银杏内酯B对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用（可编辑）

银杏内酯B对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用（可编辑） 河北医科大学 学位使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,南本人独、’,:完成。本学 位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主 要内容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学试验材料、原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则,承担相应的法律 责任。 研究生签名: 聊建钝嵫肄一 导师签章: 二级学院签章:. ,夕口年‖月弓画』.; 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文 中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成 果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 研究生签名:磷 导师签章:睦目啊 杪炉年矿月口?目 录”?“??”??”?”?”“?“?”??”??”??””一? 银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用 引言? 弓舌“‘“‘”‘“‘”。”?‘“‘”。”。”’”?’“‘“‘“。”‘??“‘”。”’”。?“。。“【 银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用 前言? 刖舌?“一”“一“””??““”““一一?“””“一”??“””““““一一上 材料与方法结果 附羽 附表讨论 结论参考文献 综盎 致调十? ??质的 因子 ,为银杏提取物的主要活性成分之一, 银杏内酯 是血小板活化因子特异性的拮抗剂,研究显示银杏内酯通过抑制血小 板活化因子功能而抑制缺血所致炎性反应、改善脑能量代谢和脑组织病理 学改变,保护脑组织免受缺血再灌注损伤。本研究拟采用大鼠局灶性脑缺 血再灌注模型,通过观察银杏内酯对缺血后脑组织形态学、血清中丙 二醛含量、羟自由基?产生能力、超氧化物歧化酶 活力及脑组织中超氧化物歧化酶和诱导型一氧化氮合酶 的表达,评价银杏内酯对缺血再灌注脑损伤的神经保护作用,并对其 作用机制进行探讨。 目的:评价银杏内酯在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的神经保 护作用。 方法:大鼠随机分为溶剂对照组、假手术组、 ?’ 组, ?一组, ?’组和金纳多 ?。 组。采用线拴法闭塞大脑中动脉制备大鼠局灶性脑缺血再灌注 模型,并于插入拴线后尾静脉立即分别注射溶剂生理盐水、金纳多和不同 剂量的银杏内酯,假手术组行手术通路,除不插线外,其余操 作步骤同手术组。手术后小时进行神经功能评分、染色法测定脑 梗塞体积、染色法观察脑组织形态学变化、黄嘌呤氧化酶法测定血清 中超氧化物歧化酶活性、硫代巴比妥酸法丙二醛含量、 反应测定羟自由基?产生能力、免疫组织化学法观察脑缺 血再灌注损伤后大鼠脑组织中超氧化物歧化酶和诱导型一氧化氮 合酶的表达及银杏内酯对超氧化物歧化酶和诱导型一氧化氮 合酶的表达的影响。 结果:中文摘要 .大鼠脑缺血再灌注后,假手术组未见行为异常,神经功能评分为 分;溶剂对照组大鼠于缺血再灌注后出现明显的行为改变,神经功能评分 、和 最高,为.?.分,金纳多与银杏内酯 ?。可不同 程度的改善大鼠的神经症状,神经功能评分分别降低至.?.分、. ?.分、.?.分和.?.分,与溶剂对照组比较均具有显著 ’ 性差异.,.。 .手术后小时,除假手术组外,其余各组大鼠大脑皮质和纹状体均 出现明显的梗死灶,银杏内酯 、和 ?蚝以可明显缩小脑缺血再 灌注损伤后脑梗死体积,脑梗死体积分别为.?.%、.? .%和..%,与溶剂对照组比较.?.%梗死 ; %、.%和.%,差异具有显著性. 体积分别降低. 金纳多可产生与银杏内酯相似的作用,梗死体积降至.?.%, 与溶剂对照组相比有显著性差异.。 .溶剂对照组大鼠脑缺血再灌注后脑含水量为.?.%,明显 .%,两者比较有显著性差异.。 高于假手术组. ?。 可明显降低大鼠脑缺血再灌注损伤后脑含水量,与溶剂对照组相 比 较有极显著性差异.。