【doc】去窦弓神经大鼠主动脉重建及机制探讨

【doc】去窦弓神经大鼠主动脉重建及机制探讨 去窦弓神经大鼠主动脉重建及机制探讨 7予牛一.7 ?734? 文章编号]0258879X(200(:,)08,073405 嚣专.nlv.Aug;21(8) 去窦弓神经大鼠主动脉重建及机制探讨 L一一 缪朝玉,陶霞.管云枫,扬友才.篷正绪.苏定冯 {?l ? 论着? 摘要]目的:观察去窦弓神经(sA1))大鼠主动脉重建位发电发展过程,初步探讨体液因素在其中的作用.方珐:计算机图 像分析测定主动脉形态}离伴血管制备观察主动咏功能}放免法测定AugE浓度.赔果和赔论:(1)主动脉结构重建在SAD 后4,16周时随时间延长而加重.从几何形志学和中膜显微结构改变来看.主动脉结构重建主要属血管肥厚型.且与平滑肌 生长和胶原积聚有关.(2)主动脉对NE的收缩反应在SAD后8,32同时进行性增强,对ACh的舒张反应在SAD后8--32 周时减弱.SAD后32周时主动脉去内皮后对NE的收缩反应增强作用捎戋.提示血管功能改变与内皮和(或)内皮与滑肌 的相互作用改变有关.(3)SAD后l0周时,血浆Aug?浓度无明显改变,而主动脉Ang?浓度升高.提示组织RAS擞活町能 参与sAD引起的主动脉重建=鼋 :差键词血管重建;老塞量控墅圭垫壁缸管紧张素? L中圈分类号]R543.1[文献标识码:A 去甲肾上腺素:己酰胆碱 一 螺标统 Aorticremodelinginratswithchronicsinoaorticdenervation MIAOChao—Yu.TAOXia.GUANYunFeng,YANGYouCat,CHUZhengXu,SUDing— Feng(DepartmentoIPharmaeo[ ogy+Departmento,BasicMedicine.SecondMilitaryMedicalUniversity.Shanghai200433,China) ABS~fRACT2Objective:Tostudy'aorticremodelingproducedbychronicsinoaorticdenervation(SAD)anditimecourse, ndtoexaminetheroleofhun1oral{actorintheSA13inducedaorticremodeling.Methods:InratswithchronicSAI]orham operationtaorticstructurewasmeasuredbycomputerimageanalysistaortic/unctionbyisolatedarterypreparation,andan giolens/n? concentrationlayradioimmunoassayResultsandConclusion:(1)Theaorticstructuralremodelingdevelopedpro gressvey4,8,16and32weeksafterSAD.AorticstructurHlrentodelinga{terSADexpressedmainlyaortichypertrophy duetoSMCgrowthandcollagenaccumulation(2)Theaorliccontractionelicitedbynorepinephrine(NE)wasprogressively increasedat8,16and32weeksaftrSAD.Theaorlicre[axatLone】 ieitedbyaeetylcholine(ACh)depressedat8,16and 32weeksa{terSAD.1naddition.weoundthatin32~'eekSADralstheNEinducedcontraetionwasnotincreasedbyen dothelialdenudation.Theseindicatedthattheincreasedconttactionanddepressedre】 axationa{terSAD~,ererelatedtothe chatlgeoIendotheliumand/orthechangeofinteractionbetweenendmheliumandSMC(3)In10weekSADmts?plasmaan giotensin?concentrationremainedunchanged.whereasaorticangiotensin? concentrationwassigniIicantlyincreased,sug geSlingthaiactivationoftissuereninangiolensinsystemmaybeinvolvedinSAD— inducedaorticremodeling. - KEYWORDS-vascularremodeling;sinoaortiedenerwttion;aorta;angiotensinI;norepine phrine;acetylcholine AcadJSecMilMedUniv.2000,21(8)'734738 临床研究明.