[word doc]预实验中大鼠原位肝移植常见失败原因及对策

[word doc]预实验中大鼠原位肝移植常见失败原因及对策 预实验中大鼠原位肝移植常见失败原因及 对策 中国普外基础与临床杂志2010年10月第17卷第1O期ChinJBasesClinGeneralSurg,Vo1.17,No.10,Oct.2O10 【文章编号】1007—9424(2010)l0—1035—04移植 预实验中大鼠原位肝移植常见失败原因及对策 丘昶儒,王炜,程卫,沈浩元 【摘要】目的分析预实验中大鼠原位肝移植常见的失败原因,并提出相应对策.方法回顾性分析2008 年3月至2009年3月期间预实验中采用改良Kamada”二袖套”法行大鼠原位肝移植手术12o例的资料.结果 12O例大鼠原位肝移植预实验中失败原因有:无肝期延长66例,肝上下腔静脉吻合失败61例,肝下下腔静脉吻合 失败17例,门静脉吻合失败12例,麻醉不满意8例.成功2l例(17.5O%).结论加强显微外科技术的操作训 练,特别是肝上下腔静脉的吻合,可提高大鼠原位肝移植手术成功率. 【关键词】大鼠;原位肝移植;失败原因;预防;对策 【中图分类号1R657.3【文献标识码】A CommonReasonsforFailureinOrthotopicLiverTransplantationinRatsDur ingPreliminaryExperimentandPreven. tiveQIUChang—Fit,WANGWei,CHENGWei,SHENHaG—yuan.*Depa rtmentofHepatobiliarySurgery, TheFirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510120,China CorrespondingAuthor:WANGWei,Email:wwsir8@sohu.COITl [Abstract]ObjectiveToanalysisthecommonreasonsforfailureinorthotopiclivertransp1antationduring preliminaryexperimentandproposethepreventive.MethodsOnehundredandtwentycasesinpreliminaryexperi— mentusingmodifiedKamada”two—cuff’’methodoforthotopielivertranspl antationwereretrospective1yanalyzed. ResultsThecausesoffailureincluded:lengtheningofanhepaticphase(66cases),failedanastomosisofsuprahe— paticinferiorvenacava(61cases),failedanastomosisofinfrahepaticinferiorvenacava(17cases),failedanastomo— sisofportalvein(12cases),unsatisfiedanesthesia(8cases).Succeedin21cases(17.5O%,21/120).Conclusion Improvethemicrosurgicaloperationtechniques,particularlytheanastomosisofsuprahepaticinferiorvenacava,can increasethesuccessrateinorthotopiclivertransp1antation. [Keywords]Rat;lavertransplantation;Failurereason;Prevention;Strategy 大鼠原位肝移植首先由Lee等于1973年报 道,后由Miyata等l2和Kamada等改进,现已成 为成熟的动物移植模型,此对研究原位肝移植移植 免疫耐受,供肝的保存,免疫排斥,缺血再灌注损伤 等基础研究具有重要的意义.