓名:潘晨 学习及工作经历: ..,徐州医学院医学影像学专业,获医学学士学位 ..,徐州医学院流行病与卫生统计学专业,获医学硕士学位 研究生期间科研成果及获奖情况: 年,,一篇,已发表 年,,论文一篇,已发表 年, ,论文一篇,已发表 年, ,论文一篇,已接收年, ,论文一篇,已发表 年,获研究生国家奖学金 年,获江苏省普通高校研究生科研创新计划一项 年,获得东南大学第三届全国硕博论坛论文三等奖 年,获第十届全国多媒体课件大赛高教医学组优秀奖 年,获第十一届全国多媒体课件大赛高教医学组优秀奖 年,获江苏省高等学校优秀多媒体教学课件二等奖 年,获江苏省第九届教师现代教育技术应用作品大赛二等奖 年,获中国慢病及其危险因素调查工作“优秀调查员”称号目 录 缩略词表? 中文摘要 ? .?. 刮 吾 材料和方法材料方:法?. 结 果??. 讨 论??. 结仑??. 参考文献一 综 述??. 攻读硕士学位期间发表学术论文?. 致 谢??. 论文独创性声明论文使用授权声明? 论文审阅认定书??徐州医学院硕士学位论文 缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 雄激素受体 雄激素效应元件 双酚氯霉素乙酰转移酶 氯氰菊酯 结合域 内分泌干扰物 美国环境保护署 的黜 雌激素受体 促卵泡成熟激素 也激素效应元件配体结合域 促黄体激素 ? 核受体核受体共抑制因子 , ’ ’二氯二苯二氯乙烯 僻 双氢睾酮 洳 受体相互作用区域 甲状腺受体 .类固醇激素受体激活因子 徐州医学院硕士学位论文 甲状腺激素受体沉默调节因子 印睾酮 徐州医学院硕士学位论文 共调节因子介导氯氰菊酯抗雄激素效应的机制研究 中文摘要 环境内分泌干扰物 ,这一概念从世 纪年代被提出,目前仍然是国内外关注和研究的热点及重点。我国是农药生产 和使用大国,其中拟除虫菊酯类农药的使用呈上升趋势。研究表明拟除虫菊酯类 农药是一类,其抗雄激素效应及其所引起的男性生殖健康问题逐渐受到重视 和关注。氯氰菊酯是拟除虫菊酯类农药的一种,资料显示氯氰菊酯具有抗雄激素 效应和雄性生殖毒性。我们前期的研究结果表明,氯氰菊酯可损伤雄性大鼠生殖 系统。进一步的机制研究显示该农药可以抑制雄激素受体氨基端 /羧基端相互作用。但与转录激活密切相关的共调节因子是否参与 了氯氰菊酯的抗雄激素效应尚未见报道。本研究主要应用哺乳动物双杂交实验揭 示信号通路中共激活因子类固醇激素受体共激活因子.和共抑制因子 甲状腺激素受体沉默调节因子加灯、核受体共抑制因子在氯氰菊酯 抗雄激素效应中的作用。 目的 建立哺乳动物双杂交实验,用于研究与共调节因子的相互作用,并 应用该方法研究氯氰菊酯对与共调节因子相互作用的影响,阐明氯氰菊酯是否 通过干扰共调节因子的募集产生抗雄激素效应,并引起雄性生殖毒性。 方法建立以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的哺乳动物双杂交实验。 将表达氨基端质粒.、表达共激活因子质粒..和报告基因 质粒.共转染细胞,转染后用氯氰菊酯染毒,通过检测该物质作用 下的蛋白表达水平,研究氯氰菊酯是否抑制和.的相互作用。将表 达氨基端质粒.、表达共抑制因子质粒.或和报 告基因质粒.共转染细胞,转染后用氯氰菊酯染毒,通过检测该物 质作用下的蛋白表达水平,研究氯氰菊酯是否促进和共抑制因子、徐州医学 院硕士学位论文 的相互作用。 结果研究氯氰菊酯对.的作用时,氯氰菊酯在.。浓度范围 内使的表达量降低,在石时差异有统计学意义,结果表明氯氰菊酯可能 抑制与共激活因子.的相互作用;研究氯氰菊酯对共抑制因子和 的作用时,氯氰菊酯在刁巧浓度范围内使的表达量升高,在 巧时差异有统计学意义,结果表明氯氰菊酯可能增强与共抑制因子 和的相互作用。 结论氯氰菊酯属于拮抗剂,可能通过抑制与共激活因子.