金纳多、 ?。和 ?银杏内酯 虽有一定降低脑含水量的作用,但与溶剂对照组比较无显著性差 异 .。 .脑缺血再灌注损伤后,溶剂对照组血清超氧化物歧化酶 ?一,降低幅度 活力为? ?~,明显低于假手术组? 达%;金纳多和银杏内酯 ?埏。可明显对抗脑缺血再灌注损伤所 ?和 致活力的降低,活力分别为? ?一,与溶剂对照组比较有显著性差异.;银杏内酯 。 ?。和 和 ?虽可增加血清活力分别为 ?,但与溶剂对照组比较无显著性差异.。 .大鼠大脑中动脉闭塞后,溶剂对照组血清含量为.?. ?‘.,金纳 ?~,明显高于假手术组.?. 多和不同剂量的银杏内酯均可显著降低脑缺血再灌注损伤引起 的脂质 ?~、 过氧化产物含量的升高,分别为:金纳多组.?.?~、银杏内酯 银杏内酯 ?埏。组.. ?中文摘要 组.?. ?~、银杏内酯 ?组.?. ?~,降低幅度分别达 .%、.%、.%和. %,与溶 剂对照组比较具有显著性差异.,.。 .手术后,假手术组血清羟自由基生成能力为? ?~,明 显低于溶剂对照组? ?。.,金纳多和银杏内酯具有 清除羟自由基的作用,可明显降低脑缺血再灌注损伤后血清?水 平的 升高,降低幅度达.%、.%、.%和.%,金纳多和银杏内 酯 . ?一、 ?~、 ?清除血清?作用强,为 ? ?和? ?一,与溶剂对照组比较有极显著性差异 .,银杏内酯 ?。虽可降低?的生成能力,但与溶剂 对照组比较无显著性差异? ?~,.。 .组织形态学观察结果显示,溶剂对照组缺血侧大脑皮层和纹状 体 出现明显坏死病灶,神经元大量消失;金纳多和银杏内酯组可见 神经 元变性,神经元细胞核增大、浓染,核仁、核膜不清等病理改变,但与溶 剂对照组比较有明显的改善;银杏内酯组随着剂量增加,坏死神经元 数目明显减少;假手术组未见明显的组织病理学改变,大脑皮层细胞形态 完整,神经细胞核仁清晰,核圆形,核膜完整,神经胶质细胞少,且散在 分布。 .免疫组织化学检测显示,假手术组神经元胞浆可见.弱阳 性表达;溶剂对照组神经元变性,可见不同程度.阳性表达;金 纳多组神经元阳性表达明显增强;不同剂量银杏内酯组变性神经元阳 性表达较溶剂对照组组增强,但阳性表达明显较金纳多组弱。 .各组脑组织在脉络膜上皮细胞均有阳性表达,大脑皮层神经 元和神经胶质细胞偶见表达,假手术组皮质内小血管内皮细胞弱阳性表 达;溶剂对照组可见皮质内小血管内皮细胞表达增强,金纳多组内皮细胞 阳性表达较溶剂对照表达减弱,但较假手术组表达增强。银杏内酯组 随着剂量的增大,内皮细胞表达逐渐减弱。 结论:银杏内酯对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用,其作用 机制与拮抗血小板活化因子受体,抑制和减少体内脂质过氧化产 物和自由 基的产生,增强机体内源性抗氧化酶系统功能有关。中文摘要 ??????????????????????????????????????????????????????? ???一 关键词:脑缺血再灌注;银杏内酯;金纳多;超氧化物歧化酶; 丙二醛;神经功能评分;脑梗塞体积;脑含水量;血小板活化因子; 一氧 化氮合酶. 一 一 一一. , ,? . ,. , , ,.:。。 ‘ 。 ‘ ‘ 。 ‘ 一 ? ?。 . :, , , ?~, ?~,出。~埏~.. . 气英文摘要 , . , , , ,, , ,. : . . ,., ‘ 。~,。~ 曲 .:.,..,...士..土. . ,.. . ,. ‘‘. .% , %,.% . . . . .?.% . . 叫 , . ., .. .?, ?。 ?~~ ?, ?~一 .. 。,?. ?~. .?. 。。 ?。 .%. . ?’ ?‘ .% , .,.. .? ~ .~ , .. , ?。 . .% %, .%,.%,.,。 . , . ?~ . ,. ?.?.. .? ? .. , . .. . ,.茎查塑墨?? ????????????????????????????????????????一上, . , .? .: . . ,. ;; : ?; ; ;; ; ;. ?????????????????????????????????????????????一 中文译名 银杏内酯 大脑中动脉 大脑中动脉阻塞 颈总动脉 颈外动脉 颈内动脉氯化,,.三苯基四氮唑 ,,. 苏木素和伊红 蟠 血小板活化因子 ?超氧化物歧化酶 丙二醛 羟自由基 一氧化氮 一氧化氮合酶 诱导型一氧化氮合酶过氧化氢酶 过氧化物酶 ? . 内皮素. 