据不完全统计l3],要 培养出1名操作细致,熟练且手术成功率高的术者, 需要160,25O只大鼠,长达6,12个月,而且手术 需要术者和助手的默契配合.预实验部分,决定了 后期实验的进展和质量.但目前有关预实验部分报 道甚少,大部分报道都是关于后期实验研究.本研 究回顾了2008年3月至2009年3月期间关于大鼠 原位肝移植的手术资料,对其制作失败的原因进行 分析,手术经验并提出相应的干预措施. 【作者单位】*广州医学院第一附属医院肝胆外科(广州510120) 【通讯作者】王炜,Email:wwsir8@sohu.CO1TI 【作者简介】丘昶儒(1983年一),男,广东省梅州市人,医学硕士在 读,住院医师,主要研究方向为肝胆疾病,Email:hot2113@l63. eolTl. 1材料和方法 1.1主要材料 动物:健康雄性SD(SpragueDawley)大鼠240 只,购自广东省医学实验动物中心,许可证号: scxK(粤)2003—0002粤监证字2008A020,体质量 230,270g.器材:动物手术台;显微外科手术器 械一套,购自上海医疗器械有限公司;微量注射泵, 上海德韧车用部件有限公司.自制袖套及内支撑 管:门静脉袖套采用外径2.0Iilrn,内径1.5mm的 聚乙烯管;肝下下腔静脉袖套为外径3.0Fnm,内径 2.5mm的聚乙烯管;胆总管内支撑管为麻醉用硬 膜外导管所制. 1.2方法 1.2.1动物模型制作采用改良”二袖套法” 建立大鼠原位肝移植模型120例.供体,受体均为 SD雄性大鼠,受体质量略大于供体.于清洁级动物 实验室手术,供体术前不禁食,水;受体术前禁食 中国普外基础与临床杂志2010年10月第17卷第1O期 ChinJBasesClinGeneralSurg,Vo1.17,No.i0,Oct.2010 12’术后禁食h’不禁水.两人裸眼操2结果 作,清洁手术.… 1.2.2供体手术?乙醚麻醉成功后,取腹部十字 切口,经腰静脉注入含50U肝素的生理盐水2ml, 使供体血液充分肝素化.分离切断右肾上腺静脉 丛,右肾动静脉和左膈下静脉.用含肝素25u/ml 的4?林格液缓慢低压泵人灌注肝脏(速度为 100ml/h),距肝门分叉约0.5cm处游离肝外胆管, 在胆总管前壁剪一斜口,用准备好的胆管内支架导 管自切口插入胆管近端,剪断远端胆管.灌注至肝 脏变土黄色时结扎并切断肝动脉.用6-0丝线紧靠 门静脉结扎脾静脉并切断之.结扎切断肝左叶与膈 下食管段的静脉交通支.取出肝脏置于0,4?的 冰水浴中.?修肝及安装袖套管:整个修肝过程全 部在4?的平衡液中进行.修剪肝上下腔静脉,用 已准备好的门静脉袖套进行套管.用同样方法制作 肝下下腔静脉袖套.在肝上下腔静脉孔两角用8-0 带针缝线各缝一针支持线. 1.2.3受体手术?取腹正中切口人腹,远离肝脏 结扎左膈下静脉;结扎切断右肾上腺静脉,游离出 肝的三支胆管,选择开口于胆总管的两个距离相近 的胆管用6-0丝线分别结扎,并于近肝侧剪断;游 离并切断肝固有动脉;两把显微血管夹(Bulldog) 分别阻断门静脉和肝下下腔静脉;经门静脉分叉处 注入生理盐水2ml(含50U肝素),将肝脏血驱回 体循环;Satinsky钳连带部分膈肌钳夹阻断肝上下 腔静脉;近肝脏端分别离断肝上下腔静脉,门静脉 和肝下下腔静脉,移去受体原肝.?供肝植入:供 肝原位植入受体腹腔内.?吻合肝上下腔静脉:以 左角的针线先从左到右连续缝合后壁,在管腔外与 右角线尾打结;然后再用此针线从右到左连续缝合 前壁,结束缝合前用生理盐水冲洗管腔以排出气泡. ?吻合门静脉:夹起门静脉套管管耳,将供肝门静 脉套管插入受体门静脉腔内结扎固定,立即移去血 管夹开放门静脉,移去Satinsky钳开放肝上下腔静 脉,结束无肝期.同法吻合肝下下腔静脉.?重建 胆道:用显微镊提起受体左右两个胆管预留线,在 胆管会合处纵行剪开胆总管,显露管腔,将供肝胆总 管内支撑管插入受体胆总管管腔内并结扎固定.单 层关腹.?术后处理:大鼠术毕即醒,灯照保温至 活动自如,单笼饲养.术后第1天口服葡萄糖盐水, 以后自由进食水.?