的 相互作用,并增强与共抑制因子和的相互作用产生抗雄激素效 应,从而引起雄性生殖毒性。对共激活因子和共抑制因子的影响是氯氰菊酯 抗雄 激素效应发生的重要分子机制。 关键词氯氰菊酯:雄激素受体:共激活因子;共抑制因子;哺乳动物双杂 交实验 徐州医学院硕士学位论文. , .. . , . . ? ., 心 . , . , . ,. ? ? ,. ? 。 , .徐州医学院硕士学位论文 .?? . ,. . ,, . . 一,. .. .一. . ; ; ;. ; ; 徐州医学院硕士学位论文 .?‘? 翮 舌 自世纪年代初期开始,环境内分泌干扰物 ,的潜在危害就受到了广泛关注。可能通过各种途径进入 人体,作用于生殖系统,导致生殖功能损伤,人类精液质量和数量下降,引起不 孕不育、自然流产等生殖危害的发生率升高。还可能引起乳腺癌、卵巢癌、 前列腺癌和睾丸癌等内分泌相关肿瘤的发病率升高【。 对的作用机制研究发现,主要通过影响核受体发挥作用, 包括雌激素受体风、雄激素受体和甲状腺素受体。因为雄激 素和在男性精子发生和发育过程中发挥重要作用翻,因此抗雄激素效应 的最终结局是导致生物体的雄性生殖障碍,包括精子数量和质量下降、隐睾、雄 性性征丧失等,引起男性不育发病率日益上升,与目前出现的男性生殖健康问题 密切相关【】。 我国是农药生产和使用大国,过量使用的问题十分严重。近年来,随着某些 高毒有机磷农药的禁用,氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的使用范围不断扩大,使 用量逐年增加,人类的接触机会和接触量也逐渐增多。因此对氯氰菊酯抗雄激素 效应的研究具有重要的现实意义。 氯氰菊酯是一种广泛用于控制室内外的害虫的型拟除虫菊酯类农药‘】。氯 氰菊酯主要是通过其生产、运输、储存和应用等途径而释放到环境中的,是重要 的环境污染物之一。氯氰菊酯可以通过以下几种途径进入人体:吸入含氯氰菊酯 的空气;摄入有氯氰菊酯残留的食物和蔬菜以及由皮肤直接接触氯氰菊酯。氯氰 菊酯可能会给人类的健康带来一定的危害。有研究证明氯氰菊酯导致雄性生殖系 统的损伤,主要包括睾丸的损害、精子数减少、精子运动能力改变和精子形态学 的畸形【甜】。由于雄性性征的发育和精子的发生都依赖于雄激素和】,氯氰菊 酯产生抗雄激素效应,引起的雄性生殖毒性机制可能与介导的信号通路有关。徐州医学院硕士学位论文 已有应用报告基因实验图,对氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的作用 机制进行初步探讨的相关报道,结果它们可能通过介导抑制其转录活性, 引起雄激素靶基因的下行调节,具有抗雄激素效应【肛。因此,氯氰菊酯属 的一种,可通过介导产生抗雄激素效应,引起雄性生殖毒性。因此深入地研究 拟除虫菊酯农药通过介导抗雄激素效应的机制,具有重要的理论价值。 属于核受体超家族成员,由包含转录激活域的氨基端, 结合域,铰链区以及包含转录激活域的配体结合域 组成【】图。研究表明,调节基因的表达是一个复杂精密的信号转导过程, 包括配氨基端和羧基端/相互作用活化、共调节因子募集等 图。其中任一个环节受影响,都将抑制雄激素靶基因表达,导致机体损伤【。 有研究证明的转录需要 /的直接相互作用【。配体如睾 酮或者双氢睾酮诱导 /相互作用,能够对配体复合 物起稳定作用,减缓配体解离,降低退化进程,增强转录活性【。因此; 相互作用对配体依赖性转录功能起着非常重要的作用。铰链区的 突变损害到/的相互作用,可以明显抑制的活性,表明/ 相互作用的重要性【。雄激素激动剂可以诱导/相互作用,雄激素拮 抗剂可以抑制/相互作用,阻止的二聚体化或者引起关联蛋白 的解离,这些都是转录激活所必需的【。我们的前期研究结果显示,氯氰菊 酯可以通过抑制的/相互作用干扰介导的信号通路,最终导致 相关基因表达降低,产生抗雄激素效应,这是氯氰菊酯引起雄性生殖毒性的 重 要的分子机制之一。 