米力农对烟雾吸入性损伤大鼠肺保护作用的研究（可编辑）

米力农对烟雾吸入性损伤大鼠肺保护作用的研究（可编辑） 米力农对烟雾吸入性损伤大鼠肺保护作用的研究 天津医科大学 硕士学位论文 米力农对烟雾吸入性损伤大鼠肺保护作用研究 姓名:徐加红 申请学位级别:硕士 专业:临床医学;外科学;烧伤 指导教师:刘群 2012-05 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 吸入性损伤是热力和烟雾引起的呼吸道以及肺实质的损害，因其起病 急、 病情发展迅速，兼有热力和化学物质的损伤，以及疾病的隐蔽性和严重性，是 烧伤的主要死亡原因之一，其治疗在临床上依然是一个难点。米力农为非洋地 啶衍生物，是一种选择性磷酸二酯酶III抑制剂。在之前的黄类强心药双毗 研究 中，雾化吸入米力农可以应用到心肺分流术患者、缺血再灌注模型中起到肺保 护作用，在油酸所致实验大鼠急性肺损伤模型中，米力农也起到肺保护作用。 本实验通过研究雾化吸入米力农对烟雾吸入性损伤后大鼠炎症,抗炎介质以及氧 化,抗氧化介质的影响，探讨其对烟雾吸入性损伤的肺保护作用。 目的: 1(检测研究对象血清白细胞介素(6 IL(6 、白细胞介素(10 IL(10 、肿瘤 坏死因子(Q TNF(Q 含量水平，研究米力农雾化吸入对吸入性损伤早期炎症 介质的影响; 2(检测研究对象肺组织匀浆中丙二醛 MDA 含量、髓过氧化物酶 MPO 和超氧化物歧化酶 SOD 活性水平，研究雾化吸入米力农对吸入性损伤早期 氧化,抗氧化因子的影响; 3(通过研究米力农对吸入性损伤早期调节炎症,抗炎症以及氧化,抗氧化的平 衡的影响，探讨米力农对烟雾吸入性损伤早期是否有保护作用，及其相关机制。 : 对照组 II组 、低剂量米力农组 III组 、高剂量米力农组 IV组 、致伤 对照组 V组 ，每组8只。I组不予处理，II、III、?、V组建立吸入性损 农、1 结束后30min后，检测五个组的大鼠血清白细胞介素(6 IL(6 、白细胞介素(10 含量、髓过氧化物酶 MPO 和超氧化物歧化酶 SOD 活性，取左肺组织做 病理HE染色切片光镜观察。 结果: 天津医科大学硕士学位论文 1(一般情况观察:致伤后大鼠均出现呼吸急促，肺部听诊可及哮鸣音、湿 哕音、心率加快，取出放入室内空旷区休息5分钟后上述表现逐渐消失。 2月市组织病理切片观察:光镜下米力农组 III组、?组 较对照组肺组织炎 细胞浸润减少，肺水肿减轻。 IL(1 照组降低， 0增高，高剂量组更为明显 P O(05 。 对照组降低，SOD增高，高剂量组更为明显 P O(05 结论:米力农对烟雾吸入性肺损伤可能有一定的保护作用，其原因可能与调 节 炎症,抗炎症以及氧化,抗氧化的平衡有关。 关键词:烟雾吸入性损伤米力农炎症氧化大鼠 AbStract and theheat whichcaused bY and damage is lung Inhalationinjuryrespiratory heatandchemlcals， and ofboth damage ofits progression，the smoke(Becauserapid death callseof the stillis leading injury and ofhiddenseverity，Inhalation its prop哪y 1sa milrinom issue??The difficult isstilla treatment clinical the in b啪patients，and the of deftVatiVe nota IIIinhibitor(It'sdual。pyridine selective phosphodiesterase to c8nbe milrinone applled aerosol a study，inhaled class(In previous digitalis rolem a model，andplay with bypass，ischemia―reperfusion Datientscardiopulmonary mduced oleicacld in in role lung a Italso playprotection tection( 1ungpro the is l吼gp? tectlVe studying acute experiment lunginjury(This eXp耐mental the detectmg inhaledaerosolmilrinone，by ofthe inhalation effectsinsmoke injury mediators?? andoxidative,antioxidant mediators infl锄matory,antiinflammatory Objectives: 0 ，tLlmor 0 IL-1 of levelsinterleukin-6 IL一6 ，interleukin‘1 concentration 1(Detect