睾丸肿瘤染色体杂合性丢失及微卫星不稳定性研究-医药英语
睾丸肿瘤染色体杂合性丢失及微卫星不
稳定性研究-医药英语
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关键词:睾丸肿瘤;染色体
摘要目的探讨睾丸肿瘤的发生、发展与微卫星不稳定性及染色体杂合性丢失的关
系。
利用PCR-MIA技术,选用8种微卫星标记位点,分析22例睾丸肿瘤
LOH及MSI的变化。结果22例中14例出现LOH。定位于第9号染色体上的
D9S63位点的LOH发生率最高为45%,次为第5号染色体上的APC位点及第18号染色体上的DCC位点;8例
现为MSI,17例表现为LOH或MSI,总阳性率
为77%。结论染色体9q及5q上存在的抑癌基因的失活以及微卫星不稳定性改变
可能在睾丸肿瘤的发生发展中起重要作用。
Lossofheterozygosityandmicrosatellitealterationintesticulartumors
WANGChunxi,WANGHongliang,ZhaoZhongwen,
etal.DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospital,
NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021
AbstractObjectiveTostudythelossofheterozygosityandthemicros
atelliteinstabilityinvolvedinthedevelopmentofhumantesticulartumor.Methods22primarytesticulartumorDNAsampleswereexamine
dforlossofheterozygosityonchromosomes3,5,9,17,
18andXandalterationofmicrosatelliterepeatsmarkerbymeansofpo
lymerasechainreaction,8microsatelliterepeatsmarkersbeing
usedfortheanalysisofMSI.ResultsLOHonchromosome9q33-34,
5qand18q21wereobservedin45%,43%and25%,
respectively.Differencebetweenunrelatedmicrosatellitesfortu
morandcontrolDNAwasdetectedin8of22ConclusionsTumorsuppresso
rgenesonchromosome9qand5q,
andmicrosatelliteinstabilitymightplayanimportantroleinthede
velopmentofhumantesticulartumor.
KeywordsTesticularneoplasmsChromosome
近年随着分子生物学技术的飞速发
展,已熟悉到癌基因及癌抑制基因的异常改变在人类恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用,尤其是癌抑制基因功能丧失越来越受到人们的重视。利用微卫星标记位点进行染色体杂合性丢失分析技术,已成为癌抑制基因重要的筛选手段之一。微卫星不稳定性的异常改变提示基因组不稳定性,反映了DNA修复系基因异常。这一改变表现在多种遗传性及非遗传性肿瘤。我们分析了22例睾丸肿瘤第3、5、118及X染色体上的LOH及MSI改变。告如下。材料和方法
一、睾丸肿瘤标本
原发性睾丸肿瘤手术切除标本22例。肿瘤组织液氮处理后--70?C保存备用。按国际TNM分期,均经病理证实为原发性睾丸肿瘤,其中精原细胞瘤7例,非精原细胞瘤15例。非肿瘤部位正常对照采用同一病人外周血淋巴细胞DNA。 二、DNA提取
常规酚、氯仿法提取肿瘤组织和外周血淋巴细胞DNA,稀释为100ng/μl,4?C保存。
三、LOH及MSI分析
选择定位于不同染色体上8个座位的DNA微卫星标记,利用PCR-微卫星不稳定分析技术进行LOH及MSI分析。微卫星染色体座位、重复序列及扩增片段长度见表1。
表1微卫星染色体座位、重复序列及扩增片段长度
标记名称染色体
座位重复序列扩增片
段长度D3S12283p14.1-
14.3nAAn84D3S6433P21.323113APC5qn96D5S1075q9AA197145D9S639q
