海藻糖对含酶冻干品的保护作用

海藻糖对含酶冻干品的保护作用 ? 166? 文章?号i00]-~087(2001)03-0166—02 上海医学检验杂志2001午第i6楚基3期 海藻糖对含酶冻干品的保护作用 陈黎忠,季曦光,边广珠,刘群 (蚌埠医学院第二附属医院检验科,安徽2330~0) 摘要;目的研究在砖冻干燥一再水化过程中海藻糖对血情丙氨酸转氦酶(ALT),门冬氨酸转氨酶(AST)一 答氮酰转肽酶(.GT),碱性磷酸酶(ALP)乳酸脱氢酶(LDH),肌酸擞酶(cK)的保护作用,并挥讨了海藻糖对酶的 最佳保活浓度.方法采用酶动力学法,分别测定6种酶的活性,并计算出酶的保活率(%).结果在360d时含糖 组的平均保活率为94,7,而无糖组的平均保活率为58.1,显示海藻糖对血清酶有良好保活作用.结论通过 实验研究证实了海藻糖对酶蛋白具有保活作用,是酶蛋白良好的稳定荆. 关键调:海藻糖酶蛋白冷冻干燥一再水化保活率 中囝分奘号:R979,4文献标识码:A 研究表明.促使海藻糖身价培增的重要原因是 外源性海藻糖同样具有对生物大分子良好的非特异 性保护功能[1].海藻糖独特的保护功效引起各国科 学家极大兴趣,为利用海藻糖生物学特性的应用性 研究拓宽了新领域,尤其是分子生物学应用性研究. 逐渐形成一大研究热点 我们利用海藻糖这个多元化合物特性对酶蛋白 分子表面进行保护.结果表明.海藻糖能增强酶蛋白 分子耐干燥一再水化的稳定作用.制备的冻干品,血 清酶活性稳定可靠是一种良好的多酶质控品. 材料与方法 一 ,材料 I.试剂海藻糖(蕈糖,a,a—Trehalose)分子 式c,:H:?2HtO,相对分子质量;37833,由上海试 剂二厂生产{丙氨酸转氨酶(ALT),门冬氨酸转氨酶 (AST)Y一谷氨酰转肽酶(Y—GT),碱性磷酸酶 (ALP),乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶(cK)测定试剂 均为上海复星长征医学科学有限公司TRACE产品. 2.仪器LGg—EC型冷冻干燥机(国产); CHIRON一560型全自动生化分析仪(美国产);BC 151冰箱(国产). 二,方法 血清收集收集混合人血清若干ml'立即 1. 检测新鲜混合血清酶活力单位,然后分装于棕色玻 璃瓶中.每瓶2.0ml,为不加海藻糖保护组(无糖 组).另外,定量称取海藻糖于混合血清中,使达0.1 mol/L,0.15mol/L,0.2mol/L,0.25mol/L4个浓 度,每瓶2.0ml于棕色玻璃瓶中(含糖组).待冻干. 2.冻干品制备分装后血清酶置冷冻干燥机 内,打开瓶盖先速冻30min后,再连续冷冻10h后 呈粉末状,封装,置4"C中保存备用. 3,酶活性测定分别在30,60,120,240,360d 时把冻干样品再水化后分别检测含糖和无糖组及 RANDOX质控品的酶活力.方法采用酶动力学法 (Kinetic),双波长,反应温度37?.酶活力单位用 U/L表示. 4,酶保活率计算: 保活率() 有海藻糖或无海藻 糖保护酶活力单位 新鲜混合后 酶活力单位 ×100 通过保活率公式计算以观察酶蛋白冻干一再水 化后的稳定性. 结果 一 ,血清酶冷冻干燥稳定性时效性观察,混合 血清冻干品置4?下保存1年观察其稳定性,结果 见表1. 含糖组(六酶)保存4?360d后,测其保活率 ()为92.9,98.9,平均保活率为94.7,而 无糖组(六酶)其平均保活率为58.1,含糖组保活 率是无糖组平均保活率的1.63倍.无糖组(ALT) 在360d后保活率仅为27.7,酶活性也损失了近 50.O表明:海藻糖对酶蛋白确有良好保护作用. 