aerosol oftheinhaled theeffects research serum，to necrosis factor-Q TYF(? in inhalation smoke injury; mediatorsin early on milrinoneinflammatory and of malondialdehyde MDA ， 2(’Detectionactivity the theeffectsof research homogenates，to lung suDeroxidedis珈【utase SOD in smoke in factor earlY oxidation,anti―oxidation on milrinone inhaledaeros01 inhalation injury; ( on effectearly hasa milrinone aerosol protective inhaled whether 3(Investigate effect( of itsmechanism protective inhalation smoke injury，and Methods: wltn five to groups wererandomizedexperimental rats Fortvmale Sprague(Dawley sallne1nhalatlon， normal receiving group 8ratseach group，control group:normal milrinone 0(4mg,ml milmonereceiving low-dose group control group??30 milrinoneinhalation，injured l mg,ml receiving milrinone星，oup of0(9, NaClcontaining solution smoke after inhaled，aerosolized minlater 50mm 10minin for administered was ofmilrinonerespectively dif(ferentdose necrosis oftumor levels 4h(The intervalover III and semm interleukin(IO IL(10 in IL-6 and tis811ew盯e l珊g dismutase SOD in Superoxide myel。peroxidase MPO and undermicroscope?? examined 1were tissues detected(Thelung Results: and wheezing， rales， auscultation chest of breath， observation:Shortness 1(General torest areas outdoor ratsto the injured affer injury(Rem。Ve appears tachycardia 缸 (叻 协 矾 皿l砉 mee 唱野 狮r。代 四k 缸枞 衙 I一 I 叭U 岫 e 0 m内妙鼬 g 湖 E 研 v 咖曲 (嵯 (一 帕 Mr厅1掰 ?呲【 n萨旧乱(? 旧?e 叩m 赋mm 托h 北屺 耋' 善l叭肌 e渤扯?m 瓶砷吡h t肿羔 呜 一同1 ， ,衅咖 州 ? 掣啪 鲫 姗啪 盂一 wimcontrolgroup， lL-O、 andIL一10:Compared ofTNF(伐、IL(6 results 3(The IL-1O waS inhalation group，while milrinone decreased【in TNF(0【were milrinonegroup P O??05 ?? in high(dose increased，eSpecially withc。ntr01目的 up，MDA、 andSOD:c。mpared MDA、MPO results。f 4(The was SOD inhalation group，while inmilrinone decreased were MPo milrinone group P O??05 ?? in b(igh(dose increased，especially the lun咖 nctlon could milrinone protect of。aerosolized Conclusions:Inhalation and inn舢ation to berelatedresisting may inhalation i11duty，which smoke against nxidatjon( milrin。