利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊研究（可编辑）

利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊研究（可编辑） 分类号 密级 编号 目 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 ’ 陵 研究生: 袁建龙 及建死 指导教师: 刘东军 专 业: 动物学 研究方向: 生殖生物学与生物技术 学 院: 生命科学学院 二。一三年六月啪删?删 原创性声明 本人声明:所呈交的学位论文是本人在导师的指导‘卜进行的研究.上:作及取得的研究成 果。除本文已经注明引用的内容外.论文中不包含其他入已经发或撰写过的研究成果,也 不包含为获得由墓直太堂及其他教育机构的学位或证社而使过的材料。与我一同.作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了观确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日 日 期:型墨:少坦 期: 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学寺论文的规定,即:内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机;、部】送交学位论文的复印佟和磁盘。允 许编入有关数据库进行检索,也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。 为保护学院和导师的知识产权,作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后 使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果.须征得内蒙占入学就读期间导师的同意:若用 下.发表论文,版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签钇: 指导教师签名: 期:利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 摘要 绒山羊体细胞核移植技术的研究目前处于刚刚起步阶段。本实验 初步建立了转基因绒山羊克隆技术体系,并探讨了不同类型细胞对绒 山羊克隆效率的影响,同时对转基因绒山羊进行了初步的鉴定以 及生 产性能检测。 .绒山羊体细胞核移植技术的建立: 成功体外培养并且保存了四个胎儿来源的绒山羊胎儿成纤维细 舳 ,以及两个成体耳尖成纤维细胞 胞印 肋 ,,并通过方法鉴定了 印 的性别。使用本实验室构建成功的真核表达载体通过脂质体转 染,经 筛选获得了多个转基因细胞系锄 .肋 印血 ,。高效表达外源标记基因红 色荧光蛋白,且生长里旺盛,经鉴定外源目的基因已经稳定整 合入基因组中。 在检测转基因克隆胚胎发育能力时,绒山羊卵母细胞成熟率为 .%/,通过体细胞核移植获得重构胚胎枚,卵裂率 为.%/,囊胚率为.%/,克隆胚胎卵裂较为 均匀并且高效表达红色荧光蛋白。年秋季进行了大规模的胚胎利 用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 移植实验,共采集卵细胞枚,成熟率为./,融 合处理重构胚胎枚,融合率为.%/,卵裂率为 ./,移植胚胎枚,移植受体只次,获得转 基因及体细胞克隆动物只。 .供体细胞类型和受体羊条件对绒山羊体细胞核移植效率的影 响: 本实验主要以不同种类成纤维细胞为核供体研究细胞类型以及 受体山羊排卵数对绒山羊体细胞核移植效率的影响。分别使用不同个 、耳尖成 体来源胎儿成纤维细胞印,、转基因胎儿成纤维 纤维细胞印,为核供体进行核移植操 细胞 作,比较成纤维细胞来源、类型、转基因与否以及性别对融合率、卵 裂率、出生率、出生后存活率以及死亡率的影响。共获得枚重 构胚胎,其中融合枚,体外培养枚,共卵裂枚, 枚形态较好的克隆胚胎进行了胚胎移植实验,共移植受体羊只, 出生只,存活只。不同类型与来源供体细胞其克隆效率不尽相 同,其中胎儿成纤维细胞来源胚胎其克隆效率高于耳尖成纤维细胞来 源胚胎,非转基因克隆胚胎效率高于转基因克隆胚胎,雄性细胞 来源 胚胎克隆效率高于雌性细胞来源胚胎,表明供体细胞的类型是决定克 隆效率的重要因素之一。 