除/的相互作用,介导组织对雄激素的特异应答还需要共调节 因子的参与而完成【。共调节因子是与转录激活功能相关的蛋白质因子, 可以增强或抑制的转录,但没有与直接结合的能力【】。近年来,越来越 多的蛋白质被认定为共调节因子【。它们通过在靶基因启动子区促进的 占位、染色质塑形、充当与多聚酶相关的基因转录因子或识别直接提徐州医 学院硕士学位论文 高基因表达来影响介导的基因转录。配体定位和启动蛋白与蛋白间的相互 作用的级联反应,如目标启动子染色质结构逐步重塑、补充基础转录机制、 引发 聚合酶的活性,这些都与的共调节因子有关‘们。共调节因子从功能 上可以分为共激活因子和共抑制因子两大类,促进 转录者为共激活因子,抑制转录者为共抑制因子。 按照分子结构和功能的相似性,可将已发现的共激活因子分为个家族【】: .类固醇受体辅助活化因子 ,家族;.信 号转导和转录激活因子抑制蛋白 ,家族:。.肌动蛋白结合蛋白 一 家族;.与稳定性有关的辅助 激活因子 ;.影响 细胞核.细胞质转位的辅助激活因子 ;与染色质塑型相关的辅助激活因子 ; 细胞信号通路成员 。 研究显示,。是转录所必需的共激活因子,和.的相互作用 能增强的转录功能。。组蛋白及染色体结构改变在转录调节过程中起主要 的作用。与转录激活密切相关的共激活因子类固醇激素受体共激活因子 .具有组蛋白乙酰基转移酶活性‘,可通过对一种染色体组蛋白乙酰转移 酶/的修饰,使染色体的构象改变,影响其他共调节因子的聚集达到调节 转录的作用【 。另有一些共激活因子通过磷酸化/去磷酸化作用,改变的 磷酸化状态来调节的转录活性。.包含两个固有的激活结构域:、 图。其中富含组蛋白乙酰转移酶,而富含甲基转移酶。研究 表明,敲除彻底消除了.的作用,而敲除却出现了.活性的 增耐。共激活因子具有组蛋白乙酰转移酶活性,可使染色质中组蛋白端 赖氨酸残基乙酰化,从而改变核小体构象和稳定性,增强前转录起始复合物 的形 徐州医学院硕士学位论文 成,增强靶基因的转录。在共激活因子的作用下,即使雄激素的浓度非常低 也能发挥足够的转录活性【。抗雄激素抑制了/.之间的相互作用,降低 的稳定性,增加雄激素从上解离的速度,失去结合域以及由雄激素 诱导的转录活性。 共抑制因子是与转录抑制功能相关的蛋白质因子,可在组蛋白脱乙酰 化酶的作用下使染色质的组蛋白去乙酰化,对未结合配体的起沉默作用,从 而 抑制介导的转录。其转录机制主要包括【】:抑制的结合或核转位; 与组蛋白乙酰转移酶结合;抑制与共激活物的相互作用:干扰 端与 端的相互作用;抑制靶位点的转录等。核受体共抑制因子、维生素类 与甲状腺激素受体沉默调节因子或是最典型的两个共抑制 因子】。对与的募集,能够抑制激动剂诱导的雄激素调控基 因、、.和的表达【。最早是在酵母双杂交系统中 研究与维甲酸/甲状腺受体相互作用蛋白时发现的。其本身不具有与结合的 能力,通过与有结合能力的转录因子相互作用被募集到转录复合物中,从而 抑制转录发生。对许多核受体的活性具有抑制作用,对平衡体内激素的平衡 具有重要意义【。是非配体化的主要结合蛋白,属于辅阻遏子超 家族成员。与结合,并与配体结合区的共抑制因子作用位点作用,抑 制的转录活性,而这个位点又恰好与某些共激活因子的受体作用位点重合, 形成“共激活因子一共抑制开关”,二者的相对水平与的活化状态密切相关 四。 在调控靶基因转录过程中,涉及.、和等共调节因子 的作用,通过增加或减少共调节因子的募集,调控基因的表达。激动剂的 作用将导致共抑制因子与解离,同时募集共激活因子,促进靶基因转录。一些 抗 雄激素物质可能通过抑制共激活因子与结合,同时促进和等共 抑制因子的作用,从而抑制转录活性。 我们的前期研究表明氯氰菊酯是拮抗剂。进一步的机制研究发现,氯氰菊 酯能拮抗诱导的 /相互作用。