ne i1111:tlation ds:smoke injury Keywor 天津医科大学硕士学位论文 缩略语,符号说明 英文缩写 英文全文 中文 IL(6 interleukin(6 白细胞介素一6 IL(10 interleukin(10 白细胞介素-10 TNF(C【 tumornecrosisfactor(0【 肿瘤坏死因 子(cc MDA 丙二醛 malondialdehyde MPO 髓过氧化物酶 myeloperoxidase SoD dismutase 超氧化物歧化 酶 superoxide cAMP adenosine 环磷酸腺苷 cyclic monophosphate cGMP 环单磷酸鸟苷 cyclicguanosinemonophosphate ELISA jmmunosorbnent enzyme-linked 酶联免疫吸附 法 assay OD difference opticaldensity 吸光度差 AC 腺苷酸环化酶 adenylatecyclase GC guanylatecyclase 鸟苷酸环化酶 Co carbon monoxide 一氧化碳 No nitricoxide 一氧化氮 原生性一氧化 氮合酶 cNOSconstitutivenitricoxide synthase iNOS induciblenitricoxide 诱生型一氧化氮合成酶 synthase eNOS 内皮细胞氮氧化物合酶 endothelialnitricoxide synthase nNOSneuronalnitricoxide 神经元氮氧化物合酶 synthase ALI acute 急性肺损伤 lunginjury ATP adenosine 三磷酸腺苷 triphosphate CARS 代偿性抗炎症反应综合征 compensatoryanti―inflammatoryresponse syndrome 急性呼吸窘迫综合征 ARDSacute distress respiratorysyndrome TGF factor 转化生长因子 transforminggrowth NF(KB Nuclear B 核因一K factor??--kappaB PDE phosphodiestefase 磷酸二酯酶 P?【N polymorphonuclear 多形核白细胞 leucocyte CaM calmodulin 钙调节蛋白 VII 蛋白激酶 kinase PK protein 细胞外信 号调节激酶 kinase extracellular ERK signal―regulated 食品和药 物管理局 administration foodand FDA drugs 活性氧 reactive ROS oxygenspecies VIII 天津医科大学硕士学位论文 (iL―JL 月IJ吾 研究现状、成果 作为烧伤患者主要死因之一的吸入性损伤 尽管临床治疗措施的不断增多， 的病死率依然高居不下【?。在许多的烧伤病例中，很多患者的总烧伤面积并不大， 但却合并着不同程度的吸入性损伤，尽管目前有一些有效的治疗措施，例如液 体复苏、早期切除烧伤坏死组织和机械通气技术的改善，往往由于吸入性损伤 病因交杂，起病急、病情发展迅速，兼有热力和化学物质的损伤，以及全身损 害的严重性，合并呼吸道损伤的患者死亡率仍然很高【2】，此外还增加了感染、机 械通气时间以及住院天数【3】。怎样提高其治愈率一直是临床和实验研究的重点和 热点。 在诸多原因引起的吸人性损伤中，以烟雾吸人性损伤最为常见。其发生不 更重要的是因局部化学性刺激所致的呼吸道和肺的损仅是由于热力的作用， 害 及有害物质的吸收中毒 如一氧化碳中毒 。热能具有强烈的物理作用，可直接损 伤呼吸道黏膜和肺实质，表现为黏膜充血、水肿、炎细胞浸润，上皮细胞肿胀、 变性和坏死等。化学因素中以烟雾最为重要。烟雾为物质热力分解所释放而由 其成分很复杂，包括气体、挥发性有机分子、自由基、气空气传播的产物， 溶 胶以及颗粒性物质。烟雾中气体包括CO、NO、N20、N02、S02等;挥发性物质 有氰化氢;颗粒性物质主要为炭粒。颗粒一般都为具有刺激性的醛、酮及有机 酸等物质所包被。较大的颗粒大多为黏液纤毛系统的滤过作用阻挡在上呼吸道， 而一些小的颗粒则随有毒气体到达下呼吸道和肺实质，引起化学性损伤。 烟雾吸入性损伤引起的肺损伤病理变化包括肺泡毛细血管的损伤和伴随着 明显炎症反应的肺组织的高渗透性。在临床上表现为早期的严重低氧血症和肺 水肿。烟雾吸入性损伤后，中性粒细胞、巨噬细胞、肺泡毛细血管内皮细胞等 释放出多种炎性介质以及细胞因子，包括TNF(0l，IL(1等，并产生氧自由基、 蛋白酶、花生四烯酸等代谢产物，引起级联的瀑布效应，致使内皮细胞损伤， 血管通透性增高，渗出增多，导致肺水肿形成，管型形成，气道阻塞，缺 氧性 肺血管不能有效收缩，进一步加重了肺损伤【4】。氧自由基和过度的炎症反应在烟 雾吸入性损伤的病理生理变化中起到重要的作用。 天津医科大学硕士学位论文 烟雾吸入性损伤时，内皮细胞损伤，内源性的NO等舒血管物质产生减少， 而缩血管物质则表达增加，从而使肺血管收缩痉挛。内皮细胞损伤、肺血管收 缩、通气,血流比值失调、低氧血症形成一个恶性循环，这就需要对其进行阻抑 或是打断该循环，但是全:身应用血管扩张药会出现低血压等多种不良反应，雾 化吸入的方式不仅可以大大降低药物的全身不良反应，直接作用于靶器官，而 且扩张通气肺泡的毛细血管，在一定程度上改善了通气,血流比值，改善了 低氧 血症。 