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犬前列腺特异性抗原(PSA)ELISA

2017-10-22 4页 doc 15KB 10阅读

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犬前列腺特异性抗原(PSA)ELISA犬前列腺特异性抗原(PSA)ELISA 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号:E0151c 预期应用 ELISA法定量测定犬血清、血浆或其它相关液体中PSA含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中PSA水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入PSA抗原、生物素化的抗犬PSA抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的PSA呈正相关。用酶标仪在45...
犬前列腺特异性抗原(PSA)ELISA
犬前列腺特异性抗原(PSA)ELISA 试剂盒使用书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号:E0151c 预期应用 ELISA法定量测定犬血清、血浆或其它相关液体中PSA含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫法测定标本中PSA水平。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入PSA抗原、生物素化的抗犬PSA抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的PSA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板:一块(96孔) 品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,2. 然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为100 ng/mL,做系列倍比稀释后,分别稀释成100 ng/mL,50 ng/mL ,25 ng/mL,12.5 ng/mL,6.25 ng/mL,3.12 ng/mL,1.56 ng/mL,其原液 直接作为最高标准浓度,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL,临用前15分钟内配制。 如配制50 ng/mL标准品:取0.5ml 100 ng/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的 Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。 3. 样品稀释液:1×20ml/瓶。 4. 检测稀释液A:1×10ml/瓶。 5. 检测稀释液B:1×10ml/瓶。 6. 检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释,稀释前根据预先 计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul 检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。 7. 检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测 溶液A。 8. 底物溶液:1×10ml/瓶。 9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液:1×10ml/瓶(2N HSO4)。 2 标本的采集及保存 1(血清:标本请于室温放置2小时或4?过夜后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20?保存,但应避免反复冻融。 2(血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8? C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20?保存,但应避免反复冻融。 注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 各试剂在使用前平衡至室温。 1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外,余孔分别加标准溶液或待测样 品100ul,注意不要有气泡,轻轻混匀,酶标板加上盖,37?反应120分钟。 2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。 3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul,37?,60分钟。洗板3次,350ul/每孔,甩干。 4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul,37?,60分钟,洗板5次,甩干。 5. 依序每孔加底物溶液90ul,37?避光显色30分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显 的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显)。 6. 依序每孔加终止溶液50ul,终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联仪在450nm波长依序 测量各孔的光密度(OD值)。 注: 1( 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2NHSO4。2 测量时先用此孔调OD值至零。 2(为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 洗板方法 手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。 自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的犬PSA,且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算 以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 注意事项 1( 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。 2( 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 3( 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。 4( 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。 5(在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。 6(底物请避光保存。 检测范围: 1.56 ng/mL -100 ng/mL 说明 1(试剂盒保存:-20?(较长时间不用时);2-8?(频繁使用时)。 2(有效期:6个月 3(浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。 4(刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影 响。 5(中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。
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