作为拮抗剂,氯氰菊酯还可 徐州医学院硕士学位论文 能通过抑制共激活因子与结合,并促进共抑制因子与结合,从而抑制靶 基因的转录激活,进一步影响细胞增殖等生物学效应图。但目前尚未见氯氰 菊酯等拟除虫菊酯类农药干扰共调节因子募集的研究报道。本研究应用哺乳 动物 双杂交实验,揭示氯氰菊酯作为拮抗剂对与共激活因子.和共抑制 因子、相互作用的影响,将扩宽抗雄激素效应分子机制研究的领域, 为其他环境抗雄激素的研究提供新的思路和技术平台。 双杂交实验是用于检测蛋白.蛋白之间的相互作用的研究方法【卅。酵母双杂 交实验检测酵母细胞内蛋白质间的相互作用【。哺乳动物双杂交实验可以用于研 究哺乳类动物蛋白间的相互作用,比酵母双杂交实验具有更大的优势】。另外, 在检测雄激素和抗雄激素活性方面哺乳类实验比酵母类具有更高的灵敏度,因此 哺乳类双杂交实验是用于研究/相互作用以及/.、/、 /相互作用的理想方法【唰】,其示意图见图。在此系统中,一种感兴趣 的蛋白与结合结构域构成融合蛋白,另一种蛋白与单纯疱疹病毒 蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体 共同转染哺乳动物细胞系。报道质粒含一个结合位点下游的基因。 假如两个融合蛋白相互作用则报道基因表达水平明显增高。 为研究拟除虫菊酯类农药对共激活因子.和共抑制因子、 的效应,我们建立了哺乳动物双杂交实验。因文献报道.主要作用于氨 基端,因此仅建立了用于研究.与氨基端相互作用的哺乳动物双杂交实 验。将共激活因子.羧基端?个氨基酸碱基序列插入质粒, 构建融合表达载体..,将氨基端.个氨基酸碱基序列插入质粒 ,构建融合表达载体,将融合表达载体、? 和报告基因质粒.共转染细胞,转染后用氯氰菊酯染毒,通过检测 该物质作用下的蛋白表达水平,研究氯氰菊酯是否抑制和.的相互 作用。 但共抑制因子与的作用位点文献报道不一致,氨基端和羧基端都可能徐州医 学院硕士学位论文 存在共抑制因子的结合位点,因此在研究与共抑制因子的作用时,建立了两 种 哺乳动物双杂交实验,分别用于研究共抑制因子与氨基端和羧基端的作用, 以 明确共抑制因子在上的结合部位。将共抑制因子 个氨基 酸碱基序列插入质粒,构建融合表达载体.,将融合表达载体 、?和报告基因质粒.共转染细胞,建立哺乳动 物双杂交实验,用于研究与氨基端是否存在相互作用。另外将 个羧基酸碱基序列插入质粒,构建融合表达载体., 将羧基端个氨基酸碱基序列插入质粒,构建融合表达载体 将融合表达载体.、.和报告基因质粒.共转染 细胞,用于研究与羧基端是否存在相互作用。通过检测两种双杂交实 验系统中的蛋白表达水平,明确与相互作用的位点为氨基端还是 羧基端。将筛选出的哺乳动物双杂交实验用于研究氯氰菊酯是否促进和 的相互作用。 将共抑制因子 个氨基酸碱基序列插入质粒,构建融 合表达载体,将融合表达载体、和报告基因质粒 .共转染细胞,建立哺乳动物双杂交实验,用于研究与氨 基端是否存在相互作用。将 .个氨基酸碱基序列插入质粒,.和报告 构建融合表达载 .,将融合表达载体、 基因质粒。共转染细胞,建立哺乳动物双杂交实验,用于研究 与羧基端是否存在相互作用。通过检测两种双杂交实验系统中的蛋白表 达水平,明确与相互作用的位点为氨基端还是羧基端。将筛选出的哺 乳动物双杂交实验用于研究氯氰菊酯是否促进和的相互作用。 本研究探索氯氰菊酯抗雄激素效应涉及的主要分子机制,揭示该农药是否可 通过影响共激活因子及共抑制因子与之间的相互作用引起抗雄激素效应,阐明 信号通路在氯氰菊酯抗雄激素效应中的作用,为揭示拟除虫菊酯类农药的抗雄 激素效应机制提供重要依据,并为其他化学物质研究提供新的思路。 徐州医学院硕士学位论文 图 受体报告基因试验原理应用基因重组技术,将报告基因置于外源性的调控之下,构建重组报告基因质粒, 同时构建受体表达质粒,应用基因共转染技术将两种载体导入真核细胞内。某些激素或具有 激素活性的化学物作为一种配体,特异地与受体结合形成配体.