吲哚美辛眼用缓释微球的制备及性能评价(可编辑)

吲哚美辛眼用缓释微球的制备及性能评价(可编辑) 吲哚美辛眼用缓释微球的制备及性能评价 吲哚美辛眼用缓释微球的制备及性 能评价 1 1 13 2 1 2 1 325027 2 高颖 吴艺君 李杰 金蓉蓉 李文生 温俊 温州医学院附属眼视 光医院 浙江温州 温州医学院药学院 浙 325027 3 325027 江温州 温州市生物材料技术研究中心 浙江 温州 - PLGA Eudragit RS 100 O W 摘要 目的 制备吲哚美辛聚乳酸 羟基乙酸共聚物 眼用缓释微球 并进行征 采用 PLGA Eudragit RS 100 溶剂挥发法制备吲哚美辛 微球 对微球的表面形态 载药量 包封率 体外释放特点 粒径 有机 溶剂残 RPE cells PLGA 留量 表面电位进行了表征分析 使用人视网膜色素上皮细胞 评估空白微球的细胞毒性 结果 载体材料 Eudragit RS 100 1? 3 1 676 4 ? 739 5 nm 与 质量比为 的吲哚美辛微球 电镜 观察颗粒分布均匀 表面光滑 平均粒径为 载药 18 79 ? 0 19 98 25 ? 2 11 1 量为 包封率为 第 天存在突释 随后可以缓慢释放一个月左右 有机残留量平均为 267 33 ? 13 57 ppm PLGA Eudragit RS 100 空白微球表面电位为正电荷 空白微球 无细胞毒性 结论 吲哚美辛 眼用缓释 微球具有包封率高 粒径窄 体外释放缓慢 安全性好等特点 具 有很好的临床应用前景 - 关键词 吲哚美辛 聚乳酸 羟基乙酸共聚物 聚丙烯酸树脂类 缓 释微球 溶剂挥发法 中图分类号R944 文献标志码A 文 章编号1001 , 2494 2012 17 , 1391 , 05 Preparation and Physicochemical Evaluation of Indomethacin Sustained-Release Microspheres for Ophthal- mic Delivery 1 1 13 2 1 2 GAO Ying WU Yi-jun LI Jie JING Rong-rong LI Wen-sheng WEN Jun 1 Eye Hosp ital School of Op hthal- mology and Op tometry Wenzhou Medical College Wenzhou 325027 China 2 Wenzhou Medical College Pharmacy School Wenzhou 325027 China 3 Biomedical Engineering Academy Wenzhou Medical College Wenzhou 325027 China ABSTRACT OBJECTIVE To obtain sustained-release indomethacin PLGA Eudragit RS 100 microspheres for ophthalmic applica- tion and to evaluate its quality METHODS The microspheres were prepared by O W solvent evaporation using PLGA and Eudragit RS 100 The morphological drug content entrapment efficiency release behavior particle size residual organic solvent Zeta poten- tial of indomethacin PLGA Eudragit RS 100 microspheres were determined meanwhile the cytotoxicity of blank microspheres was e- valuated using PRE cells RESULTS Indomethacin microspheres containing PLGA and Eudragit RS 100 at the weight ratio of 1? 3 had even particle size distribution and their surfaces were smooth under scan electronic microscope and the mean diameters were 1 676 4 ? 739 5 nm The drug content and entrapment efficiency of the microspheres were 18 79 ? 0 19 and 98 25 ? 