克隆胚胎的卵裂率与羔羊出生率以及出生后存活率具有正相关 性,并且早期克隆胚胎的发育能力与体细胞核移植效率具有一定的相利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 关性。在不同年份克隆效率的波动时,发现受体母羊排卵点的多 少也影响了克隆胚胎的移植受胎率。 .转基因克隆绒山羊的鉴定与生产性能检测: 分别统计并分析了不同细胞来源的克隆羔羊妊娠天数与初生重 的区别,并对转基因羔羊进行初步鉴定,检测分析了转基因克隆绒山 羊的生产性能。结果表明不同细胞系来源的羔羊其妊娠天数也不尽相 同,细胞来源的克隆羔羊妊娠天数最长为平均.天,普通 体细胞克隆羔羊妊娠天数最短只有.天。即使相同细胞系来源的 克隆羔羊妊娠天数与出生重也不尽相同,尤其是在转基因细胞系来源 的羔羊中存在较大的波动。 所有个体经检测发现,外源目的基因片段与筛选基因 片段均稳定整合。最终获得的转基因动物的标记基因共出现三种 表达情况:、转基因羔羊的表型和耳尖分离培养的细胞均能观察 到 红色荧光;、个体表型没有红色荧光,但分离培养的细胞具有荧 光; 、个体表型和细胞均观察不到荧光。对同样来自细胞系的普 通体细胞克隆羔羊、转.基因羔羊、转基因羔羊的生产性 能进行了检测,发现转基因的绒山羊产绒量得到较大的提高。 关键词:体细胞核移植; 转基因绒山羊; 供体细胞类型;克隆效 率利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 ? ,, . 缸. . 墒: 舶 . 舳 ?, , 】 阱. 眦, .肋 助 印 饿 印, 吼卿 中.. 陀, . 墒咖 肌 . .%/,仃?. 巧 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究,.%/ .%/,. 驴 墒 . ,.% /仃,向, .% / .% /. 巧 . , . . : 伍助. , 墒咖 ,砌,肌 肋 培 巧. ,, 巧 . 曲巧. ‘觚, 巧巧.咖,归曲巧 叩,, 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究?. , 伍巧,趾 伍 仃 巧 趾 巧., 衔? 一 锄 曲巧. 曲巧 曲 曲曲 曲 叭斤 . 脏 俩 伍, . 巧锣 疆. ..:、帕 仃. .妇. 仃 ’ .: . 行 , , . . , . 巧 撕 【 也锄 、帕,觚 曲 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 . . . , 印 印, 咖, 仔舯 南 . 叩 舶 一 ? , ?啪 . ?讯仃? .:.仃趾; ; ,; 伍 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 目录 .. 摘要 .. .. 目录 缩略词表 引言 参考文献??。 第一章转基因体细胞核移植绒山羊体系的初步建立 育奇言 材料?。 .主要仪器设备和试剂??。 .实验材料?。 .试剂及耗材。 .实验所需溶液的配制 方法?。 胁 .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞印 ,以及耳尖成 纤维细胞研铋右嬲 ,的分离培养?。 .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定?. .转基因阿尔巴斯绒山羊细胞的获得及鉴定??. .绒山羊体细胞核移植体系的构建.. .胚胎移植与产羔?。 结果?.. .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞以及耳尖成纤维细胞的分离培 养?。 .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定?。 .转基因阿尔巴斯绒山羊细胞的获得及鉴定??。 .绒山羊体细胞核移植技术体系的建立?. 对论?.. 参考文献??.. 第二章供体细胞类型和受体羊条件对绒山羊体细胞核移植效率 的影响 引言 材料与方法.. .试剂及耗材.,与成体耳尖成 .绒山羊胎儿成纤维细胞印血 盯 纤维细胞州 ,的分离及性别鉴定. .绒山羊成纤维细胞的转染和筛选以及鉴定及供体细胞的准备。 .绒山羊卵母细胞的采集,体外成熟与核移植操作??.. .胚胎移植与克隆羊的生产.. 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 .