用荧光原位杂交（FISH）技术检测5例性分化异常患者标记染色体的来源

用荧光原位杂交（FISH）技术检测5例性分化异常患者标记染色体的来源 用荧光原位杂交(FISH)技术检测5例性 分化异常患者标记染色体的来源 中国优生与遗传杂志2007年第15卷第3期?37? 用荧光原位杂交(FISH)技术检测5例性分化 异常患者标记染色体的来源 贾婵维.王树玉.马延敏(首都医科大学附属北京妇产医院遗传生殖中心,北京100006) 摘要:目的确定标记染色体的来源以协助常规细胞遗传学诊断.方法按细胞遗传学方法制备标本.应用CEPY 光谱橙,CEPX光谱绿双色探针,标本经孵浴,消化,固定,洗片,脱水,变性,杂交,复染.结果发现5例性分化异常 患者中,3例标记染色体为代Y染色体的红色信号,另2例标记染色体为代表x染色体的绿色信号.结论提示荧光原 位杂交技术提高了对标记染色体的识别能力,从而协助常规细胞遗传学诊断,也为临床治疗性分化异常患者提供依据. 关键词:荧光原位杂交;性分化异常;标记染色体 中图分类号:R596.12文献标识码:B文章编号:1006—9534(2007)03—0037—02 AppHcafionoffluorescenceinsituhybridizationinthedetectionofunknownmarkerchromo somesof5abnormalsex— differentiationpatients.JIAChan—wei,WANGShu—yu,MAYan—min.(TheGenetic—ReproductiveCenterofBengOB/GY HospitalAffiliatedtoCapitalMedicdUniversity,Be杭ng10(0)06) Abstract:Objective:Todiagnosemarkerchromosome,wedetectedthemarkerchromosome byfluorescenceinsituhybridization (FISH).Methods:Afterhavingpreparedsamplingsbycytogeneticmethod,wehatched,dige sted,fixed,washed,dehydrated,de? naturalizedthesamplings,thenSamplingswerehybridizedbythepmbesofCEPXandCEPY, andfinallyre—dyedbyDAPII.Re? suits:Infiveabnormalsex—differentiationcases.Wefoundthatthreeoftllemhadredsignals.whichrepresentedYchrom osomes. whiletwopresentedgreensignalsmeaningXchromosomes.Conclusion:ThereforeFISHim provedthediagnosisofunknownmarker chromosomes,whichWasthebasisofclinictherapyinabnormalsex—differentiationpatients. Keywords:Fluorescenceinsituhybridization(FISH);Abnormalsex—differentiation;Markerchromosome 标记染色体为来源不清,用常规细胞遗传学方法无法确 切辨认的染色体,以英文Mar表示.随着荧光原位杂交(nu? orescenceinsituhybridization,FISH)技术运用,发展和成熟, 人们已经运用此技术来识别标记染色体和其它染色体结构 异常"-3j.特别是常规细胞遗传学与荧光原位杂交技术的 有机结合,提高了对标记染色体的识别能力,为临床诊断和 治疗的选择提供可靠的依据.本研究应用双色探针 CEPXspectrumgreen,CEPYspectrumorange,分别为x,Y染色 体特异性探针,来检测5例性分化性分化异常患者Mar是x 染色体还是Y染色体.