2 11 respectively Indomethacin was released slowly for a month from the microspheres though burst release was observed within 24 h The mean residual organic solvent was 267 33 ? 13 57 ppm The zeta potential of all blank PLGA Eudragit RS 100 micro- spheres was positive The blank microspheres showed no sign of toxicity CONCLUSION Indomethacin PLGA Eudragit RS 100 mi- crospheres have a better clinical application prospect due to its high entrapment efficiency narrow distribution slow release and ocular safety KEY WORDS indomethacin PLGA Eudragit RS 100 sustained-release microspheres solvent evaporation nonsteraidal anti-in- 吲哚美辛为非甾体抗炎药 性疾病 炎性疾病 疼痛等疾病的治疗 近年来 吲 flammatoey drugs NSAIDs 它能直接抑制环氧化酶 哚美辛逐渐应用于眼科疾病防治中 包括眼部炎 Cox PG 〔1-2〕 〔3〕 〔4〕 〔5〕 活性 阻止前列腺素 合成 对脂氧 酶也 症 白内障手术 青光眼 眼底病 等 市场 LT 0 1 有抑制作用 从而减少白三烯 生成 吲哚美辛 上使用的是 吲哚美辛滴 眼液 由于眼是一个 具有良好的抗炎 解热 镇痛作用 广泛用于类风湿 相对独立的器官 具有自身屏障和保护系统 药物会 20 10R4 13051 2009A138 基金项目 浙江省大学生科技创新活动计划 新苗人才计划 资助 项目 浙江省医药卫生科 学研究基金资助项目 Y200900 14 wyx20 100 1007 温州市科技局面上项目资助 温州医学 院本专科学生科研立项资助课题 作者简介 高颖 女 研究生硕士 研究方向 眼科 用药和生物材料在眼科应用 通讯作者 温俊 女 副教授 研究方向 药理和生物 材料应用 Tel 1XXXXXXXXXX E-mail terwj2004 yahoo com cn ?139 1 ? 20 12 9 47 17 Chin Pharm J 20 12 Sep tember Vol 47 No 17 中国药学杂志 年 月第 卷第 期 RS 100 5 mL 通过眼泪 瞬目损失 从而导致传统制剂的药物生物 载体材料溶解于 二氯甲烷中 精密称 〔6〕 〔7〕 利用度低 吲哚美辛在玻璃体内半衰期短 对 取一定量吲哚美辛原料药溶解于溶有材料的二氯甲 50 于病程长的眼后段疾病需要多次给药才能达到治疗 烷中 将油相在高剪切分散机搅拌作用下滴加至 mL 2 PVA 20 000 r ?min , 1 10 浓度 这就增加了眼部其他副作用 降低了病人用药 水相中 搅拌 min 的顺应性 后得 到乳液 将乳液倒入旋转蒸发仪中 室温 下旋转蒸发乳液 中的有机溶剂 150 r ?min , 1 4 微球制剂因能维持药物有效浓度 降低患者用 - h 3 药频率 提高患者顺应性而广受关注 聚乳酸 羟 得到的乳液离心分离 再用双蒸水洗涤 次 基乙酸共聚物 〔poly D L-lactic-co-glycolic acid 最后 冷冻干燥 PLGA 〕 2 2 微球表面形貌 的安全性 生物相容性和可降解性早已被 FDA 将冷冻干燥后的吲哚美辛微球粉末均匀涂抹在 美国 证实 目前已广泛应用于控释系统 聚丙 〔8-9〕 烯酸树脂类也已很早应用于缓释制剂中 有实验 导电胶上 喷金制成电镜标本 经扫描电镜观察粒 Eudragit RS RL- 径分布情况及表面形态 制备 吲哚美辛缓释固体分散剂 但 2 3 载药量和包 封率 是粒径较大 缓释时间短暂 不能满足病程长的疾病 的需求〔10〕为了避免多次注射引起的并发症和给 载药微球中吲哚美辛的含量通过 HPLC 检测 病人带来的痛苦有必要研究吲哚美辛眼用缓释 色谱条件为ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱 4 6 , 1 微球 mm ? 150 mm 5 m 0 1 mol ?L μ 流动相 冰醋酸 - 20 ? 80 320 nm 30 ? 