克隆效率计算??.. .数据分析??.. 结果? .不同细胞来源对克隆效率的影响? .不同种类成纤维细胞对克隆效率的影响。 .非转基因供体细胞与转基因供体细胞对克隆效率的影响??一 .性别对克隆效率的影响?。 .不同年份受体羊排卵点数对克隆效率的影响?.. 寸论:. 参考文献 第三章转基因克隆绒山羊的鉴定与生产性能检测 前言?,??. 仪器设备与试剂材料??一 方法??.:??。 .克隆羔羊基本数据的采集。 .克隆羔羊耳尖成纤维细胞的采集? .转基因羔羊初步鉴定??。 .转基因羊生产性能检测与筛选?.. 结果:? .转基因克隆羔羊与体细胞克隆羔羊妊娠天数如初生重的对比? .克隆羔羊耳尖成纤维细胞的培养。 .转基因羔羊初步鉴定 .转基因羊生产性能检测?。 讨论:. 参考文献??. 结论 综述部分 第一章转基因动物研究方法 显微注射核酸法获得转基因动物?.. .干细胞介导获得转基因动物. 体细胞核移植法??. 第二章影响体细胞核移植的因素. 供体细胞对体细胞核移植效率的影响??. 卵母细胞质量与克隆胚胎对克隆效率的影响??. 胚胎移植方法与动物后期管理对克隆效率的影响. 参考文献。 致谢 博士期间发表论文 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 缩略词表 . 山羊胎儿成纤维细胞 转基因山羊胎儿 。 仃锄 印 成纤维细胞 嬲山羊耳尖成纤维细胞 . 体细胞核移植 牛血清白蛋白 细胞松弛素” 如 卵丘卵母细胞复合体。,匝佰 ’ 硼们 胆培 养基 红色荧光蛋白 . 。 乙二胺四乙酸 ?枷仃 培养液 胎牛血清 二甲亚砜 . .二甲基胺基嘌呤 一促卵泡生成素 生长激素钙离子载体 哪 . 胰岛素样生长因子 勰硼甜锄 血管内皮生长因子 诱导多潜能干细胞 嘶 原核注射 精原干细胞 体外受精体外成熟 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 信使 砌呵 伽 新霉素抗性 聚合酶链式反应 妒? 启动子 巨细胞病毒启动子 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 引言 随着分子生物学的迅猛发展,转基因技术在农业以及医学领域取得了巨大的 成就,大量的转基因新品种新物种层出不穷。转基因动物技术在经历几十年的发 展后,目前诞生了很多的新技术新方法,而体细胞核移植技术 .,就是在二十世纪末出现的新的转基因技术【,。英国著 名发育生物学家约翰格登 正是因为在动物细胞核移植技术上取得 的巨大成就而被授予年诺贝尔奖生理及医学奖。由此可见技术当前 已经被世界广泛认可成为在生命科学重要的研究热点。 虽然通过体细胞核移植技术目前已经得到了大量的克隆以及转基因克隆动 物【】,但是克隆效率低下仍然是研究人员面临的一大难题【】。尤其是在大家畜中 克隆效率的低下,直接限制了此项技术在规模生产实践中的应用【】,如何提高克 隆效率,加快转基因家畜的发展是当今研究的主要方向之一。 自年国家实施转基因重大专项以来,中国的转基因研究进入了蓬勃发 展时期。转基因重大专项“高产绒量转基因绒山羊新品种培育主要是针对我国 特有的绒山羊品种而实施的。绒山羊作为我国特有特色畜牧品种,广泛存在于东 北、内蒙、西北、新疆、西藏等地,是这些地方主要的家畜品种。绒山羊所产羊 绒因为纤细平均直径.微米、柔软、卷曲、弹性、蓬松、保暖、抗皱等 性能,使所生产的纺织产品轻盈、华贵、保暖、抗皱,被国际上称为“软黄金’’、 “皇冠上的宝石”,是国际上最享盛誉的绒毛纤维。绒山羊多生长于上述地区, 环境较为恶劣、经济相对落后地区,因此绒山羊养殖成为当地农牧民的主要经济 支柱之一。但如今为单纯提高羊绒产量盲目地遗传杂交,造成平均产绒量和羊绒 质量降低、良种和杂交改良品种所占比例不高等种种问题,急待以现代生物技术 进行二次选育和品种改良。因此利用体细胞核移植技术与转基因技术相结合获得 转基因高产优质绒山羊,为绒山羊遗传育种提供新的思路与方法。 转基因体细胞核移植涉及到的步骤较多主要包括:包括转基因供体细胞制 备、卵母细胞去核、重构胚胎的融合、融合胚胎的激活、克隆胚胎移植、受体动利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 物饲养管理管理等环节。每一个环节都决定着最终体细胞核移植的成败与效率, 因此每一个环节都需要进行一定的优化和摸索。