受体复合物,解离,受体发 生构象改变并二聚体化。这种二聚体化的复合物与重组报告基因质粒中的结 合,激活报 告基因,触发基因转录形成,进一步翻译为蛋白质,通过检测报告基因编码的 酶活性或蛋白表达的变化,可以间接反映作用下内源性基因的表达情况。徐州医学院硕士学位论文一 一 ????? 硒 ? . . ? 醇 图核受体结构区域 典型的核受体分/、、、、五个结构区,其中区对应于结合域, 主要功能是识别靶基因上具有增强子性质的特异的序列.激素效应元件并与之 结合,调节效应基因的转录:区为配体结合域,主要与配体结合有关。 图 信号通路转导示意图 雄激素进入细胞后,与结合形成配体.受体复合物,识别核中雄激素效应元件舢地 并与之结合,激活靶基因转录。在信号通路中,介导组织对雄激素的特异应答是通过 与其相互作用的共调节因子共同完成的。 徐州医学院硕士学位论文 匝 一 酣 图 结构示意图 一包含两个固有的激活结构域:、。其中富含组蛋白乙酰转移酶,而 富含甲基转移酶。研究表明,删除彻底消除了.的作用,而删除却出现 了.活性的增强。 图氯氰菊酯可能的作用机制示意图 氯氰菊酯进入细胞后,竞争结合,通过抑制/端相互作用阻碍聚 化,在核内可能通过抑制共激活因子与结合,促进共抑制因子与结合从而抑制靶基 因的转录激活,进一步影响细胞增殖等生物学效应。 徐州医学院硕士学位论文图哺乳动物双杂交试验原理?嘲 哺乳动物双杂交系统是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。在 此系统中,一种感兴趣的蛋白与结合结构域构成融合蛋白,另一种蛋白与单纯疱疹 病毒蛋白的激活结构域以融合蛋白形式表达。表达这些融合蛋白的载体与一个报告基因 的表达载体共同转染哺乳动物细胞系。报告质粒含一个结合位点下游的基 因。假如两个融合蛋白相互作用则报告基因表达水平明显增高。此系统能在哺乳动物细 胞更好地模仿体内的蛋白.蛋白相互作用,比酵母双杂交系统更真实的反映 体内的蛋白间相互 作用。 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 材科 .细胞 .细胞株,购于中国医学科学院上海分院细胞研究所。 .质粒和菌株 哺乳动物双杂交试剂盒包含、和质粒,为公司 产品,质粒图谱见图,质粒图谱见图。?为产品, 质粒图谱见图。重组质粒、一由吉尔生化上海有限公司 构建。重组质粒?.、、?由生工生物工程上海有限 公司构建。大肠杆菌,本实验室保存。徐州医学院硕士学位论文 她 卿 拦量们副露副? ‘ 《: 一??????土 . 玎 豫丁.丁. 羔 靠而登.帅哪 ?蜀蔚鬲爵;嗣嘣?蕊丁 霄? 图 质粒克隆载体及多克隆位点质粒图谱 将目的基因插入载体,并与其上的 ?.融合表达。徐州医学院硕士学位论文 撼妇 町 :????崎?? 矗《..黏心嚣强翦 矗黼矗盯矗矗 敞潋撕强西 百夏 盯 瞄 。 啤翻译耋幻争 ?? ? ? 丁叁篓霎茧叠工鼍堑篓壅耋?昼匿耍叠骢于。百 黜 丽 薹蕲砑酗尊?葡 图 质粒 .克隆载体及多克隆位点图谱 将目的基因插入载体,并与其上的 ..融合表达 徐州医学院硕士学位论文 踟 趟。徽哟婶 ?。.丝? 公司产品 公司产品 ~公司产品 质粒提取试剂盒 公司产品 粉末 公司产品 公司产品 丙酮酸钠 公司产品 徐州医学院硕士学位论文 公司产品 上海苏懿化学试剂有限公司 双链霉素 碧云天生物技术研究所 双氢睾酮, 公司产品 尼鲁他明 公司产品 氯氰菊酯 公司产品 质粒转染试剂盒 ”, 公司产品 测试系统 公司产品 试剂盒 碧云天生物技术研究所 试剂盒 公司产品 引物和全基因合成 生工生物工程上海有限公司 .仪器 超净工作台 苏州净化设备厂 培养箱 德国公司 倒置相差显微镜 日本公司 台式高速低温离心机. 美国公司 仪. 美国 公司 美国公司 紫外可见分光度计一 全自动酶标仪 美国.