米力农是一种选择性磷酸二酯酶III抑制剂，为非洋地黄类强心药，双吡啶 衍生物，能够抑制细胞内cAMP水解，使cAMP聚积，继而激活蛋白激酶，使 更多钙通道开放，在心肌产生正性变力作用。在血管中可使血管平滑肌细胞钙 离子外流增加，引起血管松弛扩张【扪。早前的众多实验研究发现米力农在多种原 因所致的急性肺损伤中起到了明显的保护作用，尽管米力农的肺保护作用机制 至今仍不明确。MoritzBueltmanll[17】等人证明了单次雾化吸入米力农对油酸所致 ALI可缓解肺的干湿比和髓过氧化物酶活性的升高，并且降低支气管灌洗液中的 人在心肺分流术后猪的试验中比较了雾化吸入和静脉给予米力农对肺血管 内皮 损伤的作用，证明了心肺分流术引起的肺内皮中乙酰胆碱和缓激肽通路造成的 损伤可以通过雾化吸入米力农而不是静脉给药逆转，而且雾化吸入米力农相比 并能减少低血压，以及对心率和静脉给药有更好的血流动力学和氧合作用， 全 身血管阻力的影响。 研究目的、方法 研究目的 吸入性损伤的隐蔽性、病程进展快速，由于低氧中毒等引发多脏器反应的 严重性，使其成为当前烧伤死亡的主要原因之一。本实验的研究目的在于验证 雾化吸入米力农对减轻烟雾吸入性损伤后大鼠肺组织炎症反应及氧化损伤的积 极作用。 研究方法 生理盐水对照组 II组 、低剂量米力农组 III组 、高剂量米力农组 ?组 、 天津医科大学硕士学位论文 致伤对照组 V组 。I组不予处理，II、III、?、V组建立吸入性损伤模型， 30min后，应用酶联免疫吸附法 ELISA 检测五个组的大鼠血清白细胞介素(6 活性，取左肺组织经做病理HE染色切片光镜观察，来研究米力农雾化吸入对烟 雾吸入性损伤大鼠肺的保护作用。 1(对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 米力农对烟雾吸入性损伤大鼠肺的保护作用 1(对象和方法 1(1(主要仪器 DRB(CO报警控制器 天津市前进仪表厂 不锈钢高压锅 广东省中宝不锈钢制品实 业有限公司 超声雾化器 德国百瑞公司 G>(500型电子天平 美国sigma公司 高速低温离心机sigma2(16K德国eppdndorf公司 Electron公司 超低温冰箱Thermo CK40 光学显微镜OLYMPUS日本奥林巴斯公司 石蜡切片机LEICA公司 ThermoMultiskan Electron公司 MK3酶标仪Thermo 病理图文分析系统LEICA公司 北京医用天平厂 电子体重计 数码照相机 日本SONY公司 普通冰箱 青岛海尔公司 微量移液器 eppendorf公司 北京拓普分析有限公司 酶标洗板机DEM(III 水浴振荡器 天津实验仪器厂 电动玻璃匀浆机 DS,’89(1 宁波新芝生物科技股份有限公司 外科手术器械 上海手术器械厂 1(2(主要试剂及配置 米力农注射液 山东鲁南贝特制药有限公司 大鼠TNF(QELISA试剂盒美国RD公司 美国RD公司 大鼠IL一6ELISA试剂盒 大鼠IL(10ELISA试剂盒美国RD公司 大鼠MPO检测试剂盒 南京建成生物工程研究所 大鼠MDA检测试剂盒 南京建成生物工程研究所 南京建成生物1:程研究所 大鼠SOD检测试剂盒 1(对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 大鼠考马斯蛋白检测试剂盒南京建成生物工程研究所 盐酸氯胺酮注射液 上海中西药业有限公司 1(3(实验方法 1(3(1(实验动物及动物分组 验动物中心提供 。 1(3(2(动物分组 用随机数字表法将所有大鼠随机分为5组 每组8只 :I组为正常对照组; II组为生理盐水对照组;III组为低剂量米力农组;IV组为高剂量米力农组;V 组为致伤对照组。 1(3(3(致伤设备 由烟雾发生器与致伤室组成，:二者之间由燃气软管相连。烟雾发生器:由直 径22cm不锈钢压力锅与1000w电炉组成。高压锅出气阀与燃气软管 长1(5m， 内径1cm 一端相连;致伤室:为特制双拉板式密闭木箱，内径为20cm×20cm× 右侧为玻璃面安装一温度计;前面距顶部5cm距右侧5cm处为排气口，距顶部 27cm处为开槽式拉板B 左右方向拉动 ;后面距顶部20cm距左侧5cm处为进气 口。进气口与排气口均安装阀门，进气口阀门与燃气软管另一端相连。 1(3(4(致伤过程 II组、III组、?和V组大鼠经腹腔注射100mg,Kg氯胺酮麻醉后，参照谢尔 凡、杨宗城等的方法【6】制作大鼠烟雾吸入性损伤模型，每次4只大鼠， 按照以下 过程制作烟雾吸入性损伤动物模型: A(烟雾发生器内放入木屑，打开电炉电源，发烟15min; B(打开进气口阀门和风扇，当报警器报警后关闭阀门; C(拉开开槽式拉板B，将大鼠放入致伤室下层，关闭开槽式拉板B; D(拉开开槽式拉板A，将大鼠致伤15min; E(麻醉清醒后回笼饲养，自由摄食饮水; F(正常对照组不放发烟木屑，其他步骤如上。 