大鼠原位肝移植动物模型成功 :术后可以自动翻身,可以饮水,呼吸节律匀 称,且生存时间超过48h. 2.1二袖套法大鼠原位肝移植动物模型手术时间 供体手术时间为(42.72?3.55)min,修肝时间 为(25.18?3.97)min,肝上下腔静脉吻合时间为 (17.45?2.73)min,门静脉吻合时间为(2.9O土 0.94)min,肝下下腔静脉吻合时间为(5.54?1.50)min, 无肝期时间为(20.45?3.07)min,受体手术时间为 (55.45?7.46)rain. 2.2二袖套法大鼠原位肝移植动物模型手术失败 的常见原因 120例中,无肝期延长66例(55.00%);受体鼠 平均存活时间不超过24h.肝上下腔静脉吻合失 败61例(50.83%),其中出血有41例,空气栓塞 8例,狭窄12例;受体鼠平均存活时间不超过24h. 肝下下腔静脉吻合失败17例(14.17%),其中血管 扭曲12例,漏血5例;受体鼠平均存活时间不超过 8h.门静脉吻合失败12例(10.o0%),其中血管扭 曲8例,漏血4例;受体鼠平均存活时间不超过 4h.麻醉不满意8例(6.67%),术中当即死亡. 2.3在不同阶段中成功例数 为了学习大鼠原位肝移植模型,本研究把12个 月平均分成四个阶段,第一阶段成功2例,第二阶段 成功3例,第三阶段成功5例,第四阶段成功l1例. 共为2l例,成功率为17.5O%,存活时间最少为2d, 最长为29d,平均存活8.3d. 3讨论 众多文献资料剖中,二袖套法大鼠原位肝移植 动物模型常见的失败原因有无肝期延长,血管扭曲, 空气栓塞,漏血,胆管吻合失败,呼吸衰竭等.而在 本研究中,为节约经费和减轻排斥反应,采用的是 SD大鼠同种异体原位肝移植,常见的失败原因从多 到少依次为:无肝期延长,肝上下腔静脉吻合失败, 肝下下腔静脉吻合失败,门静脉吻合失败,麻醉不满 意.下面就实验中常见的失败原因分析如下. 3.1肝上下腔静脉吻合失败 本研究中,肝上下腔静脉吻合失败占5O.83%, 略少于无肝期延长(55.00%).但是无肝期85%左 右时间(无肝期一肝上下腔静脉吻合时间+门静脉 吻合时间)在用于肝上下腔静脉吻合,所以肝上下腔 静脉的吻合是手术成功的最主要瓶颈,一旦突破了 这一技术难点,手术的成功率将大大提高.通过术 后尸体解剖观察,61例肝上下腔静脉吻合失败中, 中国普外基础与临床杂志2010年10月第17卷第1O期 ChinJBasesClinGeneralSurg,Vo1.17,No.10,Oct.2010 出血有4l例,空气栓塞8例,狭窄12例,平均存活 时间未超过24h.我们归纳了其失败原因:手术视 野小,肝上下腔静脉后壁太短,缝合时针距过大,供 肝腔静脉保留膈肌环过多,前,后壁缝合完毕打结时 收线太紧,局部前,后壁缝合到一起等.肝上下腔静 脉吻合一直以来都是大鼠肝移植手术的难点.套管 法成功率高,且所需时间又短,手术难度较小,但是 存活率却很低].本实验中是采用传统的静脉两角 缝合牵引线的方法.对于肝上下腔静脉缝合,有 人【”提倡左角单线连续缝合,认为有免去了右角悬 吊的步骤,视野清晰等优点.但我们认为,两角缝合 法有利于固定肝脏,更不易造成肝上下腔静脉撕裂 及扭曲.不保留膈肌环有利于肝上下腔静脉的缝 合,这与Jiang等报道一致.另外,我们发现,连 续外翻缝合此处针距应较小,控制在0.5mm;在肝 上下腔静脉缝合关口前用肝素生理盐水冲洗管腔排 出气泡,同时观察有无漏水情况,及时发现再补缝 上;修肝时去除膈肌环或者尽量减少膈肌环;前后 壁缝合完毕打结时收线不能太紧,以使前,后壁间的 间隙闭合为宜. 3.2肝下下腔静脉吻合失败 肝下下腔静脉吻合失败发生率为14.17%,与 门静脉吻合失败发生率接近.通过术后尸检发现, 17例中血管扭曲12例,漏血5例,平均存活时间未 超过8h.分析其失败原因:供体肝下下腔静脉周 围残留组织过多,血管分支结扎离断残端过长l修 肝时夹套管柄时未放好,受体手术时人为造成血管 扭曲;血管间张力过大,血管壁没有绑紧,与Mate— vossiana等l1报道相同.我们的对策是:在修肝 时,肝上下腔静脉血管分支(尤其是腰背静脉)结扎 尽量靠近主干,血管游离必须充分,对周围脂肪组织 应彻底清除,套管选择不能太小或太大,适当地修剪 好肝下下腔静脉的长度.套血管时,套管柄保持正 前位置.大鼠的腰背垫高约1cm左右,这样血管吻 合时就不会产生过大的张力. 