研究论文 银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用 引 言 急性脑缺血再灌注损伤可引起严重的神经功能障碍,甚至危及生 命, 寻找有效的治疗药物及以促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复,一直 是相关学科研究的重点之一。近年来关于中药脑保护作用的研究越来越受 到重视,一些中药制剂被广泛应用于急性缺血性脑卒中的治疗。 .为银杏科银杏属植物,银杏提取物 银杏 ,在治疗与年龄相关的记忆损害、痴呆、外周动脉阻塞 疾病等方面取得了良好的疗效。近年来研究发现银杏提取物具有扩张脑血 管、增加脑血流量、抑制血小板凝集、抗自由基等功能,可减少缺血时脑 组织耗能,对缺血缺氧具有明显的保护作用,已广泛应用于治疗心脑血管 疾病、冠心病和脑供血不足等疾病。金纳多注射液是近年临床常用的治疗 缺血性脑卒中的药物,具有通经活络,活血化瘀的功效,被列为国家中医 药管理局确定的全国中医医院急诊科室必备急救中成药。 银杏叶提取物含有多种化学成分,具有生理活性的主要成分为黄酮 苷、萜内酯等化合物。萜内酯类化合物包括银杏内酯、、、、及 , 白果内酯,均为高效、专一的血小板活化因子. 拮抗剂,银杏内酯具有广泛的生物学效应,既往研究表明,银杏内酯 制剂防治脑血管疾病主要与其抗、抑制血栓形成、清除自由基、抑制 炎症反应、扩张脑血管、增加脑血流量等作用有关。其中抗活性最 强的是银杏内酯。 本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型线拴法,以缺血前后脑组 织形态学、神经功能评分、脑组织含水量变化为评价指标,观察银杏内酯 对脑缺血再灌注损伤的保护作用;采用生物化学检测方法和免疫组织化 学方法研究银杏内酯对缺血再灌注损伤后血清中丙二醛含量、 羟自由基含量超氧化物歧化酶活力及脑组织中和蛋白表 达的影响,研究银杏内酯的抗氧化自由基损伤作用,并对其作用机制 进行探讨,为该药的开发和临床应用提供临床前实验依据。研究论文 银杏内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 ?上?一 刖 罱 脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程,多种因素参与了其发生和 发展,其中的关键环节包括细胞内超载、兴奋性氨基酸释放及氧化自 由基的产生。随着人们对脑缺血再灌注损伤机制研究的不断深入,基于缺 血再灌注过程中不同损伤机制开发的神经保护剂不断涌现,也显示了一定 的治疗意义。血小板活化因子. ,受体拮抗剂 即为众多治疗药物中的一种。 是一种由多种细胞释放的脂质介质,生理条件下参与在中枢神经 系统神经突触传导调节、神经细胞损伤与修复、聚集血小板、舒缩小血管 等过程,脑内神经元、胶质细胞和血管内皮细胞均可合成。脑缺血再 灌注时,脑内浓度升高,可以:引起血小板、多形核白细胞 聚集、粘附;激活磷脂酶,,此时弹心作为促 炎性细胞信使. 和微血管通透性增加的调质, 促进自由基、白三烯、前列腺素等血管活性介质和细胞因子释放【】;通 通路,增加胞浆内“第 过.蛋白偶联的磷脂酶? 二信使”物质二酰基甘油,和三磷酸肌醇 ,水平,引起钙超划,超载可触发导致神经细胞 死亡的一系列:依赖性级联反应,最终导致血管及血脑屏障破坏、血浆 蛋白外流,微循环障碍,脑组织不可逆转的损伤和坏死【一】。 银杏内酯为银杏提取物的主要成分之一,具有拮抗的作用,在 大鼠永久性局灶性脑缺血和脑缺血再灌注实验中显示可减少大鼠脑梗死 体积、降低脑含水量、改善行为学症状及减轻脑组织形态改变,具有明显 的神经保护作用【 】。银杏内酯为银杏内酯中抗作用最强的成分, 本室前期实验也证实了其对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤具有保护作用。 本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,以脑缺血再灌注损伤后大鼠脑 组织相态学、神经功能评分和脑含水量变化、血清中丙二醛. 水平和羟自由基 ,?生成能力、超氧化物歧 化酶 ,活力及脑组织中超氧化物歧化酶和研究论文诱导型一氧 化氮合酶 ,表达为观察指 标,研究了银杏内酯对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用, 并 对其神经保护作用的可能机制进行探讨。 材料与方法 材料 .药品与试剂 , 氯化, 北京福星化工厂 .三苯基四氮唑 银杏叶提取物注射液金纳多,每毫 台湾济生化学制药厂股份有 限公司 升含银杏黄酮苷. 