1(3(5(给药过程 天津医科大学硕士学位论文 1(对象和方法 II组、III组和?组致伤后，将大鼠置于空气流通处30min，待大鼠意识清醒并 且呼吸逐渐接近正常后，置于自制相对密封玻璃箱中，用超声雾化仪分别给 予 生理盐水、0(4 mg??ml一1米力农 溶剂为 mg??ml。1米力农 溶剂为生理盐水 、1 生理盐水 雾化，每次10min，间隔50min，共4次。 0min30min 90min150min210min240min I组 无 无处理 正常对照组 II组 生理盐水 0(9,NaCl雾化吸入10min，每60分钟重复 对照组 吸入 1次，共4次。 III组 低剂量米性损 0min，每 0(4mg,ml米力农超声雾化吸入1 处死 力农组 伤模 60分钟重复1次，共4次。 型制 ?组 高剂量米 lmg,ml米力农经超声雾化后吸入10min， 力农组 作完 每60分钟重复一次，共4次。 成 V组 无处理 致伤对照组 注:供大鼠雾化吸入的玻璃箱参照相关文献【7】【81自制，为不完全封闭式、透 雾化器输出管连接至玻璃箱底层，将配制好的备用雾化吸入明有机玻璃箱， 液 体注入雾化器的药盒内，打开雾化器3分钟，由雾化器以lml,min的射流速度向 玻璃箱内喷雾，气雾由下向上弥散，使玻璃箱内被气雾充满后，再将大鼠放入 箱内，每次4只。 1(4(标本的收集与检测 1(4(1(样本收集 取上清液，(70?冷冻保存待测血清白细胞介素(6 IL一6 、白细胞介素(10 IL(10 、 肿瘤坏死因子(Q TNF(Q 含量。 股动脉放血，迅速大体观察后将右肺离断，以无菌冷生理盐水洗去表面残血， 滤纸吸干水分，称重 曲，之后将肺组织用眼科小剪刀充分剪碎后 在冰水浴中进 行 ，加入9倍重的冷生理盐水将剪碎组织冲入匀浆管中，于冰水浴中研磨 0 约1 分钟，用组织匀浆器制各成10,组织匀浆，然后将匀浆移入干燥EPPendorf管中， 恒温振荡器充分振荡后冰浴，30分钟后置于4。C离心机中，以3500转,分的速度 1(对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 离心15分钟，收集上清液置于(70?冷冻保存待测丙二醛 MDA 含量、髓过 氧化物酶 MP0 和超氧化物歧化酶 SOD 活性。 由肺动脉行4,甲醛灌洗，固定组织，灌洗完毕后，取出左肺，丝线扎 紧肺 门，将肺组织放入4,甲醛中固定，待做病理切片观察。 1(4(2(大体观察 大鼠仰卧平放于手术台上。解剖颈部和胸部，取出全肺，剔净临近脏器 组织， 用滤纸吸净表面血渍，观察肺脏外观并拍照。 1(4(3(指标检测 L-1 1(4(3(1( I(一6及I 0的测定 血清TNF-a，I 1(4(3(1(1(试剂盒组成 1 6 30倍浓缩洗涤液20ml×l瓶 显色剂B液 6ml×l瓶 2 7 酶标试剂 6ml×1瓶 6ml×1瓶 终止液 3 8 酶标包被板 12孔×8条 品 见表 2 4 9 样品稀释液 6ml×1瓶 标准品稀释液 1(5ml×1瓶 5 10 6ml×1瓶 封板膜 2张 显色剂A液 各指标检测所用标准品: TNF-a 0(5ml c:l瓶 720ng,L IL一6 0(5ml×l瓶 240pg,L IL-10 0(5ml l瓶 200ng,L I 1(4(3(1(2(酶联免疫法 ELSA 检测原理 用双抗体夹心酶链免疫吸附法，先将特异性抗体吸附在固相载体上，加入待 测 标本 含相应抗原 与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 具体原理以大鼠肿瘤坏死因子Q TNF_a 为例说明:用纯化的大鼠肿瘤坏 死因子Q TNF(a 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次 加入肿瘤坏死因子CI TNF(a ，再与HRP标记的肿瘤坏死因子抗体结合，形 抗原一酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在成抗体( HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样 1(对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 品中的肿瘤坏死因子O TNF(a 呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度 OD值 ，通过标准曲线计算样品中大鼠肿瘤坏死因子a TNF(a 浓度。 1(4(3(1(3(操作步骤 a 标准品的稀释:按照试剂盒说明书在小试管中稀释原倍标准品; b 加样:分别设空白孔 空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作 相同 、 u 1，待测样品 孔 标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 u 1 样品最终稀释度为5 倍 。 