3.3门静脉吻合失败 通过术后尸检发现,12例门静脉吻合失败中, 血管扭曲8例,漏血4例,平均存活时间未超过 4h.分析其原因,与肝下下腔静脉吻合相似.我们 的对策是:修肝时,供体门静脉充分游离,周围脂肪 组织彻底清除.门静脉血管分支(脾静脉)结扎残端 不应留置过长,尽量靠近门静脉.套血管时,套管柄 保持正前位置.大鼠的腰背垫高约1C1TI左右,这样 血管吻合时就不会产生过大的张力.另外,有研 究[1表明,当开放门静脉和肝上下腔静脉时,高钾 血和内脏瘀血可能对供肝和肺造成损伤,引起大鼠 呼吸,心跳骤停.本研究中受体在阻断门静脉之前 可经门静脉左,右分支穿刺注入0.5%NaHCO. 1.5,2.0ml,可以起补液作用,而且有减轻高钾,酸 性代谢产物的毒性作用. 3.4无肝期延长 无肝期的问题主要表现在时间过长.Kamada 等[胡认为,受体无肝期不超过26min是术后存活质 量的保障.本实验中无肝期时间为(20.45?3.07) min,有5例无肝期达30rain,仍移植成活,但笔者 亦认为受体无肝期长短是决定动物存活的关键,无 肝期最好控制在25min左右,越短越好.要做到这 点,只能加强肝上下腔静脉和门静脉吻合训练,熟练 手术操作. 3.5麻醉不满意 良好的麻醉是手术成功的保障.与氯胺酮,水 合氯醛,戊巴比妥等相比,乙醚具有对肝功能及生理 影响较小,无肝期开始后死亡率低,麻醉方便,术后 易于苏醒的优点】.本研究中供,受体均采用开放 式乙醚麻醉.不过,我们发现乙醚刺激呼吸道产生 大量分泌物,一方面阻塞呼吸道,影响通气;另一方 面造成误吸,术后易发生肺部感染.因此,术前必须 肌注阿托品以抑制呼吸道腺体分泌.其中,5例麻 醉过深,大鼠手术中即死亡l3例麻醉过浅,在缝合 肝上下腔静脉时,造成血管直接撕裂而失败.通过 不断的摸索,我们得出受体鼠乙醚麻醉时间控制在 10,30S,在无肝期内不麻醉. 3.6其他原因 除了上述常见的原因外,其他方面包括:?室 内的温度过高或过低也会导致术后移植大鼠死亡, 宜控制在20,25?之间.夏季高温时,术后要开空 调降温;冬季低温时,术后可开日照灯近照大鼠,直 至活动正常.?供肝质量差也可以直接导致移植术 后肝功能衰竭或无功能.在供体取肝时,在不影响 手术的情况下,应少翻动肝脏,同时可用滴冰盐水或 放薄冰至肝上,保持低温取肝.另外,灌肝时水流的 速度应保持均匀,控制在70,100ml/h.?术者和 助手配合不默契也是一个关键因素.特别是肝上下 腔静脉的缝合,助手要帮助术后暴露好血管的前,后 壁,防止前,后壁缝在一起.门静脉和肝下下腔静脉 套管时,术者和助手都要谨慎,防止套管不牢出现血 管有漏血的现象等.这些都需要术者和助手要具有 团队精神,加强合作. 中国普外基础与临床杂志2010年10月第17卷第1O期 ChinJBasesClinGeneralSurg,Vo1.17,No.10,Oct.2010 4参考文献 [1]LeeS,ChartersAC,ChandlerJG,eta1.Atechniqueforor thotopiclivertransplantationintherat[J].Transp1antati.n, 1973;16(6):664—669. [2]MiyataM,FischerJH,FuhsM,eta1.Asimplemethodfor orthotopiclivertransplantati.nintherat.Cufftechniquefor threevascularanastomoses[J].Transp1antati.n,1980;30 (5):335-338. [3]KamadaN,CalneRY.Asurgicalexperiencewithfivehun dredthirtylivertransplantsintherat[J].Surgery,1983;93 (1Pt1):64—69. [4]孙君泓,吴孟超,曾琪华.300次大鼠原位肝移植[J].中华 器官移植杂志,1990;11(1):19-21. [5]董雨亭,张文海.大鼠原位肝移植术并发症的预防[J].中 华器官移植杂志,1995;l6(1):1214. [6]黄新立,张峰,王学浩,等.建立大鼠部分肝移植动脉化模 型的实验研究[J].