大豆凝集素的分离纯化和细胞凝集活性的研究

大豆凝集素的分离纯化和细胞凝集活性的研究 中文摘要 大豆凝集素的分离纯化和细胞凝集活性的研究 摘 要 本研究在亲和色 谱法分离纯化大豆凝集素的基础上，通过比较大豆凝集素付兔和鸡小肠上皮细胞与红细胞的凝集作用，以及各种糖配体与大豆凝集素结合后，对其 寻求凝集活性的影响， 评价大豆凝集素杭营养活性的适宜( 试验一:采用亲 语法分离 和色 纯化大 ,, , 豆凝集素(以, 丰乳糖为亲和吸附剂，以环氧氛丙 烷活化的琼脂糖凝胶为载体， (, , , , 将大豆粗粉抽提液吸附于经过 , , ,, 的 ,,, , 溶液预先平街的亲和色 (, 比 , ,, ( ,, , , 语柱后，分别用 , , , 的 , , 洗脱液和含 , , , ,一 ,半乳 , , (,, 的,。洗脱液分步洗脱，, 糖的,,,, , 收集第二步洗 将, ,大 脱液， , ( 各管 , 透 冻 后即于, 的 合并、 析、 干 得到,,提, 取产物( 化的 纯 产物经, , 的聚 ( , , 胶浓度为 ,,)丙烯鱿胺凝胶电泳 ( , ，考马斯亮蓝染色，显示出 , 一条与 , , 品, ,) 同 , , 带 说明 和色 可以(, ,目 的着色 ， 用亲 讲法 获得纯 的大 凝集 豆 素 得率 每 , 大 , 得, 士 (, , ,为 , , 豆粗粉获 产物， 度较高 , , ,, 最终提取物( 化的大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞和红细胞的凝集活性。 试验二:测定纯测定大豆凝集素对红细 , 胞的凝集能力时，采用 , 兔红细胞惫液，测定了使兔红细胞, 凝集的蛋白质最低浓度(经血凝试验结果明，,, , , 使兔红细胞 ,, 凝集的, ,蛋 质最 度为,, ( , , 低浓 , ,, (,, 创 , , 胞没 作左右，而,,对鸡的红细 有凝集白 用(在测定 ,对兔小肠上皮细胞的凝集能力时，采用荧光标记 , , 与新鲜小肠上皮细胞结合后，观察荧光显微镜下荧光结合细胞比例的方法定童(结果表明大豆凝集素对兔和鸡的肠 , ,细胞具有相似的结合能力，其中, ,与兔肠细胞的结合率为,, 左右( 试验三:测定糖配 ,一 , 体对大豆凝集素凝集活性的影响(试验分别选取了?帷“肴?, , 硫代半乳糖普 ( , , ,,,糖、,孰基丰乳枪、几丁质、异丙基一 ,一, , ,,, , , ,, , ,,,, ,,, , 和,乳糖, ,,,, ，,,, ,;,，, ) 一 体( 种糖配 先将, 种糖配体分别与大豆凝集素结合， ,再分别比较 , ,结合糖配体后时红细胞凝集活性和肠细胞结合率的影响( 结果发现，除了几丁质外， 几种糖配体都能降低大豆凝集素对兔血红细胞的凝集活性和肠细胞结 ,一 ,合能力，各种糖配体对凝集活性与结合能力的影响排序大致相同(其中, 半乳糖的效果最显著( 总之，通过研究 发现:?利用亲和色 语法可以获得纯度较高的大豆凝集素;?大豆凝集素能凝集兔红细胞， , ,与兔和鸡小肠上皮细胞的结 但不能凝集鸡红细胞; ,合能力相似，说明用小 , 可以 , 肠上皮细胞结合率评价 , ,的抗营养活性， 进免 , ,与 ,血液红细胞凝集的种间差异(?加入特异性糖配体后，可以抑制 , , 的血凝活性和 中文摘要小肠上皮细胞结合能力， 有望 通过筛选高亲和力的糖配体， 寻找到外源添加糖配体消 ,除 , ,杭营养活性的方法(关键词:大 素;纯化;血凝活性; 豆凝集 ? 肠细胞结合活性 英文 摘要 , ,, ， ,, ,,, ,,， ， ,, ,, , ,,,, , ,, ,,, ,， ,,， , ，,, , , ,, , ,,, ,,,,,,,,,,, ,， ， ,,, ,,,, ‘ ,,,,,,,, ,, , ,, , ,,,, , , , , , ,,, , , , ,， ,, ,, , ,, , , , , , , , ,, , , , , , , ,, ,, , , ,; , ,,, ;, , , ,, ,, , , , , ,,,,, ; , , ,,, , ,, ,, , , ,,,, , , , , , , , , , , , , ,, , , ; , , , , , ,, , , , ;,;, , ,, , , , ,,,, , , , , , ,, , , , , ,,,, ) , , , , , ,, ,, ,, ,,, ( , , ,, ,, , , ,, , , ,,, ,,( , ,, ,, ,,,,, ,, ;, , ,, , ,,, ,,, , , , , , ,, , , , , , , , ,,, , , , , , , ,,, , , ,, ,, ,,, , , , , , , , ,, , , , , , ,,, ; , , , , , , ,,,,,,, , ,, ,, , , ,, ,, ,,,,,, ,, , ( ， ,,, ,, , ,,,, , , ,, , , , , , , , , , , ,, ,,, , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , ， , , ,, , , , ,; , ,, , ; , ,,;, ,, , ( , ,, , ,, , , , , , , , , , ,, ,, , , , , , , ,, , ,, , , , , ; , , , , , , ,,,, , ,, , ,, , , , , ,,, , , ,,,,,, , ,, , (,,; ),, , , ;,;, , , , ( , , , , ,, , , ( , , , , , , , , , , , ; , , ,, , , , ,,, , ,,, , ,, , ,,, , ,,,( , , , , , , , ，,, , ,,, , , ,， ,, , ,, , , , ( , ,,,, ,, , , ( ,, , , , ( , , , ; , , , , , , , , , , , ,,, , , , , , , ;, ,, , , , , , , , ,, , , ,, , , ( , ;,;,, , , ,, ,, , ( ,, , , , ,,;, , , , , , , , , , ,, , ,, , , , , , , , , ,, , , , , ,,， ,,， ,,, ,,, , , ,,,, , , , , , , , , ,,, ,( ,,;,, , ,, , , , ,, , ， , , , , , , ,, , ,, ,,, , , ,;,,, , , , ,, , , , , , ,,, , , , , , , , , , , , , , , (( , ,,, ， , , ,, , , ,( 玩,,, ,, , , , ; ; ,,, ; ,, ,, , , ,, , ,,, ,,, ,, , ,, , , , , , , , , , , , ， ,, , , , , , ,, , , ;, ,, , ,, ,, , , , , , , , , , ( , ,( , , ,,, , ,, , , , , , , , , , ( , ,, , , , , ,, , , , , , ,; , , , , , ; ,, ,, , , ,,， ,, ,,, , ,, ,, ,, , , , , , , ,,, ,, ,, , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , ，, , , ,, , ; ,,,, , , ( , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , ,, , ,, ,, , , ,,, ( , , , , , , , , , ,, , , , , , , , ,,, , , , ,, , , ,, , ,, , , , ,; ,,,, , , , , , , , , , ,,, ; , , , ,,, , ; ,,,, , , , ,, , , , ,, ,, , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , ,, ;, , ,, , , , , ,, , , , , , , , ,, ,, , , , , ， , ;, , ,,, ,, , , , , , ; , , , , , , , , , , , , ,; ( , , ,, ,, ,, , , ,, , , ,, ; ( ,, , , , , ,,,, , ;, , , , , ,,,, , , ,, , , , ， , , , , , , ，,,, ,, , , , ,, , ,, , , , , ,,, , ,, , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , ,, , , ;, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, ,,; , ,, , ,, ,, , , , , , ,, , ,,, ,, , , , , , , , , , , , , ,, ( , , , , ， , ,, ,, ; , , ,,, , , , ， ， ,; , , ,; , , ,, , , , , , , , , , , ,, ;,, ,, ,( , , , ,, , ,, , , ， , ， , ,,, ,, ,, ; ,( , ) ,,, , , , , , ; , , ， , , , , , , ,, ， , , , , , ( , , , , ,; , , , , ,,,,, , , , ,, ; , , , ,, , , , ,;, ， , ,, , , , , , , , ,, ,, , , , , , , ,, , ,,,, , ,, , , , ,, , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , ,,,,;, ,; , , ,, , ,, , ,, , ,,, , ; , , , ,, , , , , , , , ,,, , , , , ,, , ,, ,, , , ( , , , ,, , , , , , , , , , ,, , , , , , ,, , , , , ,, , , ,, , ,,, , , ,;, , ,, , ,,,， , , , , , ,, ,, , , , , ,, , , , ,, , ,, , , , , , , ( , , ,, ,, ; , ,, , , ,, ,, , ; ， ,, , ， ,, , , ,, , , , , ,,, ; , , , , , , , , , , , , , , , , , ， , , , , , , , , , , , , , , ,, ,: ,, , , , , , , ,,,, , , ,, , , , ,;,, , ; , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, ;,,, ,,,( ,, ， , , ,,, , , , , , , ;, , 英文摘要 ,;, , ,, ,, , , , ,,,, ,, , , , , ; ,, , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , ,,, ,,, ,, ,,, , ;, ,,, ( , ,, , ,, ;, , ,, , ,, , , , ,, , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,, , , , , ,, , ,, , ,; ( ,, ,,;;, , , ,, , , , , , , , , ,, ,, , , , , , ,, , , , , , , , ,, , , ,, , , , , , , , , , , , , ,,,, ;, , ,; , , ,,, , ,,, , ;, ,,, ,, ,, , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , ,, , ,, ,, ; ( , , , , , , ,, , , ,, , ,, ,, , , ;, ,, , , ,, , , ,, ,,,( ,, , ;, , , , , , , ,,,,,,, ,,, , , , ,,, ,, , ,, , ;, , ,, , , ,, , , , , , , , , , , , , ,,, ,, , ; , ,,, ; , ,, , , , , ,,; , , , ,, , , , , , , , ,; , , ,, , ,, , , , , : , , ,,, , , , ,, ,,, , ,,, , , , ,, , , , ,;, , ,, ,, , , , ,, , , , , , 研究生学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本文不包含任何其他个人或集体已 对本人研究所做出重要 经发表或撰写过的作品成果。贡献的个人及集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 位文者王率 学论作: 年 月“ 如‘ ‘ 弓 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国 允许论文 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内被查阅和借阅。容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 密口 在 解 后 用 授 书( 位论 属 不 团保 ， 一 年 密 适 本 权 本学 文 于 保密 ( 请在以上方框内打“” ,) ’ 年‘ , ” , ‘ 月, 位文者“ , 汀 , 学论作签, 少 ‘年 ‘月, 导师签名: 内 、 人 ‘ , ‘, ( , 了 ， , 自 不 ( ( ( ( ( ( , ( 引言 引 言 凝集素 ( ;,) ,, 或) ,,, 是一类非免疫原性、具有糖结合专一性、能凝集细胞和 (沉淀含糖高分子的蛋白质或糖蛋白。广泛存在于植物、动物和微生物中。据研究，凝集素采食 动 过量时， 物表现为日增重减少，饲料利用率下降并影响其免疫 , , 系统功能〔( ,〕叨， , 大 及其饼粕是 饲料工业和养殖业最主要的蛋白 豆 我国 饲料， ,,, 大豆凝集素(,,,,, ,,, , ) 影响其营养价值 , ,,， , ,,, ,, 是 和产品稳定性的主要因素之一。冯定远和汪做的研究表明，大豆凝集素的抗营养性表现为饲料消化率低、生长抑制或消瘦、肠壁增厚 道过 ,( , , , , 研究结果则表明，由 , ,引 , ,和消化 敏反应等, , , 等的 , 起的生长抑制约占 大 中 部 营 因 作 结 的 半网 因 ， 何 观的 价 豆 集 抗生 豆 全 抗 养 子 用 果 一 【( 此 如 客 评 大 凝 素 营养活性，进一步提高其利用效率是相关学术界和产业界普遍关注的问题。 ,的抗营养活性方面，已有的研究往往只是采用 , ,对人或动物的红 在评价,, ,细胞凝集能力这一指标。然而就营养学角度而言， 大豆制品作为饲料，其凝集素危害的直接对象应该是消化道。 , ,对肠道消化吸收组织的影响才应该是判断其抗 因此， , 性的 ,, 等的 , 经涉 ,营养活 合适指标( ,, 工作已 及到,,对肠道消 兆橹挠跋欤侵皇遣舛擞氤Φ?, 量 ,， , , 结合的,,的 , 并未确定,,对肠道的 用。 抗营养作 国内对大豆凝集素的抗营养作用虽然早有认识，但是大多处于文献综述阶段，尚未见实验研究报道。 因此，建立能客观评价凝集素抗营养活性的方法和指标，将有助于准确评价大豆制品的营养价值 。 凝集素及其抗营养作用研究进展,凝集素的研究概况 植物凝集素是发现最早、也是研究最为深入的凝集素，目前已经发现了几百种 。 数 物的种子 绿色组织中绝大多 植 和 都含有凝集素 (, ,, ,, ， , 〔 ,, ,; ,和, , , ) , , ,, , , , , ,(因此，植物性食物或饲料中都含有一定水平的凝集活性。其中，由于豆类在食物和饲料中的重要性，其凝集素的潜在毒副作用受到了研究者的高度重视，豆类凝集素含量高、易于分离纯化，凝集活性高，是理想的研究对象。因此，相关研究也最为深入。(,, 凝集素的定义和分类(,凝集素的定义 ,,( 人类对于凝集素的 认识已 ,, ,, , , ,就发现蓖 , 有一百多年的历史。早在 ,, 年， ,, ,麻籽的提取物中有一种能够凝集动物红细胞的物质。后来人们又从其他植物中陆续发现了类似的物质。因为这类物质的一个共同特点就是能使动物红细胞发生凝集反应, 将它 统称为红 胞凝集素或凝血素 ( ,,,,, ) , ,,， 们 细 , ,, , , , ,,,, , ,,和,,, , ,, , , ,, 发现某些凝血素只能凝集人类, , , 血型系统中某些组群的红细 即 血素具有血型胞， 凝 ,( .