银杏内酯冻干粉 石家庄伟宁医药科技有限公司 超氧化物歧化酶试剂盒 南京建成生物工程研究所 丙二醛试剂盒 南京建成生物工程研究所 水合氯醛 天津市科密欧化学试剂开发中心 羟自由基.测定试剂盒 南京建成生物工程研究所 兔抗多抗 北京博奥森生物技术有限公司 兔抗多抗 北京博奥森生物技术有限公司 显色试剂盒 北京中山生物技术有限公司 北京中山生物技术有限公司 多聚赖氨酸 北京中山生物技术有限公司 免疫组化染色试剂盒 其余试剂均为国产纯 .仪器 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 美国 公司 低温冰箱 ..温控热垫 美国公司 上海医疗器械八厂 电热烧灼器 型恒温水浴槽 美国精骐有限公司“,\ 离心机 士公剐 上海美谱达仪器有限公司 紫外可见分光光度计 包埋机 上海仪器有限公司研究论文 脱水机 上海仪器有限公司 一.电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司 蝴 石蜡切片机 德国公司 .摊片机 天津航利达工贸有限公司 .烘片机 天津航利达工贸有限公司 病理工作站 德国公司 .实验动物与分组 健康雄性大鼠,体重 ,由河北省实验动物中心提供, 清洁级,许可证号:冀..。 方法 .实验分组 雄性大鼠,随机分为组:假手术组;溶剂对照组;金 纳多。组;银杏内酯 ?组;银杏内酯 ?组;银杏内酯 ?‘组。 .实验药品的配制 ..供试药品的配制 溶剂为市售的生理盐水。 金纳多注射液为市售品。 生理盐水溶 银杏内酯的配取银杏内酯冻干粉,以 解,得到浓度为 ?‘的银杏内酯药液后,根据实验需要,用 生理盐水稀释到所需浓度。 ..肝素的配制 将单位的肝素注射液置于 生理盐水中混匀,?保存备 用。 .. . 磷酸盐缓冲液的配制 液:. 磷酸氢二钠溶液的配制 称取含分子水的磷酸氢二钠?. ,加双蒸水溶 解并定容至 ,。保存备用。 液:.磷酸二氢钠溶液的配制 . 称取含分子水的磷酸二氢钠棚? ,加双蒸水溶解 并定容至 ,。保存备用。研究论文 ,得到 临用前取液. ,液. 混合,加蒸馏水至 磷酸盐缓冲溶液。 .的. ..氯化,,.三苯基四氮唑的配制 称取氯化,,。三苯基四氮唑 ,以. 磷酸盐缓冲液 . 溶解,配制成%溶液,?避光保存备用。 .尼龙线栓子的制备 将一长 ,直径为. 的尼龙线的一端用酒精灯加热,烧成 /及 处分别做 光滑的球形,用酒精棉球擦洗干净,于距球端 标记,置于肝素生理盐水中备用。 .大鼠局灶性脑缺血.再灌注模型制备【.】 大鼠腹腔注射%水合氯醛. .以麻醉,仰位固定于手 切 术台上,以温控热垫维持肛温在...?,沿颈部正中切开约 口,于左侧肩胛舌骨和胸锁乳突肌形成的三角处暴露颈总动脉及 其分支颈外动脉和颈内动脉。电凝的分支枕动脉、 甲状腺上动脉及终末支,并在残端留置一条缝合线,分离 主干,用动脉夹夹闭,然后在残端剪一. 小口,提拉 留置缝合线,同时松开夹闭的动脉夹,将浸过肝素注的拴线插入 ,拴线尾端经分叉处沿入颅,至大脑前动脉止当感到有 阻力时,表明拴线头端己到达大脑前动脉,拴线插入深度由分叉 处开始 . 计. 。拴线插入后在插口近端用线结扎,除去动脉夹, 逐层缝合。小时后,打开缝合处,将拴线轻轻拔出剩约 处,剪断 拴线,逐层缝合。除假手术组外,各组大鼠于插入拴线后尾静脉立即分别 注射溶剂生理盐水、银杏叶提取物注射液和不同浓度的银杏内酯; 假手术组行手术通路,除不插线外,其余操作步骤同手术组。 .检测指标与方法 ..神经功能评分 参考【.】的分制评分方法,大鼠于缺血小时再灌注 小时后进行神经功能评分。评分:提起鼠尾,观察前肢有无异常 变化,凡有术后右前肢内收、内旋者,视其轻重评为分,若大鼠表现 为躯体向右侧旋转,加分;将大鼠置于金属网上,向后轻扯鼠尾, 观察大鼠两前肢肌张力,根据右侧前肢肌张力下降程度评为~分;研究论文 将大鼠置于光滑平面上,观察侧向推挡阻力,根据右侧前肢阻力下降程度 评为分。 ..脑梗死范围的测定 术后小时,神经功能评分完毕,大鼠断头取脑,去除嗅球、小脑和 脑干,置于.。冷冻. 后取出,将脑组织由前向后做.个大脑连 续冠状粗切片,置于%磷酸盐缓冲液中,。避光恒温孵育染色. ,正常脑组织被染成红色,梗死区呈苍白色,应用 数码医学图像分析系统测出各区面积,计算梗死区占全脑的百分 数。 % 脑梗死体积%梗死体积/梗死体积非梗死体积× ..脑含水量的测定 缺血 后,神经功能评分完毕,大鼠立即断头取脑,去除嗅球、小 脑和低位脑干。用电子天平称取湿重后,将大脑置于?电热恒温 鼓风 干燥箱 ,称量其干重。计算脑含水量,检测脑水肿程度,并作统计 分 . 析。 脑含水量%脑片湿重一脑片干重/脑片湿重×% ..