溶液 乙腈 检测波长 柱温 1 材 料 1 0 mL ?min , 1 20 L 流速 进样量 μ 在此色谱条 1 1 试剂 件下 2 296 min 10 吲哚美辛 的出峰时间为 称取 mg 1 mL 吲哚美辛原料药 中国药品生物制品检定所 吲哚美辛微球 用色谱条件下的流动相 超 100258-200904 PLGA 50 ? 50 30 min 0 22 m 批号 相对分子质量 声溶 解 然后将溶液通过 μ 有机微孔 60 000 济南岱罡生物工程有限公司 Eudragit RS 滤膜过滤 再用 流动相稀释到一定浓度进样 根据 100 PVA HPLC 赢创罗姆药用树脂部 德国 相对分子 曲线计算 30 000 , 70 000 81 , 90 Sigma 2 4 质量 醇解度 公 体 外释放 10 mg 司 二氯甲烷 分析纯 二甲基甲酰胺 分析纯 精密称取载药微球 放入透析袋中 相对 RPE 7 000 3 50 mL 乙腈为色谱纯 冰醋酸为分析纯 超纯水 人 细 分子质量 每个样品平行 份 放入 离 0 0 1 mol PBS pH 7 4 , 7 6 10 mL 胞 温州医学院眼视光学院 侯陵教授惠赠 心管中 加入 做 1 2 仪器 37 ? 100 r ?min , 1 为释放介质 于 恒温摇床 进行 1200 安捷伦 系列高效液相色谱仪 美国安捷伦 体外释放 分别于预先设计的时间点取样 每次取 Discovery DV 215 CD 4 mL PBS 公司 电子分析天平 美国奥 样 再加入等量的新鲜 溶液 吲哚美辛的 豪斯公司 CHRIST ALPHA 1-4 2-4 LD plus 冷冻干 HPLC 浓度通过 检测 再根据标准曲线计算累积释 CHRIST T10 燥机 德国 公司 型高剪切分散机 德 药百分率 IKA RE , 2000 2 5 国 公司 旋转蒸发器 上海亚荣生 有机溶剂残存 Nova Nano SEM 200 FEI 化仪器厂 扫描电镜 公 在微球制备过程中 只使用了二氯甲烷一种有 GCT900 司 气相色谱仪 上海天美科技仪器有限 机溶剂做为油相 微球中二氯甲烷量通过气相色谱 N4PLUS 250 ? FID 230 ? 公司 粒度分析仪 美国贝克曼库特公 仪测定 气相条件 进样口 柱 Zeta Plus Mo- 80 ? 10 min 10 mL ?min , 1 司 分析仪 美国布鲁克海文公司 箱温度 载气流速 柱 lecular Devices Spectra M5 M5e 美国分子 282 KPa 0 05 L 压力 进样量 μ 二氯甲烷出峰时 仪器 0 32 min 3 10 mg 1 5 间 平行称取 份样品 微球到 mL 1 mL 30 min 离心管 再 加入 二甲基甲酰胺 超声 2 方 法 0 05 L 使微球充分溶 解 然后用微量进样器吸取 μ 2 1 吲哚美辛缓释微球的制备 溶 液进样测量二氯甲烷残留量 吲哚美辛缓释微球根据乳化液中干燥法 O 2 6 Zeta 电位分析 〔11〕 W 进行制备 先将 250 mg 的PLGA Eudragit 2 , 3 取少量冻 干粉末 分散于超纯水中 超声 ?1392 ? Chin Pharm J 20 12 Sep tember Vol 47 No 17 20 12 9 47 17 中国药学杂志 年 月第 卷第 期 min PLGA Eudragit RS 100 1? 3 使其充分分散 然后静置一定时间后悬液达到 增加 当 和 的质量比例为 18 79 ? 0 19 稳定后 利用电位分析仪测定微球表面电位 时 载药微球的载药量为 包封率 2 7 激光粒度仪 可达到 98 25 ? 2 11 150 mL 3 3 取少量冻干粉末 分散在 超纯水中 超 吲哚美辛微球体外释放测定 0 5 , 1 h PLGA Eudragit RS 100 声 使其充分分散 在室温下 利用激光粒 以 和 不同比例制备的吲 5 ? 3 度仪检测微球的平均粒径 样品的浓度维持在 哚美辛微球 其体外释放结果见图 各组载药微 10 , 4 counts ?s , 1 90 ? 球均比IN PLGA Eudragit RS 激光扫描角度 原料药释放缓慢 当 与 2 8 PLGA Eudragit RS 100 100 1? 0 1 空白微球的安全性 的 质量比为 时 第 天存在明显突释 且体 2 8 1 RPE RPE DMEM 1 PLGA Eudragit RS 人 细胞培养 人 细胞在 外释 放仅能维持 周左右 当 与 F12 1? 1 10 2 mmol ? 100 1? 3 1 完全培养基 含 胎牛血清 的质量比为 时 虽然在第 天存在突释现 L , 1 50 mg ?mL , 1 1 谷氨酰胺 庆大霉素 中培养 置于 象 但是与其他比例下制备的载药微球相比 第 天 37 ? 