公司 .?超低温冰箱 美国公司 .?冰箱 青岛海尔股份有限公司 电热恒温鼓风干燥箱. 上海君竺仪器制造有限公司 涡旋振荡器 上海奥然科技有限公司 磁力搅拌器 上海.仪器有限公司 电热恒温三用水箱 上海跃进医疗器械厂 全自动雪花制冰机 常熟市雪科电器有限公司 徐州医学院硕士学位论文 昆山市超声仪器有限公司 超声波清洗器 稳流稳压电泳仪. 南京大学南达生物技术开发公司 手提紫外分析仪. 上海培清科技有限公司 电子天平砌. 上海良平仪器仪表有限公司 孔板 公司 孔板 公司 方法 .某些试剂的配制 .. 液的配制 按照书每包粉末用 双蒸水,磁力搅拌器搅拌并充分溶 解,过滤除菌,室温保存。 ..用液配置胰酶 称取.克胰蛋白酶,加入预先配好的液内,磁力搅拌器搅拌,使胰酶溶 解。然后称取.,加入胰酶溶液内,搅拌器继续搅拌。 待胰蛋白酶完全溶解,再加入一定量的约调值至.。 过滤除菌,.?保存。 .. 培养基的配制及细菌培养平板的铺制 纯水中加入胰化蛋白胨,酵母提取物, ,搅拌至溶质完 全溶解,定容至,高压下蒸气灭菌,保存备用。配制固体 培养基时,每液体培养基中加入琼脂糖,高压下蒸气灭菌。高压后取 出培养基,轻轻晃动使溶解的琼脂糖均匀分布在整个培养基中。培养基降温 至 拘量将培养基倾倒入直径 左右时,按/的量加入‘,以/ 的培养皿中,铺制含的选择性平板,同时制备不含‘的平板。 .. ./的溶液 纯水中加入 .,搅拌至完全溶解,定容至,取部分溶液加徐州医学院硕士学位论文 入甘油,配制甘油含量为%的溶液。高压下蒸气灭菌, 保存备用。 .. 缓冲液‘, 。纯水中加入.,? .,搅拌至完全溶解,用盐酸调至.,定容至。取过滤除菌, 保存备用。 .. 标准品的配制 标准品、尼鲁他明、氯氰菊酯均溶于无水乙醇,配置成.的母液, .贮存,临用前稀释至所需浓度。染毒时培养液中溶剂含量不超过.%/。 .质粒?、、?、一、、一 、的构建与测序 .. 质粒?的构建与测序 合成羧基端个氨基酸的碱基序列插入质粒,插入位点为 ,由吉尔生化上海有限公司构建,其基因序列如下: 煎垒坌丛垒曼曼垒垦璺丝塑丛童鱼坌垡塑丛垒璺垦垦盟垦垒曼笪曼曼垦曼垒垒曼垒 醛 璺鱼旦垒鱼昼垦鲢垦鱼曼垒墼垦 醛匹鱼曼垦鱼垒坌垒堑垒垦堡垒垒鱼璺曼目堕曼璺堑玉曼垦盟丝垒丝垦坌璺 垒选必垦垒垦圣堡垒坌塾鲢垒垒坌璺醛鲢堡垒垒醛垒垒塑垒坌笪曼鲢堡堑垒垒鱼垒垒曼丛垒鱼竖鲢垒坌 垒壁垒垦堑坌垒毡垦墼型匹垒璺丛鱼?坌堑童煎堡垒丛曼曼堑 坌丛曼垒曼曼缝选坌垫星昼曼曼 堑亟垡垦殳笪昼坌曼垒璺堑璺 盟笪璺目旦瞳垒鲢坌曼曼璺丛鱼垒曼曼垦昼垒垒鲑垒垒垦垒曼垒垂垂曼坌噬垒 曼墨坌?童丛丛堡垒垒垒世煎丛曼曼邋垒垒璺鱼曼曼垒塑笪?塑鲢垒堑垒塑曼垒坌丛垒鱼煎曼垒曼畦旦丝昼 垒垦 丛垒童垒垒垫堑曼圣垒垦垒垒垡垒丝查圣垒堡堕垒垫坌《簋亟坌丝坌亟垒目堕堑鲢坌坌笪 堑堡垒鸯 鱼垒垒垫塑丛曼鱼曼坌星堑 蕉童丛垒塑垦璺受睦丛垒垒曼垦垡鱼垦曼璺垒垦垒垒?丛噬曼曼醛垒蛭篷垒墨丛垒垦垒垒垒 璺丛曼垒鲢坌墨坌堑笪垒曼垒童曼童垦鲢垒坠墼垦曼竖堑堪垒曼艇垒垒塑薹曼曼垫垦皇堑曼圣垒丝垒丛曼笙醛 .徐州医学院硕士学位论文 ..质粒的构建与测序 合成氨基端个氨基酸的碱基序列插入质粒,插入位点为 ,由吉尔生化上海有限公司构建,其基因序列如下: 曼鱼坌曼堡璺垒堡垒丝曼垦垒丛亟昼墨曼曼垒垦曼笪垒垦曼垒垒垒曼坌堑璺曼堑曼曼垒璺曼垒圣 垒垒煎堑昼蝗堑鲢垒鱼圣塑.曼堡壁鱼鲢鱼鱼【堂墨鱼垒鱼垒曼曼垦鱼垒璺堡垒曼堡垒鱼垒垒昼 堡丛蕉丞堡坌鸯立丛鱼亟丛童垒鱼垒堑坠垒堡垒垒坌坌坌垡鱼垦堑垦鱼垒垒鱼 垒鱼匿?邀姿醛 量量丛垒曼墨垦主坌垦垒堡垒垒星璺垦曼匝壁垒垒垦垒垒璺垦壁垒垒垦曼壁垒垒垒堑选鱼丛堡昼目呈垒璺醛 曼璺垒垒羔墨曼璺垒垒墨』 丝璺曼曼堡垒曼垦堡垒堡垒墨曼鱼垒垦垒坌垒曼垒曼璺曼昼垒曼垒璺垦堑瞳盟丛堕 垒曼垦璺垒曼垦垒垦鱼垦匹垒煎鲢丛鱼堡垒曼垦垒鱼曼曼丛鱼垦垦曼曼璺璺垒鱼垦曼垒昼曼璺垡堑垒 垒垦曼垒壁垒垦璺 丛曼垒璺垒垒曼曼垒曼鱼璺?