血清中活力、含量和?产生能力的测定 手术后小时,大鼠腹腔注射%水合氯醛. ?麻醉,腹 主动脉取血, ,分离血清,置于.。冰箱保存,备 离心 用。 测定原理:通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧 阴离子自由基,经氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色, 当被测定样品中含有时,因其对超氧阴离子自由基具有抑制作用, 使形成的亚硝酸盐减少,采用紫外可见分光光度计,根据标准对照管、样 品测定管和空白对照管在处吸光度值,代入公式计算得到被测样 品中总活力,以每毫升反应液中抑制率达%时所 对应的量为一个活力单位?。 活力?‘对照管值定管值/对照管 值%样本稀释倍数 含量测定原理:过氧化脂质降解产物中的可以与硫代 巴比妥酸结合,形成红色产物,在 处有最大吸收,根据标准空白 管、样品测定管和空白对照管的吸光度值,可以计算出待测样品管中研究论文 的含量。 含量?测定管值定空白管值/ 标准管值一标准空白管值×标准品浓度 /×样本稀释倍数 羟自由基测定原理:在的催化作用下生成具有 高反应活性的?,当给予电子受体后,用试剂显色,形成红色物 质,在处有最大吸收,根据标准对照管、样品测定管和空白对照 管在砌处吸光度值,可以计算出待测样品管中?的含量, ?.为一个生成羟自由 以每毫升血清使反应液中的浓度增加 基能力单位?。。 生成羟自由基能力?测定管值一对照管值/标准管值一空白管值 ×标准管浓度. × /取样量×样本稀释倍数 ., 染色观察组织学变化 大鼠于缺血小时再灌注小时后,腹腔注射%水合氯醛. .麻醉,仰位固定于手术台上,剪开胸腔,暴露心脏,剪去心包膜, 将针头自大鼠左心室插入主动脉,剪开右心耳,夹闭胸主动脉,全 速灌流 肝素化的生理盐水 ,再用%多聚甲醛灌流固定小时。断头取脑, 以视交叉前后两点做冠状切片,将脑片放入%多聚甲醛固定液中 固定。 脑片经常规梯度脱水、透明、包埋、切片厚度为 、贴片、下行脱 蜡至水、苏木精染色、盐酸乙醇分化、伊红复染、水洗、上行脱 水、透明、 中性树胶封片后,光镜下观察组织学变化。 ..免疫组化检测脑组织中和的表达 一抗采用兔抗和兔抗多克隆抗体。操作方法如下: 石蜡切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上,?过夜 上 切片脱腊至水 ’ . 洗涤三次 上 %甲醇双氧水, 室温 ,去除内源性过氧化物酶 山羊血清封闭液,室温分钟 倾去血清,滴加一抗 放入湿盒,。过夜 . 洗涤次,每次 分别滴加与一抗匹配的的生物素标记的二抗,。水浴 . 洗涤次,每次 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素三抗,。水浴 . 洗涤次,每次 避光,显色 ,充分水洗 苏木精复染细胞核 ,充分水洗 %盐酸乙醇分化,充分水洗 %胺水反蓝、充分水洗研究论文 梯度乙醇脱水、二甲苯透明次 /次、中性树胶封片 、 光镜下观察阳性细胞表达 .统计分析 实验数据用士表示,单因素方差分析、 两两比较采用 .数理统计软件进行处理。 结 果 .银杏内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能评分的影响 大鼠脑缺血.再灌注后,假手术组未见行为异常,神经功能评分为 分;溶剂对照组大鼠缺血小时再灌注小时后出现明显的行为改变, 表 现为缺血对侧肌张力明显下降,前肢内收,肩内旋,肩抗力下降, 向健侧 、、 倾倒,神经功能评分最高,为.:.分,金纳多和银杏内酯 ?可不同程度的改善大鼠的神经症状,神经功能评分分别降低至 .:.、..、.: .和..分,与溶剂对照组比较均具 。 和 有显著性差异.,.,结果见 .银杏内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积的影响 手术后小时,除假手术组外,其余各组大鼠大脑皮质和纹状体均 出 、和 现明显的梗死灶。银杏内酯 ?可明显缩小脑缺血再灌 注损伤后脑梗死体积,脑梗死体积分别为..%、.. %和..%,与溶剂对照组比较..%梗死体积分别 降低. %、.%和.‰差异具有显著性.; ?埏 金纳多可产生与银杏内酯相似的作用,梗死体积降至.. 。 和 %,与溶剂对照组相比有显著性差异.,结果见 .银杏内酯对大鼠脑缺血灌注损伤后脑水含量的影响 溶剂对照组大鼠脑缺血再灌注后脑含水量为..%,明显高 于假手术组..%,两者比较有显著性差异.。给予 ?以 可明显降低大鼠脑缺血再灌注损伤后脑含水量,与溶剂对照组相 比 较有极显著性差异.。 ?’金纳多、 ?一和 ?埏。 虽有一定降低脑含水量的作用,但与溶剂对照组比较无显著性差 异研究论文 。 和 .,结果见 .银杏内酯对大鼠血清超氧化物歧化酶活力的影响 ?一, 脑缺血再灌注损伤后,溶剂对照组血清活力为 明显低于假手术组 ?。.;金纳多和可明显对抗脑缺血再灌注损伤 所致血清活力的降低,与溶剂对照组 比较具有显著性差异., ?和 ?。虽可增加血 清中的活力,但与溶剂对照组比较无显著性差异.,结果见 。 和 .银杏内酯对大鼠血清丙二醛含量的影响 溶剂对照组血清含量为.. ?~,明显高于假手 术组.. ?以.,金纳多和不同剂量的均明显 降低脑缺血再灌注损伤引起的脂质过氧化产物含量的升高,与溶 剂 。 和 对照组比较具有显著性差异.,.,结果见 .银杏内酯对大鼠血清?生成的影响 假手术组血清羟自由基为 ?一,明显低于溶剂对照组 士 ?.,金纳多和银杏内酯具有清除羟自由基的作用, 可明显抑制脑缺血再灌注损伤后血清?水平的升高,抑制幅度分 别为 .%、.%、.%和.%,金纳多、 ?以和 ?。银 杏内酯清除血清?作用强,与溶剂对照组比较有显著性差异 .,?。银杏内酯虽具有一定清除?的能力,但与溶剂 和 。 对照组比较无显著性差异.,结果见 .银杏内酯对缺血再灌注损伤后脑组织形态学观察结果 光镜下检查,假手术组大脑皮层细胞数量多,形态完整,神经细胞 核 仁清晰,核圆形或椭圆形,核膜完整,神经胶质细胞少,且散在分布;溶 剂对照组脑组织可见明显坏死病灶,神经元大量消失,局部被小胶质细胞 取代;给予金纳多和银杏内酯后,虽存在神经元变性,神经元细胞核 增大,浓染,形态呈多角性或多边形,核仁、核膜不清,小胶质细胞围绕 神经元等病理改变,但与溶剂对照组比较有明显的改善,且神经细胞数目 明显增多。银杏内酯组随着剂量增加,坏死神经元数目明显减少,金 。 纳多可产生与银杏内酯相似的作用,结果见研究论文 .银杏内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮层.表达的影响 光镜下检查.阳性表达细胞呈棕黄色着色,.主要在 胞浆表达。假手术组神经元胞浆可见弱阳性表达;溶剂对照组神经元变性, 神经元.表达程度不一,阴性表达和阳性表达神经元均有;金纳 多组神经元阳性表达明显增强;不同剂量银杏内酯组变性神经元阳性 表达较溶剂对照组增强,银杏内酯 ?。和 ?。组阳性表达 未见明显差别;银杏内酯组神经元阳性表达弱于金纳多组,结果见.银杏内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮层表达的影响 主要在胞浆内表达。光镜下观察,各组脑组织在脉络膜上皮细 胞均有阳性表达,大脑皮层神经元和神经胶质细胞偶见表达,假手 术组皮质内小血管内皮细胞呈弱阳性表达,溶剂对照组可见皮质内小血管 内皮细胞表达增强,金纳多组血管内皮细胞阳性表达较溶剂对照组减弱, 但较假手术组表达增强;银杏内酯组随着剂量的增加,血管内皮细胞 。 表达逐渐减弱,结果见 . .水.,料. 一 琴 加 ,二叠 伯 竺 . .宰.研究论文 ? ?阳 ?? 加? 一零要.卫可 ?伯 . 木. . 野’ 苗 《 , ????????的?? . .木...水.,料.湖 撇 、一备一舟俺 僦 筝孵.功工. ..宰. 研究论文 × × × × × × . × × .. 研究论文 × ??, 木.,木术.??, 水. 研究论文?士, ?一 % ??.. ..宰木 锄 一 .士..土. .. ’ ? ..串 冰., ?幸. ?, ?一一?? 锄 一土水 士木士土 士水 书.士,一 ?一 .士. .士.枣木 .士.,:木 .士..土.宰 ..木木 水., 宰木. ??, ?一??一% 士 士木 土木 .士 . 土半 . 士串 . 木. 研究论文 论 讨 脑功能活动的正常有赖于一定量的脑血流供应 或永久的减少时,会引起缺血区脑组织出现暂时或 缺血的核心区由于脑血流供应的中断或过度降低引 梗死灶;而在缺血核心区的周边部位半暗带,持续的低灌注虽可影响 半暗带神经元的正常功能,但对脑组织尚不足以产生永久性的伤害,若及 时恢复该区域血流供应,则有助于挽救半暗带神经元免遭缺血性损伤幻, 因此,许多减轻缺血性神经细胞损伤的治疗策略都以挽救半暗带神经元, 减轻缺血再灌注损伤、防止脑功能进一步恶化作为主要作用目标。 为缺血半暗带区主要的病理介质,不仅对神经组织有直接的毒性 作用,而且在脑缺血继发性脑损害过程中增强、活化了一系列与神经细胞 损害有关的介质和关键的病理环节。脑缺血再灌注时,脑内浓度升 高,可促进缩血管物质释放,破坏血脑屏障结构和功能,促进脑水肿形成。 