33-34n208p5317p13.1n103DCC18q2126N288215ARXn282
实验时首先用,γ-32P,ATP标记微卫星引物5末端,然后在含100ng基因组DNA的反应体系中,加入1.0μl10×PCR缓冲液,1.5,2.5mmol/LMgCl2,0.25mmol/LdNTPs,Taq酶0.25U,0.25mmol/L已标记的引物,加无菌去离子水至10.0μl,加矿物油覆盖,混合、瞬时离心,进行PCR反应。PCR产物用10.0,50.0μlDNA变性示踪剂稀释,95?5分钟热变性,取1.5,5.0μl加样于含尿素的6,,8%聚丙烯酰胺凝胶,40W,室温2,4小时电泳,真空干胶,加增感屏与X线片室温条件下曝光5分钟,48小时放射自显影。 四、LOH及MSI判定
利用同一病人外周血淋巴细胞DNA作为正常对照,同时进行PCR扩增及电泳,分析时与同一病人外周血淋巴细胞DNA电泳条带进行对比,如肿瘤组织DNA电泳条带消失一条或信号明显减弱为LOH,假如多出现一条或一条以上扩增产物带则为MSI。
五、统计学分析
采用Fisher直接法进行统计学分析,P,0.05有统计学意义。 结果
22例原发性睾丸肿瘤中在至少4个标记位点可提供信息,其中14例出现LOH。在各个染色体座位所检测的LOH出现率依次为:D9S63(9q33-3 4.1)45%,APC43%,DCC,25%,p5315%,D5S10711%。精原细胞瘤7例中4例、非精原细胞瘤15例中10例。I期睾丸肿瘤14例中9例、?期8例中5例出现LOH,LOH出现率与组织学分类及临床分期统计学差异无显著性。 8例睾丸肿瘤观察到至少1个标记位点出现MSI。各个染色体标记位点所检测的MSI分别为:D3S1228为10%,D3S64为9%,APC为9%,D5S107为10%,D9S63为5%,p53为11%,DCC为15%,AR为14%。MSI阳性8例中有2例表现为5个标记位点、3例表现为2个标记位点、3例表现为1个标记位点异常。2个及2个以上标记位点异常者定为复制错误阳性,22例中有5例表现为RER阳性,其中精原细胞瘤7例中2例,非精原细胞瘤15例中3例为RER阳性,RER阳性与组织学分类统计学差异无显著性。I期睾丸肿瘤14例中3例,?期8例中2例表现为RER阳性,RER阳性与临床分期统计学差异无显著性。22例经病理证实为睾丸肿瘤病例中,17例表现为LOH或MSI,总阳性率为77%。
讨论
有关睾丸肿瘤发生发展的分子生物学机制仍不清楚。有告表明LOH的发生率在第1号染色体短臂和第12号染色体长臂达80%,1,2,,第5号染色体及第18号染色体长臂为50%以上,3,4,,第3号染色体(
3p)和第11号为30%左右,5,。本研究分析了染色体3p、5q、9q、17p13、18q21及X区域的LOH,发现染色体9q及染色体5q的LOH高达45%和43%,推测在染色体9q上存在着p15,p16等肿瘤抑制基因及染色体5q上存在着与多种肿瘤密切相关的抑癌基因,它们的失活可能在睾丸肿瘤的发生发展中起重要作用。
人类基因组DNA中存在着大量称为微卫星的CA,GT等单纯碱基重复序列,这种单纯重复序列有丰富的多态性。Aaltonen等,6,研究表明,遗传性非息肉样结直肠癌组织中存在着大量的单纯碱基重复序列数目的改变,这种现象引起人们广泛关注。这种肿瘤组织中单纯重复序列长度的改变定义为MSI。利用PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,可以简单、快速、准确地检测MSI。MSI不只出现于HNPCC患者,非遗传性结肠癌及其他散发性肿瘤也经常出现MSI。本组22例睾丸肿瘤中有8例表现为MSI,阳性率为36%,17例表现为MSI或LOH。结果提示,MSI可能在睾丸肿瘤发生发展中具有重要意义。尽管MSI和LOH发生原因及其在睾丸肿瘤发生发展中的意义不同,但作为分子标记,共同用于睾丸肿瘤的诊断,具有互相补充作用。
MSI出现的原因一般认为是由于DNA复制时错配修复系基因异常所致,称为复制错误。目前已克隆的错配修复基因主要有h
MSH2,hMLH1,hPMS,7-9,。RER阳性的HNPCC患者肿瘤组织约70%存在hMSH2或hMLH1基因异常,10,。胃癌、胰腺癌、子宫体癌、前列腺癌等非遗传性肿瘤也表现一定频度RER阳性。本组睾丸肿瘤22例中5例表现为RER阳性。有关RER阳性睾丸肿瘤组织错配修复基因改变的机理,有待进一步研究。 本课题受教育部留学回国人员科研启动基金资助
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