垒兰曼曼垒垒曼曼璺垒垒垒丛曼曼璺堡垒垒垒曼垦鱼璺曼垒醛 .醛 删 篓 五釜 差拦翌 一 垒曼垦堡垒垒堡垦垦垒坌璺曼曼堑垦丝曼曼垡昼曼璺坌璺璺垒曼昼丛堑垒垒璺徐州医学院硕士学位论文 . ..质粒一一的构建与测序徐州医学院硕士学位论文 徐州医学院硕士学位论文徐州医学院硕士学位论文 徐州医学院硕士学位论文 ,并充分混匀.,重 悬浮细胞:在沉淀中加入溶液用前加 悬细胞,直至细胞悬液均无细胞团。 细胞裂解:加入溶液.,轻柔地上下颠倒彻底混匀,直至裂解液变得 均一。请勿涡旋震荡室温下孵育。 中和:加入溶液.,立即颠倒多次混匀,直至获得均一的悬液。不应 残留细胞裂解第步中后出现的粘稠物质请勿涡旋震荡在室温下以 。 离心混合物 纯化柱装填:将第步的上清部分上样到平衡过的柱中,让裂解液 在重力作用下流动。 纯化柱淋洗:用溶液淋洗纯化柱两次,每次淋洗时,在重力作用下 流空纯化柱。 质粒洗脱:用溶液洗脱,请勿强行排除剩余溶液。 质粒沉淀:用.倍体积的异丙醇.沉淀,在。,以 离心 ,用%乙醇清洗质粒,并再次离心。空气干燥沉淀,用适当 体积的缓冲液缓冲液重溶。 取.上述质粒:稀释后用紫外分光光度计测定和,计算 浓度和纯度,.?保存备用。 . 细胞的培养 ..细胞的复苏 取液氮内冻存细胞一支,迅速转移至。水浴缸内,不停摇动使在温 水条件下迅速溶解。 取高压灭菌的离心管,内加培养基,用移液管将冻存管内的细胞悬 液转至离心管内,离心。 弃上清,以含%胎牛血清的培养液重悬细胞,移入培养瓶。, %培养箱中培养。 ..细胞的传代徐州医学院硕士学位论文 细胞铺满瓶底约%后传代,弃旧培养液,洗涤细胞遍。 加入的.%胰酶..%消化液,室温消化数分钟。 倒置显微镜下观察,胞质回缩,间隙增宽,细胞变圆时终止消化,反复吹打 瓶壁细胞,制备成单细胞悬液。 将细胞悬液移入离心管中,离心,弃上清,以含血清的培 养液重悬细胞,血球计数板计数细胞。将细胞分别接种于培养瓶中,?、% 培养箱中培养。 ..细胞的收集 弃旧培养液,用洗涤细胞两遍后,加入.%胰酶..%消化液 ,轻轻摇动培养瓶,使胰酶遍布细胞表面,室温消化数分钟。 倒置显微镜下观察,发现细胞胞质回缩,间隙增宽,细胞变圆时加入含 血清培养液终止消化。 反复吹打瓶壁细胞,使其脱落成单细胞悬液,离心。弃上清, 。。 加入血清的培养液重悬细胞。 计数板计数细胞,按实验需求调整细胞浓度。 .质粒转染. .. %, .细胞用不含酚红的培养基青、链霉素各/, .,,%培养箱中进行培养,当生长至%满瓶时,用.%胰酶 消化细胞,用不含酚红的培养基重悬,按细胞/孑的量接种到孔板中, 培养液的加入量为, ,%培养箱中培养小时,细胞密度达.%。 ..在转染前小时,弃培养基,加入新鲜的不含酚红的培养液,?, %培养箱中继续培养。 ..哺乳动物双杂交中质粒/ .复合物配置过程如下。孔板 每孔中质粒加入量为:腭.、.. .或一、?、 一或一、。 、. .受试物的染毒 徐州医学院硕士学位论文 转染小时后弃六孔板中的转染液,用 洗一次,加入含有不同 剂量受试物的不含酚红的培养基%,各剂量组均设个复孔。 .报告基因的检测 ..细胞裂解 弃孔板中的培养液,用 洗细胞两次,尽量用枪头将吸干 净。注意不要丢失细胞。 每孔加入×报告基因裂解液,轻轻晃动培养板,保证所有的细 胞都被覆盖。 室温下,在脱色摇床上轻轻晃动培养板,孵育。 轻刮培养板的表面,倾抖培养板,将细胞完全刮到培养板的低处。将细胞裂 解液转移至.的离心管中,旋涡混匀.秒。 ,离心,将上清转移至另一干净的离心管中。 细胞裂解液可直接用于测定或保存在.?备用。 .. 的测定 根据样品数量,按体积试剂加体积试剂配置适量 工作液,充分混匀,工作液室温小时内稳定。 完全溶解蛋白标准品,取稀释到,使终浓度为. /。 将标准品按,,,,,,,加到孔板的标准孔中,加用于稀释标准品 的溶液补足到。 