中先加样品稀释液40I-1，然后再加待测样品10 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动摇匀。 C 温育:用封板膜封板后置37。C温育30分钟。 d 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。 e 洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后 弃去，如此重复5次，拍干。 ti 加酶 l，空白孔除外。 每孑L;0H入酶标试剂50 操作同c 温育 洗涤 操作同e u la l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀， 显色 每孔先加入显色剂A50 37?避光显色15分钟。 u j 终止:每孔加终止液501，终止反应 此时蓝色立转黄色 。 k 测定:以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度 oD值 。测定 应 在加终止液后15分钭-以内进行。 1(4(3(1(4(计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲 线， 根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的 浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式， 计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 操作程序总结如下: 天津医科大学硕士学位论文 1(对象和方法 1(4(3(2( 肺组织匀浆IqlPO的测定 1(4(3(2(1(试剂盒组成及配置 l_瓶 试剂一 缓冲贮备 缓冲贮备液35m1×1瓶，按需要量配成缓冲应用液。 液35ml 缓冲应用液的配制:贮备液:双蒸水 1:9 试剂二 粉剂 2支 临用时每支加缓冲应用液30ral溶解 试剂三 粉剂，溶 各3 用时一支粉剂倒入一支溶剂中溶剂，提前一天配制， 剂6m1 支 充分溶解后4。C保存两周 24ml 1瓶 试剂四 天冷时会凝固，用前放入37。C以上的水中摇晃使其 溶解至透明后方可使用 试剂五 粉剂 2支 显色剂的配制:临用时将试剂五粉剂1支加到lOOml 1支 缓冲应用液中，充分摇匀，待粉剂完全溶解后再加 试剂六 溶液O(5 入试剂六O(1ml，充分混匀，配好后的显色剂4。C避 1(对象和方法 天津医科大学硕士学位论文 光保存。 ml 1支 无需预处理。 溶液 溶液6 1(4(3(2(2(原理: 中性粒细胞中存在有MP0，每个细胞所含的酶的量是一定的，约占细胞干重 的5,，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力， 并 定量测定中性粒细胞的数目，其原理如下: MPO-4-H:0:一复合物; 复合物+AH。 供氢体 一H。0+MP0+A产物 通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定A 产 物的生成量，从而推算出MP0的活力。 1(4(3(2(3(操作步骤 1(4(3(2(3(1( 样本处理 先准确称取组织重量，以配好的试剂二溶液为匀浆介质，按重量体积比为1: 19 ,的组织匀浆，不需要离心。然后取5,组织匀浆0(9ml加匀浆介质制备成5 加3 号试剂0(1ml，充分混匀后37。C水浴15分钟，取出后待测。 1(4(3(2(3(2( 加样 对照管 测定 管 3 0 蒸馏水,ml 0(2 0(2 样本,ml 0(2 0(2 试剂四,ml O 3 显色剂,ml 混匀，37?水浴30min 0(05 0(05 试剂七 混匀，60?水浴10min 1(4(3(2(3(3( 上级测定 在460nm，1cm光径处测定A值 OD值 。 1(4(3(2(4(计算 将计算结果代入下列: 1(对象和 方法 天津医科大学硕士学位论文 MeO u,g [测定管OD值一对照管OD值],11(3×取样量 g 1(4(3。3( 肺组织匀浆MDA的测定 1(4(3(3(1(试剂盒组成及配置 1瓶 室温保存 试剂一 液体20ml 试剂二 液体12ml 1瓶 用时每瓶加340ml双蒸馏水混匀，40C保存 试剂三 粉剂 1瓶 用时将粉剂加入到900C(100。C的热双蒸水 60ml中，充分溶解后加双蒸水补足至60ml， 然后加冰醋酸60ml，混匀，配好的试剂避光 冷藏。 标准品 10nmol,ml四Zj1瓶 40C保存 氧基丙烷5ml 1(4(3(3(2(原理:过氧化脂质产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合， 形成红 色产物，在532nrn处有最大吸收峰。 1(4(3(3(3(操作步骤 a 加样 标准管 测定 管 标准空白管 0(1 0 0 标准品m1 O O(1 O 无水乙醇m1 0 0 O(1