采用处理原代培养的大鼠大脑皮层微血管内皮细胞和小鼠大脑皮层 神经元结果显示,对微血管内皮细胞和神经细胞具有直接毒性作用, 可增加微血管内皮通透性和神经元死亡率,其毒性作用与增加细胞内钙浓 度和激活受体通路有关?朋。在局灶性脑缺血再灌注损伤模型中, 随着缺血后再灌注时间延长,缺血侧大脑皮质含量和表达逐 渐增加引;而大鼠全脑缺血再灌注损伤后,海马和血液中含量均明 显增高。大量研究表明,血小板活化因子受体. 拮抗剂通过抑制调节的血管收缩反应和降低血脑屏 障通透性,改善缺血后微循环障碍,增加缺血组织脑血流量,减轻神经功 能损伤、减轻脑水肿,缩小梗死范围而产生神经保护作用列。银杏内酯 为一种天然的特异性血小板活化因子受体拮抗剂,可对抗 介导的缺血再灌注损伤。本实验结果显示,脑缺血再灌注后,大鼠出现不 同的神经功能异常,脑含水量明显增加,缺血侧脑皮质和纹状体出现明显 的梗死灶,组织病理学检查结果显示,大脑皮层出现明显变性坏死,神经 元大量消失,局部被小胶质细胞取代;假手术组未见任何体征和组织形态 学变化,大脑皮层神经细胞形态完整,核仁清晰,核圆形,核膜完整;银 杏内酯可明显改善脑缺血再灌注损伤后大鼠神经功能异常,降低神经研究论文 功能评分,缩小脑梗死范围和降低缺血再灌注损伤后脑含水量 ”, 减轻脑水肿,改善缺血再灌注损伤后脑组织病理血改变,随着剂量增加, 坏死神经元数目明显减少,说明银杏内酯可对抗脑缺血再灌注损伤, 具有明显的脑保护作用。金纳多可产生与银杏内酯相似的作用。 局灶性脑缺血发生后,在缺血中心不可逆坏死区与正常脑组织之间, 存在处于低灌注状态的缺血半暗带,随着时间推移缺血半暗带处于动态变 化过程,若及时纠正低灌注可转化为正常灌注区,否则将进一步恶化转化 为梗死区。因此,在局灶性脑缺血损伤机制及其临床治疗的研究中,缺血 半暗带是一个焦点和治疗针对的靶点心引。治疗缺血半暗带目标是及时恢复 血流、抑制缺血级联反应,但药物干预或自发再灌注往往引起自由基大量 产生。生理条件下,脑组织活性氧 ,的产生和 清除处于平衡状态,使脑内氧自由基维持在较低的水平:但在脑缺血时, 尤其是在再灌注期,由于能量的耗竭、细胞内超载、膜脂质降解、蛋 白水解酶和一氧化氮合酶 ,的激活,导致体内 自由基的产生超过内源性抗氧化系统的清除能力,自由基在体内大量堆 ,?的生物活性最 积。在氧自由基中,以羟自由基 为活跃,它可使细胞膜脂质、蛋白质和核酸氧化而导致细胞功能障碍和死 亡。脑组织中富含脂质,极易受到自由基的攻击,体内过氧化脂质的分解 终产物水平的高低可反映组织细胞受自由基损伤的程度。脑缺血后 膜脂质过氧化及脑微血管通透性增高与?密切相关,有研究显示在大 鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后,?生成量的增高与脑梗死面积之间存 在明显的线性关系心’副,而在全脑缺血缺血再灌注实验中,缺血再灌注后 海马羟自由基的水平明显高于假手术对照组九,银杏提取物及其主要活性 成分银杏内酯具有捕获自由基和抗脂质过氧化损伤作用,可剂量依赖性 地降低大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中脂质过氧化产物水平心’ 副;本结果支持了银杏内酯和银杏提取物具有抗氧化自由基损伤作用的 观点,同时证实银杏提取物及其主要活性成分银杏内酯均可以降 低血清 中脂质过氧化代谢产物含量,并抑制?的产生。 是机体清除自由基的主要抗氧化酶之一,是清除活性氧自由基 尤其是~的第一道防御屏障,可将具有极强氧化能力的~转化为相 ,,在体内过 对稳定、毒性较低的过氧化氢研究论文 氧化氢酶,和过氧化物酶,的作用下分解为 完全无害的水,这三种酶组成了一个完整的防御氧自由基损伤的 链条乜钊。 体内共存在三种的异构体:胞浆含铜和锌的超氧化物歧化酶 ,,.、线粒体含锰超氧化物歧化酶 . 。.和胞外超氧化物歧化酶 . ,.,脑内主要存在/. 和. 仉?。目前对在缺血再灌注后抗氧自由基损伤的作用存 在争议,有观点认为,,脑缺血再灌注后,活性的增高,会导致 聚集,若不能及时被或分解,。:经反应或被髓过氧 化酶,降解生成高毒性的?;增加神经元的死 亡幽。尽管有研究证实,在永久性局灶性脑缺血实验中,/.过 度表达,并未产生明显的神经保护作用?羽,但多数动物实验结 果仍支持了 的神经保护作用。研究发现,脑缺血再灌注损伤后,大量自由基产 生可消耗体内,活性明显降低陷副,在脑缺血再灌注损伤模型中, /.的过度表达可明显降低神经元死亡?们;而/.敲除小 鼠出现明显的梗死灶和脑水肿呤朝,线粒体.突变小鼠脑缺血后脑 梗死体积明显增加引,而.