高血压患者的血压波动性 (bloodpressurevariability,BPV)显着高于正常 人,其靶器官损伤程度除与血压相关外.还与BPV 密切相关.我们还发现多种高血压动物的BPV显着 升高.老年自发性高血压大鼠(SHR)靶器官损伤程 度与BPV的相关性高于其与血压的相关性,对 SHR采用降BPV的抗高血压药尼群地平治疗能减 轻靶器官损伤,而采用升BPV的抗高血压药肼届嗪 治疗却加重靶器官损伤,提示血压不稳定(即 BPV升高)是高血压靶器官损伤的危险因子我们 采用单纯血压波动性升高(不伴有持续性高血压的 长期去窦弓神经(sinoaorticdenervation,SAD)大鼠 模型进行了研究.发现大鼠SAD后16周其24h血 压均值保持不变,而BPV显着升高一同时伴有明显 的fl,,肾等器官损伤.其程度与BPV密切相关本 研究将着重观察长期SAD大鼠主动脉重建(结构和 功能改变)及发生发展过程.并初步探讨肾素一血管 紧张素系统(RAS)在主动脉重建中的可能作用. 一 基金项目J l作者单位 20033 作者简介 国家自然科学基金膏助项目(39670831 第二芎:医学基础医学部药理学教研室上海 缨朝玉(1965一).女(双旗)博士师 第5J蜩缪朝玉,等.去窦弓神经丘鼠主动脉重建世机制摄 1材料和方法 1.1实验设计在SAD术后4,8.16,32周大鼠l熳 相应的假手术(shamoperalion.Sham)大鼠上.经 SAD检验后.选为台格动物.进行离体胸主动脉的 收缩,舒张功能测定和腹主动脉的形态学研究,在 sAD术后l0周大鼠及相应Sham大鼠上,测定血 浆和主动脉的血管紧张素?(Ang?)浓度. 1.2SAD大鼠的制备将l0周龄雄性Sprague— Dawley太鼠(上海SIPPRBK实验动物有限公司提 供)用盐酸氯胺酮(上海中西药业股份有限公司生 产)50mg/kg加地西泮(上海旭东海普药业有限公 司生产)5mg/kgip麻醉仰卧位,颈部正中切开后 分离出双侧主动脉神经和喉上神经并切断再暴露 颈动脉窦区域,清除该区的神经支配,并用10的 苯酚溶液涂擦局部,最后缝合切El.对照组在同样条 件下施行假手术.术后大鼠经随机分组.常规饲养 4,32周. 1.3SAD检验SAD大鼠采用上述ip麻醉.行颈 外静脉插管和经股动脉的低位腹主动脉插管.24h 后在清醒自由活动状态下iv击氧肾上腺素(上海禾 丰制药有限公司生产)3,5~zg/'kg.如果血压升高? 6.7kPa,而,12"率减慢<20次min,则认为SAD完 全SAD完全者进行下一步研究Sham大鼠进行上 述同样检验时.心率减慢为60,100次/min.全部 用作对照研究. 1.4胸主动脉收缩和舒张功能的刹定大鼠称体 质量后用上述药物ip麻醉.开胸,取位置相对固定 的胸主动脉条,移人95O+5CO饱和的K—H 液内(37C),剔除牯附于主动脉周围的脂肪.截取 2,3mm长的2,3个主动脉环.需要去内皮的则用 机械法去内皮.随后用自制金属钩将动脉环悬置于 含K—H掖,95O.一5CO.37C的浴槽中.端 连接张力换能器(LWA一20.上海广和电子电器厂) 和台式平衡记录仪(XMT一204.上海大华仪表厂). 调节静息张力为2g(1g一0.0098N).稳定6O min.每隔15rain换液1次,然后在去甲肾上腺素 (NE)l×l0.mo1./L预激动条件下.制作有内皮血 管环对乙酰胆碱(ACh)的舒张反应的量效曲线.再 冲洗稳定30rain后,制作对NE的收缩反应的量 效曲线.去内皮血管环在NE1×10一mo[/i预激动 条件下,用ACh1×l0mo[儿检验内皮去除是否 完全,再冲洗稳定30min后.制作对NE的收缩反 应的量效曲线.收缩反应以增加的张力(mgj表币. 舒张反应以张力下降幅度与NEl×l0一'rilo1,1预 ? 73j? 激动引起的张力升高幅度之比(j表示, 1.5腹主动脉形态学研究(1J取材,组织切片和 染色:大鼠胸主动脉取出用于功能测定后.结扎在体 胸主动脉断端(近膈肌).