5 CO 2 恒温恒湿培养箱内 取对数生长期细 的突释量少 在随后的一个月时间里体外释放速 胞进行实验 度慢 2 8 2 浸提液制备 本实验使用浸提液考察空白 3 4 吲哚美辛微球有机溶剂残存量 〔12-13〕 5 mg 3 微球对细胞毒性 称取空白微球 分别 测得 组样品的平均二氯甲烷残留量为 放入含血清的培养液3 mL 0 026 7 ? 0 00 1 36 20 10 《 中 在相同的体外释放 低于 年版 中国药 37 ? 100 r ?min , 1 》 条件下 制备浸提液 孵育 典 对二氯甲烷残留的限定 72 h 3 5 后离心取出上清液 该上清液即空白微球的 吲哚美辛微球的表面电荷量 Zeta 1 浸提液 载药微 球 电位结果见表 随着载体材料 2 8 3 5 ? 104 RPE Eudragit RS 100 Zeta 细胞毒性 将每孔 个的人 细胞 比例的增加 空白微球表面的 接种于96 37 ? 5 CO 孔板内 细胞置于 2 恒温恒 电 位为正电荷且呈递增趋势 载药微球是理论载药 48 h 4 湿培养箱内分别培养 后 每组均设 个复孔 150 L 待细胞贴壁后 弃去上清液 加入浸提液 μ 未 37 ? 5 加空白微球浸提液组设为阴性对照组 于 CO 24 h MTS 20 L 2 孵箱中培养 后 然后加入 液 μ 继 续在孵箱中培养 2 h 最后用酶联免疫检测仪测定 relative growth rate 光密度 通过细胞相对增殖率 RGR A A 实验组 均值 阴性对照组 均值 衡量 〔13〕 细胞毒性作用 2 8 4 统计学分析方法 使用SPSS17 0 统计软件 ? x ? s 进行数据分析 所有结果均以均数 标准差 珋 t P , 0 05 表示 组间比较采用配对 检验 以 为差异 有统计学意义 3 结 果 3 1 微球表面形态观察 电镜观察吲哚美辛PLGA Eudragit RS 100 微 球 可见表面光滑 无残留物质黏附 团聚颗粒较少 1 颗粒均匀分布 见图 3 2 吲哚美辛微球载药量和包封率测定 本实验选用了载体材料 PLGA 和 Eudragit RS 100 20 以理论载药量为 通过改变载体材料的比 2 例观察对微球载药量和包封率的影响 见图 随 Eudragit RS 100 着材料 比例的递增 微球的包封率 ?1393 ? 20 12 9 47 17 Chin Pharm J 20 12 Sep tember Vol 47 No 17 中国药学杂志 年 月第 卷第 期 20 A RGR 104 0 量为 的微球 在相同比例材料下 载药微球表 值相比 细胞毒性级别为 级 且两 面电荷相对于空白微球表面电荷是下降的 者之间差异没有统计学意义 t 0 609 P 0 605 3 6 吲哚美辛微球的粒径分布 10 m 4 眼用微球粒径不能大于 μ 否则会产生不 讨 论 适感〔14〕PLGA 和Eudragit RS 100 质量比为1? 3 所 〔15-17〕 Eudragit RS RL 早期研 究 表明 单独使用 1 676 4 ? 739 5 nm 100 得载药微球 其平均粒径为 做为载体材料 虽然包封率高 但存在突释且体 4 24 h 图 外释放时间 只能维持 左右 达不到长期释放的 3 7 PLGA Eudragit RS 100 空白微球的眼用安 PLGA 要求 单独使 用 做为载体材料 虽然体外释 全性 Eudragit 放时间长 但 存在明显突释 包封率不及 空白PLGA Eudragit RS 微球在培养液中模拟 RS RL 100 包 封率 由于眼部注射用微球要求具有 2 4 3 d 中体外释放提到的体外释放条件释放 最 良好的生物 安全性 并能缓慢释放药物 粒径不宜 后通过离心得到的浸提液做为考察载体材料的安全 过大 以防止 注射时阻塞针孔 同时 应尽量提高 RPE 性 处于对数生长期的人 细胞在浸提液中孵 载药量 以减 少微球注射总重量 因此 本实验采 24 h 490 nm 育 后 在 波长下检测得到 与阴性对照 用PLGA 和Eudragit RS 1003 作为载体材料PLGA 具有良好的 生物相容性 机械性能和生物降解性 经 体液水解后 可被人体吸收 在药物控释系统中广泛 应用〔18〕Eudragit RS 100 已被用于眼科载体材 〔15〕 pH 料 它在生理 值下不会溶解 通过自身膨胀 作用释放药物 且对眼内组织没有毒性作用 本实 验改变载体材料的不同比例优选得出PLGA 与Eud- ragit RS 100 1? 