从而为其临床诊断和治疗提供依据. 资料与方法 1.病例选择5例社会性别为女性患者,均表现为身材 矮小(<145cm),年龄为16—30岁之间,无月经,性发育幼 稚,在我中心做常规染色体检查(G,C带)后,仍无法诊断.1 例正常男性作为对照. 2.细胞遗传学检查采用常规方法制备外周血淋巴细 胞染色体检查标本,G带,c带,显微镜核型3—5个核 型,计数30个,嵌合体计数100个. 3.荧光原位杂交荧光原位杂交试剂盒选用美国Vysis 公司,CEPXspectrumgreen,CEPYspectnunorange,双色探针, 分别为x,Y染色体特异性探针. 标本杂交前准备:1)标本经2×SSC孵浴,10%新配置 的胃蛋白酶消化,0.95%甲醛固定,PBS洗片,最后分别在 70%,85%和100%脱水.2)标本放入73-I-1oC杂交液中变 性后,分别在70%,85%和100%脱水,置50%热板待杂交. 杂交:在标本中加10探针,立即加盖玻片,放置37?湿暗 盒6—24h.杂交后洗片和复染:分别在0.4×SSC/0.3%NP 一 40溶液和2×SSC/0.1%NP一40溶液中洗片并在黑暗中 干燥,加上10DAPIII复染,盖上盖玻片即可观察结果. 4.荧光原位杂交分析 在Leica荧光显微镜下分别用Rodanmin,FITC,DAPI3 色滤光块观察.计数正常男性200个间期淋巴细胞和中期 淋巴细胞分裂相以判断杂交成功率.细胞中出现红色信号 提示Mar来源Y染色体,绿色信号则为x染色体来源. 结果 1.常规细胞遗传学检查结果见表1. 表15例性分化异常患者标记染色体(mar) 细胞遗传学和FISH结果 2.荧光原位杂交结果 正常对照男性200个间期淋巴细胞和中期淋巴细胞核 分裂相中,98%出现杂交信号,2个细胞缺失x染色体信号, 所有细胞均出现Y染色体信号.病例1显示每个细胞内具 两个代表x染色体绿色信号,故Mar来源x染色体;病例2 与病例4相同,为嵌合体(比率不同),即部分细胞只出现一 ? 38?中国优生与遗传杂志2007年第l5卷第3期 个代表X染色体的绿色信号,而部分细胞含既出现一个代表 X染色体的绿色信号又有一个代表Y染色体的红色信号; 病例3亦为嵌合体,20%细胞只出现一个代表x染色体的绿 色信号,35%细胞含一个代表X染色体的绿色信号和一个代 表Y染色体的红色信号,45%细胞含一个代表x染色体的绿 色信号和二个代表Y染色体的红色信号(以下例图为代 表).病例5中,15%细胞有一个代表x染色体荧光信号, 85%细胞出现二个代表x染色体荧光信号.(图见封三) 讨论 常规细胞遗传学方法检查染色体通常运用G显带,如出 现诊断困难可采用C带,R带及银染等方法以达到诊断明 确,本文5例性分化异常患者的mar染色体用常规的细胞遗 传学方法无法确定.5例患者社会性别均为女性且性发育幼 稚,身材矮小,部分患者伴智力低下等Turner综合征的症状, 据报道这类患者如染色体核型中如含有Y染色体或Y染色 体片段,其性腺发生恶性母细胞瘤和无性细胞瘤的比率高达 10%,20%I4,5J.明确诊断可做预防性手术切除双性腺.因 此,确定其标记染色体来源Y染色体还是x染色体对临床 治疗上有重要的指导意义.我们收集的这5例患者,经常规 的细胞遗传学方法无法确定其来源.故采用荧光原位杂交 技术,此技术的可靠性有赖于制片的固定方法,探针的种类, 杂交细胞的种类,杂交前是否是蛋白酶消化等.目前所用的 探针主要有着丝粒卫星探针.染色体特异性探针池探针, 单一序列探针和端粒探针等,其中着丝粒卫星探针信号强 且特异性高,本文选用的就是x染色体和Y染色体着丝粒 卫星探针.杂交的细胞为培养后淋巴细胞,在杂交前使用胃 蛋酶消化,改善了细胞膜及核膜的通透性,有利于提高细胞 杂交的成功率,使FISH技术广泛应用产前诊断和临床疑难 病例,. 参考文献 [1]Cortes,GutierrezEl,Cerda—FloresRM,Silva—CudishJB,eta1. 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