行腹主动脉远心端(uT能 远)向心方向插管.并采用l0中性甲醛液在l2 kPa压力下灌注固定30rain.然后取肾动脉分支处 以下的蝮主动脉.置于装有上述固定液的瓶中继续 固定2{h以上常规石蜡包埋.连续切片,片厚5 , o.yrl分别用H—E染平滑肌细胞枝,维多利亚蓝 (VB)染弹性纤维,苯胺蓝染胶原纤维,酸性茜素蓝 染平滑肌.(2)计算机图像分析:采用中国科学院研 制的通用颗粒计算机图像分析系统软件.选H—E染 色切片测定血管的几何形态学指标.即内径,外径, 壁厚,壁面积,壁厚/内径比.每例测4个血管切面后 取均值.选酸性茜素蓝染色切片,苯胺蓝染色切片, VB染色切片和H—E染色切片分别测定中膜平滑 肌,胶原纤维,弹性纤维的相对面积和相同视野的平 滑肌细胞桩个数,每个血管切面测定4个视野.每例 测定4个血管切面.最后取均值. 1.6Ang?的测定(1)标本采集:大鼠断头后. 立即用预冷的Na!EDTA抗凝管收集躯干部血液5 m】.摇匀.置冰褡中冷却同时立即取全长主动脉. 以预冷的生理盐水洗涤,仔细剧除脂肪组织,吸干后 取6f】,80mg腹主动脉放八预冷的冻存管.井冻存 于液氯中(2)标本处理:将冷却的全血在L下 4?lIr/min离心15rain,取血浆lm【.加试剂盒(北 京中国原子能科学研究院生产)提供的酶抑制剂1 和2各l0和20【.摇匀.置2O('待测血浆Ang? 浓度.主动脉标本从液氮中取出后.融化.剪碎,放人 预冷的含0.75rfll0.5mo1/L乙酸的匀浆管中.在 冰浴中充分匀浆.然后加0.5mol/1氢氧化钠【】.75 m【.摇匀.在4C下4000rmln离心20min.取上清 lm【,加酶抑制剂1和2各l0和20【,摇匀.置 20C待测主动脉Ang?浓度.(3)Ang?的测定:采 用放射免疫测定法,按试剂盒说明书操作 1.7统计学处理采用SAS软件进行统计处理. 数据用孑?s表示.除量一效曲线采用可重复测量的 双因素方差分析以外.其余组间比较均采用非配对 f检验 2结果 2.1SAD对主动脉形态结构的影响与Sharn大 鼠比较.SAD大鼠体质量明显下降愎主动脉形态 结构改变在SAD后4周时已经出现.8.16,32周时 进行性加重几何形态学改变(表1)表现为壁厚,壁 ? 736? 面积,壁厚./内径比增加(SAD后4,32周时)段内, 外径扩大(SAD后8,32周时).中膜显微结构成分 改变(图1),表现为胶原纤维相对面积增加(SAD1舌 4,32周时),平滑肌相对面积增加{SAD后8,32 第二军医上学2009年s月.单2I卷 固时),弹性纤维相肘面积减小(SAD后8,舶目 时).而同一视野的平滑肌细胞桉个数无明鼎变化 (SAD后4,32周时) 表1SAD大鼠腹主动昧几何形态学改变 TablGeometricmorphologicalchangesoftheabdominalaortasinratsaftersinoaorticdenerv ation Sham:ShamoperationISADSinoaorriedencr~elion.BM8.d1 『,;ID.Internaldiameter{EDjExtc~naldiameter;WTWrhickhess;WA:Wal1are;'P<005.'P<0.01ttime?~atehedSham 圈1SAD大鼠腹主动脉中膜显微结构成分的改变 Fig1Changesinmedialmicr0structuralcomponentsofthe abdominalaor~,g$inratsaftersinoaorticdenervation Sham;ShamoDeratioa;SAD:Sinoaorti(:denervation:5MC: Smoothmusclecell10:SMCinshamgroup{?:SMCInSAD group1?:CollagenLnshamgroup}?:CollageninSADgroup: 口:Ela~tinI【Ishamgroup~一:Elas*iainSADgroup;P(u.05, ''尸<0.01v3-timematchedSha…liadicatedi11Tob1 2.2SAD对主动脉收缩和舒张功能的影响 2.2.1胸主莉脉对NE的收缩反应与相应Sham 埋比较,SAD后胸主动脉对NE的收缩反应在4周 时无明显改变(P一0.438),在8.16.32周时明显增 强(P<0.01).比较术后不同时问血管的NE收缩反 应.Sham组不同时间的血管收缩反应无明娃变化. 而SAD组不同时间的血管收缩反应却随时间增加而 增强(图2)比较术后32周血管内皮完整时与内皮 去除时的NE收缩反应(图3).