3 质量比为 最后通过溶剂挥发法制 PLGA Eudragit RS 100 备吲哚美辛 缓释微球 本实 图3 PLGA 和Eudragit RS 100 不同质量比例对吲哚美辛微 验制备的吲哚美辛缓释微球能够克服早期研究存在 n 3 x ? s 球体外释放的影响 珋 的问题 具有包封率高 体外释放时间长 微球表面 Fig 3 Effect of different polymers mass ratios on cumulative 光滑 粒径小 有机溶剂残留量少等特点 release of indomethacin microspheres n 3 x ? s 珋 Eudragit RS 100 本实验发现 随着 在载体材料 1 Zeta 中比例增加 载药微球的包封率增加 最高可达 表 不同比例载体材料的空白微球和载药微球的 电 位比较 98 25 PLGA 空白微球表面带负电荷〔19〕随着 Eudragit RS 100 Zeta Tab 1 Zeta potential comparison between blank microspheres 比例的增加 微球表面的 电位 and drug-loaded microspheres at different polymers mass ratios 由负电位变 成正电位 同时 随着载药量的提高 微 〔15〕 PLGA-Eudragit RS 100 w-w Empty group mV loaded group mV Pignatello 球表面的正电位逐渐降低 这与 等 的 3? 1 8 56 ? 1 12 , 7 66 ? 2 02 研究一致Eudragit RS 100 带有含有季铵阳离子基 1? 1 23 79 ? 1 20 9 77 ? 0 70 1? 3 29 90 ? 0 79 9 35 ? 0 81 团与吲哚美辛的羧基形成静电结合 在一定程度上 阻止了制备过程中药物的丢失 提高了包封率和影 响了微球表 面的电荷 吲哚美 辛PLGA Eudragit RS 100 微球的包封率 98 25 1 可达到 缓慢释放效果可以维持 个月 虽然PLGA Eudragit RS 100 微球在0 5 h 没有突释 24 h 40 现象 但是在 左右体外释放累积率达到 左 右 在固化过 程中 由于有机相的挥发 仍然存在少 部分药物从 有机相进入水相 黏附在黏度较大的有 4 PLGA Eudragit RS 100 图 吲哚美辛 微球的粒径分布图 Fig 4 Particle size distributions of indomethacin PLGA Eud- 机相表面 进一步固化于颗粒表面 虽经过离心洗 ragit RS 100 microspheres 涤 仍有部分 黏附紧密的药物存在于表面 但是 在 临床上根据病情情况 吲哚美辛首次给药需要负荷 ?1394 ? Chin Pharm J 20 12 Sep tember Vol 47 No 17 20 12 9 47 17 中国药学杂志 年 月第 卷第 期 2 90-92 ( 量 载药微球的突释现象在一定程度上可以满足负 〔6 〕 EUGEN BARBU LILIANA VERESTIUC THOMAS G et al( 荷剂量的要求 后续的体外释放浓度能维持一定的 Polymeric materials for ophthalmic drug delivery trends and per- spectives 〔J〕( J Mater Chem 2006 16 34 3439-3443 ( 有效药物浓度即可 可避免血药浓度波动带来的全 〔7 〕 WEN J CHEN Z J LI W S( Pharmacokinety of intravitreous ad- 身不良反应 ministration of indomethin 〔J〕( Chin Op hthal Res 眼科 研究 本实验通过溶剂挥发法制备的吲哚美辛微球的 2006 24 2 129-131( 0 026 7 20 10 〔8 〕 JENQUIN M R MCGINITY J W( Characterization of acrylic res- 平均有机溶剂残留量为 符合 年版 〔20〕 in matrix films and mechanisms of drug-polymer interactions 〔J〕( 《 》 中国药典 的二氯甲烷的残留量限定 Int J Pharm 1994 10 1 1-2 23-24 ( 0 06 1 6 m 〔9 〕 CHEN Y WANG B H WU D( Pharmaceutical application of 微球平均粒径在 μ 左右 早期 〔21〕 polyacrylic resin 〔J〕( China Pharm 中国药业 2007 16 Tabata 1 0 , 2 0 m 等 研究 微球粒径在 μ 之间可 14 25-27 ( 〔10〕 OTH M P MOES A J( Sustained release solid dispersions of in- 以被巨噬细胞达到最大程度的吞噬效果 从而更有 domethacin with Eudragit RS and RL 〔J〕(