二,4种不同浓度海藻糖对酶活性的影响,结 果见表2. 上海医学幢噎杂志zOO1年第l6卷第3期 表I海藻糖对血清酶稳定性保护作用 注:Y表示加入浓度为0.15mo[/L海藻糖,N表示末加入海藻糖 衰2海藻糖浓度对酶活性影响 含糖组(六酶)不同海藻糖浓度其保活率在 82.1,100.0之间,仅发现0.25mol/L的海藻 糖对ALP有轻度抑制外,其他浓度对酶的保护效果 较好(保活率>90)当海藻糖浓度低于0.10 mol/L时对酶保活作用不佳,而浓度大于0.30 mol/L时有部分抑制酶活性的现象,建议保活浓度 为0.15,0.20mol/L较适宜. 讨论 海藻糖做为生物大分子的干燥稳定荆,其保护 机制不甚明了.目前有人认为蛋白质分子被干燥时, 海藻糖制造了与为维持生命体所必须的水分子相似 构造,替换了水分子也有报道推测,细胞在干燥环 境下,由于干燥失水伴随的细胞内盐浓度的变化,导 致蛋白变性,膜构造变化.已发现在海藻糖存在下进 行干燥的磷脂质,证明了海藻糖起到了生物体膜的 水代替物的作用实验中无糖组(六酶)在30d时酶 蛋白损失15.0而观察到360d时损失达41.9 酶蛋白 (酶失活50.0以上),在质控中无法使用. 这些变化可能与酶蛋白分子失去维持其结构和功能 特性的结构水膜有关.海藻糖则能使酶蛋白分子的 失水部位以氢键形式与酶蛋白表面分子相连接,也 能通过氢键有效地与外部水分子相连接,稳定酶蛋 白分子…. 通过对酶冷冻干燥一再水化的研究,从而证实了 海藻糖在冻干一再水化过程中,对酶蛋白有很强的保 活作用,但浓度不易过大,否贝4对酶产生挪制作 用]含海藻糖血清酶冻干品,质控中使用效果良 好,酶活性稳定,完全可以替代进口质控品使用. 参考文献 [13Colacoc.SenS,ThangaveluM,eta1.Extraordinary stabilityofenzymesdriedinTrchatose:simplified MoteeolarBiology[J].Bio/Tech,1992,10:1007-1010. [2]尤新.功能性发酵制品EM3.第1版北京:中国轻工业 出版杜,2000.92. is3黄成垠,安国瑞,王庆敏.等.海藻糖对医用诊断工具酶 活性保护[『].微生物学通报,1997,24(6):341—343. [4]李群,嶷勤生,李永丰.海藻糖对酶热稳定保护作用的研 究[J].药物生物技术,1997,4(1):28-31. [53陈黎忠,边广珠,李曦光,等.海藻糖对人血清抗冻结性 保护研究[『].医学研究通讯.2001,a0(1):44-46. (收稿:2000—10-30修回:2001—01-10) (率文编发:龚晓霖) 国家级继续医学教育《临床实验诊断技术新进展》学习班 经国家卫生部批准,上海第二医科大学附属瑞金医院将于2001年l0月下旬,11月上甸举办《临床实验诊断 技术新进展》学习班(项目编号:2001—0Z一08—015),本班以实验诊断为重点,较系统介绍各专业实验诊断技术与进 展,临床应用的实际价值和意义,以及实验室质量控制和管理等由本院王鸿利教授等长期从事实验诊断及技术 的知名教授和专家授课.参加对象为从事实验诊断及技术的临床医师,检验及技师等医,卫技人员(中级及中级以 上职称).本学习班为期7天,学习期满将授予结业证书及I类学分16分.学习班费用(包括费)700元,交通 食宿费自理. 意欲参加者,请与上海瑞金医院继续医学教育办公室联系或报名联系地址:上海瑞金二路197号,上海瑞金 医院继续医学教育办公室沈以刚老师,邮编:200025,电话:021—64370045转662714分机. 上海第二医科大学附属瑞金医院 2001年5月15日