可见Sham组血骨去 除内皮后NE收缩反应明显增强.而SAD组血管去 除内皮后NE收缩反应与内皮完整时没有明显差别, 且出现下降趋势,这使得去内皮血管的NE收缩反应 在Sham与SAD两组问无明显差别 Log【nor~pinephrine)((,:toolL 图2SAD大鼠胸主动脉收缩反应的改变 Fig2Changesinthoracicaorticcontraction inducedbn0repephrineinratsafter sinoaorticdenervation ?:SAD4w(:ek;?:SAt)8week:?SAD16k ?:SAD32k;'',(01SAD4k, 0P<00lSAD8wck.=6 第8期缪朝王,等.去窭弓神经大鼠主动肿重建鼓机制探 围3去内皮对SAD和Sham大鼠胸主动脉收缩反应的影响 Fig3Effectsofendothelialdenudationonthoracic aorticcontractioninducedbynorepinephrinein 32一weekSADandShamrats E(一JA0nawi)hendo)helium【E(一)Atawi)homendu)heiiutfl; ' :ShamE(+)}?:SADE(一);口ShamE{,?:SADE r一:<0.01SADwSham;0P<0OlE(…Ef十)}一5 2.2.2胸主动脉对ACh的舒张反应与相应Sham 组比较,SAD后胸主动脉对ACh的舒张反应在4周 时无明显改变(P=0.】】65),在8.16,32周时明显下 降(.『)<O..】).比较术后不同时间血管的ACh舒张 反应.Sham组不同时间的血管舒张反应无明显变 化,而SAD组不同时问的血管舒张反应却随时间增 加而降低(图4),但SAD后后16,32周时血管舒张 反应无进一步下降(与SAD后8周时比较), Z L0s【幽oe】mo1 圈4SAD大鼠嘲主动脉舒张反应的改变 Fig4Changesinthoracicaorticrelaxationinducedby acetylcholineinratsafterofsinoaortlcdenervation ?;SAD4week{?:SAD8week}?:SAD16…k; ?SAD32week{''P<0C1iSAD4week;一6 2.3SAD走鼠血浆和主动脉Ang口浓度的改 变大鼠SAD后10周时,血浆Ang?浓度为(73士 80)Pg/n1l(H一8),与Sham组2(54士26)pg,."ml?一 ?37? 5]比较无显着改变;而主动脉组织Ang口浓度为 (340士163)pg/g.较对照组(14]?lOC')pg堙:显着 许高tP<.0.05) 3讨论 3,1SAD犬鼠主动眯结构重建目前认为.血管结 构重建有两种不同类型:一种是血管重排.其管壁 增厚由原有管壁细胞和基质围绕缩小的管腔内径重 新排列所引起,此时管壁面积不变,内径和外径均减 小;另一种是血管肥厚.其管壁增厚主要由管壁生长 反应所引起,此时蕾壁面积增加,内径不变或减小,外 径不变或增加根据这,概念分析SAD大鼠腹主动 脉的几何形态学参数改变.可知SAD后主动脉的结 构重建主要属血管肥厚类型.从时间上来看.SAD后 4周时主动脉的结构重建已出现.以后随着时间的延 长在8.16,32周时进一步加重.而且中膜显微结构成 分研究结果进一步提示这种血管肥厚至少与SMC 生长和胶原积聚有关SMC生长包括肥大(体积增 加)和(或)增生(数量增加).本实验结果表明.SAD 后腹主动脉SMC肥大,因为SMC相对面积增加时 细胞核个数不变Laco1.1ey等0曾经报道SAD后6 周大鼠腹主动脉中膜面积和胶原纤维增加.而SMC 和弹性纤维变化不明显,这一结果与本实验SAD后 4周时的结果一致. 3.2SAD大鼠胸主动脉收缩和舒张功能的改 变血管重建不但表现为血管形态结构的变化,而且 也表现为血管功能的变化.本研究结果表明,SAD 后4周时胸主动脉的收缩和舒张功能无明显改变. SAD后8,16.32周时血管的收缩反应进行性增强, 舒张反应减弱,但舒张反应在SAD后8周以后无进 一 步减弱测试术后32周血管去内皮后NE的收缩 反应,发现Sham与SAD两组问无明显差别.说明 SAD后胸主动脉平滑肌对NE的反应性没有改变, 其内皮完整时NE收缩反应增强与内皮和(或)内皮 与平滑肌的相互作用改变有关.ACh引起的血管平 滑肌舒张反应依赖于血管内皮,因此,SAD后ACh 舒张反应减弱也与内皮和(或)内皮与平滑肌的相互 作用改变有关结合形态学研究结果.SAD后4周时 胸主动脉SMC无明显改变,NE收缩反应和ACh舒 张反应也无明显改变,SAD后8.16,32周时胸主动 脉SMC出现肥大,NE收缩反应和ACh舒张反应也 出现改变.