对于不同的物种,不同的实验室 都会总结出一套独特的技术体系,因此在不同的物种克隆体系中每个环节各有不 同,因此也造成不同克隆动物其最终克隆效率不尽相同【,。 关于绒山羊转基因克隆的研究相对较少【,因此我们首先要建立一套完善的 适合于绒山羊的体细胞核移植技术。在获得稳定的绒山羊体细胞核移植技术体系 后,为了为进一步提高克隆效率提供理论依据,我们进一步探讨了不同供体细胞 类型对克隆效率的影响。关于细胞类型对克隆效率的影响的研究目前有很多【. ‘ ,但是在不同的物种之间会出现不同的结果,即使在相同的物种不同的文献 报道中结果也不尽相同。核供体作为克隆胚胎的重要组成部分,对最终克隆效率 的高低起着十分重要的作用,因此很有必要在探索稳定的绒山羊体细胞核移植体 系后,继续研究不同细胞类型对克隆效率的影响,以期能筛选出具有较高克隆效 率的绒山羊细胞类型,为以后转基因克隆绒山羊的大规模生产提供前期研究基 础。 本文同时分析了不同细胞类型克隆羔羊妊娠天数与初生重的差别,并对已经 得到的转基因克隆动物进行了初步的鉴定,以及对绒山羊生产性能进行了检测, 期望能筛选出具有优良性状的转基因克隆绒山羊。本研究对今后利用体细胞克隆 技术培育转基因绒山羊新品系、实现绒山羊养殖业的健康可持续发展具有十分重 要的意义,同时也可以为相关研究提供实验依据。利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 参考文献 嘶舶 ,.,..,.、胁,.,?舔 觚 锄 .,.:. 口 ,..,..硒,..砌,.,眦锄?仃 舶 协 仃 .,。 印. .: 舶瓯.., 仃向.鼢 .:?. .,触,.,.锄 仃蠡扎 ,.:. 睾 锄 . 降 饥.. , 缸. 孤 :鲥 . 印, 时 ,.:?.,..锄 .锄锄,锄 仃..、、,矾 ? ,.:. 譬,锄 ,. 儡:锄 ,.一:?. 印伊锄 嬲 隅 ,..,..抽,..,.,. . .矗 舐 : ,.:一. ,.,.“,.,., :虢. ,.:. 撕,.,.蜀卤,.萄,.,虢仃向巧 仃.,.:.,.,.,.矾.,虢 口 , 臼『伍 印 .利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 凡锄 . ,.:铲 【 】 ,..,..毹,.,.,仃 伽 础,,舳 衙巧 ? 锄,.:?. 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 第一章转基因体细胞核移植绒山羊体系的初步建立 前言 携带外源生长激素转基因超级小鼠的诞生【】表明人们可以通过转基因技术 改良哺乳动物的性状。因此利用转基因技术改良大动物,尤其是家畜的生产性能 成为当前研究的热点。“多利的诞生标志着哺乳动物体细胞核移植技术克隆 技术的成功‘,尤其是体细胞核移植技术与转基因技术相结合【】,为新品种培 育提供了新的技术手段。克隆技术在转基因动物获得方面有着很大的优势,比如 说可在细胞层面进行基因筛选得到高效表达外源基因的供体细胞,同时也可获得 基因打靶供体细胞,并且使用转基因核供体细胞通过体细胞核移植得到的克隆动 物其为转基因动物的概率理论上为%。 阿尔巴斯绒白山羊为内蒙古特有品种,所产的山羊绒因为纤细平均直径 .微米、柔软、卷曲、弹性、蓬松、保暖、抗皱等性能,使所生产的纺织产 品轻盈、华贵、保暖、抗皱,被国际上称为“软黄金”、“皇冠上的宝石,是国 际上最享盛誉的绒毛纤维。而由于我国绒山羊养殖产业普遍存在着盲目追求数 量、个体性能退化、平均产绒量和绒质量降低、良种和杂交改良品种所占比例不 高等种种问题,急待以现代生物技术进行二次选育和品种改良。利用转基因体细 胞核移植技术获得具有优良性状的绒山羊新品种,加快绒山羊遗 传育种进程成为 目前行之有效的手段之一。 由于转基因体细胞核移植是一个庞大的技术体系包括转基因供体细胞制 备、卵母细胞去核、重构胚胎的融合、融合胚胎的激活、克隆胚胎移植、受体动 物饲养管理管理等等诸多环节。每一个环节都决定最终体细胞核移植的成败与效 率,因此每一个环节都需要进行一定的优化和摸索。对于不同的物种,不同的实 验室都会总结出一套独特的条件,在不同的物种克隆体系中每个环节各有不同, 因此也造成不同克隆动物其最终克隆效率不完全相同的结果【】。 在转基因克隆绒山羊的前期研究中,等做了大量的工作【一。本研究根 据本实验室以前建立的转基因克隆技术体系进行优化,同时通过后期的胚胎移植 以及产羔实验来验证转基因克隆技术体系是否构建成功。 