加适当体积的样品到孔板的样品孔中,加用于稀释标准品的溶液到。 。 各孔加入工作液,?放置 应用全自动酶标仪,在处读取吸光度值值。 .. ?的测定 作为 将一标准品、待测细胞裂解液加入标记的孔板中,以 ×轻轻摇匀。 阴性对照。再在每管中加入 测定缓冲液 将孔板置于?恒温摇床上轻摇呈黄色。徐州医学院硕士学位论文 应用全自动酶标仪,在波长下读取吸光度值值。 .. 的测定 将标准/、待测细胞裂解液加入已包被一抗的商品化的酶 标板反应孔中,以作为阴性对照。封板,置。孵育小时。 工 去除反应液,用 洗板次,每孔加入 作液地高辛标记的二抗,/,封板,置。孵育小时。 去除反应液,用 洗板次,每孔加入 过氧化物酶标记的工作液,/,封板,置。孵育小时。 去除反应液,用 底物溶液 洗板次,每孔加入 ’.连氮.一乙基苯并噻唑.磺酸】,室温下在脱色摇床上轻轻振荡显色 .。 应用全自动酶标仪,在双波长和下读取吸光度值值。 统计分析 哺乳动物双杂交实验中诱导活性以相对于空白对照的倍数表示: 值 诱导倍数染毒组 值本底 值/染毒组 值一本底 值/空白对照组 本底. 值】/空白对照组 .统计软件进行统计学处理。 值本底? 值】。实验数据用 数据以均数标准差表示,经正态性检验和方差齐性检验后,各组间 差异比较采用单因素方差分析分析,多个实验组与对照组比较采用 ’法。.表示差别有统计学意义。 徐州医学院硕士学位论文 结 果 .在抗雄激素作用中的作用 . 与.的相互作用 和、一等重组质粒共转染细胞后,在不加 的情况下,的表达也明显升高见图。结果表明与.的相 互作用是非配体依赖性的。 . 对与相互作用的影响 和、??等重组质粒共转染细胞后,加入 枷到‘的,的量没有明显升高,与不加的的表达量 比较,差异没有统计学意义见图。结果表明不增强与一的相 互作用。 .氯氰菊酯对与.相互作用的影响 和.、等重组质粒共转染细胞后,用浓度为 。到。 氯氰菊酯处理转染上述质粒后的细胞,的表达量降低, 在巧浓度下与不加的的表达量相比,差异有统计学意义尸. 见图。徐州医学院硕士学位论文 一《 州蔷一。醋 . . 名 /图加和不加对刚.相互作用的效应 将两种融合质粒.,.和报告基因转染进入细胞, 建立哺乳动物双杂交实验。加入浓度为到遗的进行孵育。的量以 相对于转染空载体时的诱导倍数来表示。在缺乏外源性配体的情况下,的表 达 明显升高,且不能增强与.之间的相互作用。结果以均数士标准差表示。徐州 医学院硕士学位论文 苗;兮:【《《 人苗一。醒 . . /图 不同浓度的氯氰菊酯对/相互作用的效应 将两种融合质粒.,和报告基因叮转染进入细胞, 建立哺乳动物双杂交实验,加入浓度为到的氯氰菊酯进行孵育。的量以 相对于转染空载体时的诱导倍数来表示。氯氰菊酯抑制和之间的相互作用, 并在禹/浓度时与不加的表达相比较,差异有统计学意义.。结果以均 数士标准差表示。 徐州医学院硕士学位论文 在抗雄激素作用中的作用 . 与氨基端的相互作用 和、等重组质粒共转染细胞后,的 表达明显升高。结果表明的氨基端与之间存在相互作用见图。 . 与羧基端的相互作用 .等重组质粒共转染细胞后, 和、 的表达未见升高。结果表明的羧基端与之间不存在相互作用。 . 对与相互作用的影响 和、.等重组质粒共转染细胞后,加入 。到的,的表达量减少图。结果表明可能抑制 了与共抑制因子之间的相互作用。 .氯氰菊酯对与相互作用的影响 和、.等重组质粒共转染细胞后,用浓度 为刁到巧氯氰菊酯处理转染上述质粒后的细胞,的表达量增 高且呈递增趋势,在弓浓度下与不加的的表达量相比,差异有统 计学意义.图。徐州医学院硕士学位论文 盘暑??? ?留畏?篙 士一 一 / 图 /与氨基端的相互作用示意图 将两种融合质粒.,./和报告基因转染进入 细胞,建立哺乳动物双杂交实验,的表达明显升高。结果表明的氨基端与 /之间存在相互作用。