故推测SMC改变与血管NE收缩反应和 ACh舒张反应改变有关 3.3SAD大鼠主动脉重建的可能机制有关长期 SAD大鼠器官损伤机制,以往研究主要关注血蒲动 :口0口lu0 ? 738?第二军医丸学2?c年8月第21巷 力学改变在其中的作用.认为长期SAD大鼠单纯 BPV升高(不伴持续性高血压)与器官损伤有关.. 本研究首次报道了长期SAD大鼠Ang?改变,研究 证实.RAS对正常血管结构和功能起重要的调节作 用.RAS激活可致血管重建.本实验结果表明.长 期SAD大鼠血浆Ang?浓度无明显改变.但主动脉 Ang?浓度明显升高,提示局部组织RAS(而非循环 RAS)激活可能参与长期SAD引起的主动脉重建 注:本文曾在第三届中法药理学学术交流大会上英文 掘告(1998.12) [参考文献] 1一张挈明.程勇,刘建华.等.老年自发性高血压太鼠血压波动 性与靶器官损伤[j].高血压杂志,19?6.4t1):7—10. 一 2一刘建国.龚佩.程勇.等改壹血压谊动性对靶器官损伤的 髟响LJ第二军医大学.199819(6j:5155l8. 3龚佩.刘建国,程勇.等血压波动性增高引起的器损怖 一J第二军医大学.199718c5)462464 ljDzauVJ-GibbonsGH\'aseu【arremode[ing:mechanismsand impieaGons:J].JCardiovascPharma~o1.I93.!I{Sup~I1) S1S5 r-l1acolleyP.BeziY.GirerdX"Aordtensi[…illand r|Ilt~ralchanges,HsJnoaortk"dener~aredr,ts『JJ.H2fx'rten ion199I.26(2)337—04'3 LJ;ohlkeP—LamberLvV,Ku~lrI,tfVasc.u[arremodelingin …nichypertension:J].AmJCardio1.19?1(I?2E [收稿日期,2,5006124修回日期]2,3o0l15—15 本文编辑:姚春芳 臆厚硒.73g,7 :文章编-g-:0238—879X(2000)08073802 床南 足底原发性恶性黑素瘤的临床病理分析 胡孟钧.魏建丽..余永伟一V 原发于足底的恶性黑素瘤临床上少见ll,而有关足底的 恶性黑素瘪的研究国内报道甚少.我们对13锕足底原发性 恶性黑素滴进行了光镜,免痉组织化学的观察,现报道如下. 1材料和方涪 1.1临库资料收集19901998年我院经病理谤断的足 底恶性黑索瘪共13例.其中男性例.女性8例,年龄 43,73岁,平均59岁,发生在左侧足底7例.右侧6倒临床 主要症状为足底黑色肿块伴糜烂或溃疡形成从发病到来院 首诊时蚵为3十月至年不等临床诊断:黑索瘤5倒.穗疡 E例.色素德3例 l2方法纽甥标本经常规脱水石蜡包埋,苏术精伊红 (HE)染色免疫组化抗体选HMB45,S100,Vimimin(被 形蛋白),EMA,LC,,SMA,NSE(均为DAKO公司产 品免疫组织化学方法采用ABC法染色.光镜观察,以缅 胞质呈棕黄色,背景不着色为阳性.以已知的阳性组织切片 l非阳性对照用PBs代替一抗作阴性对照. 2结果 (1)肉跟检查:l3例均属肿抉和色素斑切脒标本,肿瘤 一 ,J2 /^}7j{l.1一\二 /I7?, 切面夫部分为浸润散在的黑色斑点.(2】镜下观察:l2例瘤 缺均由明显异型的上皮样和(或】梭形瘤细胞掏成.可见瘤巨 细胞和牙瓣样缅袍色素颗粒存在F袍质内外;浸澜探度 按C[ark分类法.?级1铡,?级3例.IV级3例,v级j例 单纯色素斑l例,仅见表皮内有异型黑索细胞增牛.肿瘤未 穿破基底膜侵^真皮层.故属足底原位恶性黑索瘤同时属 ?级的1侧切除的局部淋巴结各有1枚暄股沟深,浅淋巴结 转移13例原发性恶性黑素瘤的临床病理特征均为结型, 其巾上皮样瘤细胞为主型11侧.棱形细胞为主型2倒组织 学类型I级l倒.?级5铡.?级7铡.(0)免疫酶标和组织 化学结果:l3例HMB一{5.S100.Vimentin标记均为阳性.8 倒Fontana银染色阳性(4)本组除2例戋访外.1l例中5年 生存率为363 (下转第748酉) r作者单位1.第二军医大学长悔医院稿理科,上海2g04:j3 2.江省诸暨市^民医院病理科,3118'30 [作者简介:胡盂钧(1959一).男(汉旗),主治医饰 1三一一?一,m一 , …??m