转基因小鼠可明显抑制缺血后脂质过 氧化和过氧亚硝酸盐生成,产生明显的神经保护作用有研究表明,血 小板活化因子受体拮抗剂可明显对抗内皮素一.,诱导 的局灶性脑缺血再灌注损伤,改善神经功能引,含有拮抗成分的银 杏提取物通过抑制线粒体钙超载、清除自由基、提高机体抗氧化能力而产 生明显的神经保护作用口’删,本实验结果显示,脑缺血再灌注损伤后血清 活力明显降低,给予金纳多和银杏内酯可明显增加血清活力; 免疫组织化学研究显示,脑缺血再灌注损伤后缺血侧大脑皮层受损伤的神 经元可见.阳性表达,给予金纳多和银杏内酯后,.表 达明显增强,金纳多组的.阳性表达明显强于银杏内酯组,提 示金纳多和银杏内酯可通过诱导的表达,增强机体抗氧化能力而 产生神经保护作用。 是催化.精氨酸氧化生成的,共有三种亚型,分别为 神经元型 ,、内皮型 ,和诱导型研究论文 。,经途径产生的可通过调节脑血流量而产 生神经保护作用,而经和途径产生的则可与一作用产 生过氧亚硝酸阴离子,一,一可进一步分解产 生高度活性的?,引起脂质过氧化而产生神经毒性作用。缺血早期体内 水平快速升高主要经和介导产生,而延迟性的水平 升高则是由诱导产生的,这种延迟性的水平的持续升高是导致 神经元损伤的主要原因,因此抑制的产生是治疗缺血性卒中的另一个 重要的治疗靶点【?。脑缺血再灌注损伤后,缺血核心区阳性表达明 显减少,而缺血半暗带表达增,等【】采用免疫组织化学 方法对自发性高血压大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后皮层神经元的 表达进行了研究,结果发现,大脑皮层正常神经元存在散在的免疫 活性表达,缺血再灌注后 缺血侧皮层表达最强,随着再灌 注时间延长表达逐渐减弱,并于再灌注后 返回基线水平。对 基因敲除小鼠永久性局灶性脑缺血研究结果显示,缺血 在缺血区实 质和血管系统可见表达,缺血 可见梗死区和梗死周边区域小胶 质细胞和星形细胞中存在阳性表达,基因敲除小鼠缺血 脑梗死 面积与野生小鼠比较无显著差异,而在缺血 脑梗死面积明显缩小, 提示迟发性的缺血性脑损伤与表达增高有关】。本实验采用免疫组 织化学方法,观察了缺血再灌注损伤后缺血侧皮层蛋白表达,发现 各组的动物缺血侧大脑脉络膜上皮细胞均有阳性表达,大脑皮层偶 见散在神经元和神经胶质细胞,这与等的实验结果一致;假手术组 皮层内小血管内皮细胞呈弱阳性表达,溶剂对照组小血管内皮细胞表达明 显增强,金纳多组血管内皮细胞阳性表达较溶剂对照组减弱,银杏内酯 组随着剂量的增加,内皮细胞表达逐渐减弱,本实验未观察到皮层神 经元阳性表达的明显改变,可能与实验选择的再灌注观察时间 点、 缺血损伤的严重程度差异有关。对于对缺血再灌注损伤的作用及药 物的干预尚需进一步的研究证实。 本实验证实特异性拮抗药??银杏内酯主要通过降低血脑屏 障通透性,改善缺血后微循环障碍,减轻脑水肿;增强内源性抗氧化系统 功能,抑制羟自由基的生成,减少其对细胞膜脂质、蛋白质和核酸的直接 损伤作用,减少脂质过氧化产物的产生而产生神经保护作用。研究 结 .脑缺血时,脑内浓度升高, 经细胞,破坏血脑屏障结构和功能, 出现梗死灶。银杏内酯通过降低血脑屏障通透性,改善缺血后微循环 障碍而减轻脑水肿,改善缺血再灌注损伤后的神经功能评分,缩小脑梗死 体积而对抗的神经损伤作用。 .自由基在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,减少自由基的产生可以 减轻再灌注过程对脑组织造成的损伤,银杏内酯具有捕获自由基 的作 用,可明显抑制缺血再灌注后羟自由基的生成,降低血清中羟自由基水平, 减少其对细胞膜脂质、蛋白质和核酸的直接损伤作用,减少脂质过氧化产 物的含量,显示了明显的抗氧化自由基损伤作用。 .为体内重要的抗氧化酶之一,是清除氧自由基的第一道屏障,其 活力的降低将增加自由基对神经元的损伤作用。银杏内酯可通过诱导 缺血再灌注损伤后.的表达,增强机体内源性抗氧化能力,明显 抑制缺血再灌注后血清中活力的降低。 .缺血再灌注损伤期间,过度表达可导致明显增加脑内水平, 进而产生神经毒性作用,银杏内酯可减少缺血再灌注后缺血侧小血管 内皮细胞表达,可能对缓解缺血再灌注损伤有一定的作用。 .本实验结果提示银杏内酯的神经保护作用主要是通过降低血脑屏障 通透性、抑制自由基生成、降低体内脂质过氧化产物的产生、增加内源性 抗氧化物生成,增强组织抗氧化能力来实现的。研究论文 参考文献 . .: ..., ,: . , , , . . ,,:.? 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