中国普外基础与临床杂志,2004;11 (3):224—227. [7]刘立新,彭方兴,张英男,等.改良法大鼠原位肝移植死亡 因素分析及对策[J].中国普外基础与临床杂志,2005;12 (2):120—122. [8]彭方兴,郑本波,刘立新,等.大鼠原位肝移植动物模型制作 消息 要点_J].中国普外基础与f临床杂志,2005;12(2):117—120. KashfiA,MehrabiA,PahlavanPS,eta1.Areviewofvari— OUStechniquesoforthotopiclivertransplantatiOnintherat rJ].TransplantProe,2005;37(1):185—188. 朱金海,陈燕凌,唐南洪,等.大鼠改良式原位肝移植手术 技巧探讨[J].中国修复重建外科杂志,2008;22(11): 13841388. JiangY,QiuYD,GuXP,elnZ.Ratlivertranspiantati0n withoutpreservationof”phrenicring”usingdoublecuff method[J].WorldJGastroenterol,2004;10(10):1526- 1527. MatevossianaE,DollaD,HOseraN,eta1.Iivertransplan— tationintherat:Singlecenterexperiencewthtechnique, long—termsurvival,andfunctionalandhistologiefindings [J].TransplantProc.2009;41(6):2631,2636. HabscherSG.Transplantationpathology[J].SeminLiver Dis,2009;29(1):749O. 彭勇,龚建平,刘长安,等.大鼠原位肝移植模型制作过程 中麻醉方法的选择[J].中国普通外科杂志,2003;12(9): 673-676. (2010—03—03收稿,2010—07—15修回) (本文编辑蒲素清) ….-.-._._.-.-.-.一.-.…—-r一.-.…?一.-.…?…?…._.-._??-’? 《中国普外基础与临床杂志》关于加入中国临床试验注册 与发表协作网,推动临床试验透明化的申明 临床试验透明化是本世纪初推动全球临床医学发展的重大事件之 一,是提高医学试验公信度的重要举措,是伦理的需 要,是提高临床试验质量的有效措施. 临床试验透明化包括临床试验注册和报告化.临床试验注册指所有涉及人体的试验需在世界卫生组织一级注册机 构登记注册,将研究者,研究实施单位,研究目的,十预措施等试验信息公之于众,这是对受试者的尊重,对公众的负责.临床 试验报告规范化是指将试验过程的所有必要细节清楚准确地报告并发表,让公众了解试验的方法和过程,以了解证据的可靠 性和适用性. 国际医学期刊编辑委员会为代表的国际医学期刊对临床试验透明化做出了重大贡献,于2004年1O月宣布从2005年 7月1日起只发表经注册的临床试验,并率先推广实施随机对照试验报告报告标准(CONSORT)系列为代表的临床试验报告 规范.中国48家医学期刊与中国循证医学中心,中国临床试验注册中心于2006年4月共同发起成立中国临床试验注册与发 表协作网,宣布从2007年1月1日起优先发表经注册的临床试验,逐渐过渡到只发表注册临床试验在各成员期刊推广 CONSORT系列标准;积极推动我国的临床试验透明化. 本刊以昌达科学为宗旨,提高我国l临床试验水平为己任,我们高度赞赏和积极支持中国l临床试验注册与发表协作网对建 立我国l临床试验注册和临床试验透明化所做出的贡献,宣布从即日起加入中国临床试验注册与发表协作网,与全国各兄 弟期刊一起共同推动我国医学事业的发展.临床试验透明化是全球医学发展的大势所趋,我们殷切期望本刊的作者和读者 了解其对临床医学发展的意义和趋势,尽早注册您们的临床试验,希望本刊稿件中注册临床试验报告越来越多. 中国临床试验注册中心的网址:www.chictr.org;电话:028,85422081. 《中国普外基础与临床杂志》编辑部 _.叼妇 口l二口口