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 材料 主要仪器设备和试剂 倒置荧光显微镜 、体视镜 、培养温箱 、显微镜显微操 、恒温水浴锅硼、高温低速离心机艾本德 作系统撕拉针仪撕,、煅针仪撕谵,,磨 针仪撕, .实验材料 卵巢取自鄂尔多斯市鄂托克屠宰场和呼和浩特市北亚清真屠宰 场。 .试剂及耗材 倒 伍 、、 毹 .’ 、饵、.%胰蛋白酶、抗生素等 ;标准胎牛血 细胞培养常用试剂无特殊说明均购自公司 清为中国天津公司产品;无机盐以及为日本狄。 公司 ;脂质体锄购自美国公司 :细胞培养常用耗材无特殊说明均购自 ,其中四孔 板为丹麦公司 四;去内毒素质粒提取试剂盒购自 ,其他分子常用试剂盒无特殊说明均购自朗公司 巧 ;其他试剂无特殊 ,聚合酶为公司产品 。 说明均购自酆?公司 .实验所需溶液的配制 . ×幻 /砌,最终使用浓度删: 粉剂全利用体细胞核移植技术生产转基 因绒山羊的研究 部加入 六蒸水中,分装成 /管。 : .透明质酸酶溶液. 溶液中 / 粉剂溶于 .,分装成肛/管。 ..×贮存液,使用浓度为衄/: .溶于. 二甲基亚砜。?/管分装,.?保存。 .细胞松弛素浓贮液×,有效作用浓度.圳: 中,充分溶解后,叫管,.?保存。 粉剂加入. .卵母细胞成熟液:%绵羊发情血清 .幽: / 雌二醇咖 .酌丙酮酸钠×双抗。 .采卵液:溶液%.%肝素钠溶液双抗。 .核移植操作液:卵母细胞成熟液浓储液。 】 .胚胎融合液:.】?甘露醇. 印.忙. %渗透压为。 .胚胎培养液:砚% 方法 肋阳 .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞 ,以及耳 肋 尖成纤维细胞 ,的分离培养 .. 细胞的原代培养 使用外科手术的方法取出大小约的绒山羊胎儿,将胎儿放置于加 入双 倍双抗的溶液中,于内带回实验室。使用组织块贴壁的方法获得 原代 细胞。其步骤为: :使用含有双倍双抗的清洗胎儿次,用%酒精浸泡,再将 胎儿使用含双倍双抗的清洗三遍; :在超净工作台中去除胎儿头、四肢及内脏,使用灭菌的眼科镊子 将胎儿 躯干表面的皮肤及结缔组织取下,放入衄培养皿中,使用弯头剪刀剪碎; :使用镊子将剪碎的组织均匀铺在衄培养皿皿底,培养皿倒置于培养 箱中干燥培养 ,然后加入含%以及双倍双抗的/培养液,于利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 ?、%、饱和湿度条件下培养, 后换液。 :培养期间不断观察成纤维细胞生长状况,待细胞出现汇合时用移液器吸 头小心去除皿底的组织块,并吸去原有培养液。用含有双倍双抗的.清洗 细胞次,使用.%胰蛋白酶溶液消化 ,加入 /% 培养液终止消化; :使用移液器反复吹打,使细胞悬浮并收集细胞于 离心管中, 离心 ,弃上清,再加入 后,加 培养液重悬细胞,印离心 入适量培养液重悬并计数。 :获得的原代细胞中,一部分以.×个/血的浓度传代至砌培养 皿中扩大培养; :另一部分以.×个/的浓度置于含有冻存液的冻存管中冻存液成 分为%%,将冻存管放入冻存盒中,.?过夜,然后直接投 入液氮罐中长期保存。 ..:的原代培养 使用剃毛刀将绒山羊耳尖绒毛剔除干净,碘酒棉消毒次,酒精棉消毒三 次,然后使用剪刀剪下约 的耳尖,对采样绒山羊进行止血与消毒处理,同 时将获得的耳尖在%的酒精中浸泡血, 使用含有双倍双抗的清洗三 遍,并放入溶液中带回实验室。同样使用组织块贴壁的方法获得, 具体方法与。.相同。 .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定 根据基因特异引物,为防止出现假阴性结果的出现同时使用山羊 为内参基因表.,反应体系如表.所示,具体方法与 金永硕士论文相同【。.利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 表.性别鉴定用傀引物 阻 . 既们 鹅 表. 反应体系 ..名称 体积 × 硇?髑 .山 棚 .肛.“ 锄 .山 .肛 . .转基因阿尔巴斯绒山羊细胞的获得及鉴定 ..脂质体转染绒山羊成纤维细胞 使用去内毒素质粒大提试剂盒提取本实验室已经构建成功的真 核表 操作说明和 达载体.?质粒并线性化‘,参照英俊公司. 要求进行转染实验。 具体步骤: .转染前一天消化并传代,按照× 细胞/孔密度接种于六孔培养 板,待细胞 生长达到%汇合度时进行转染。 .溶液:将无血清培养基与 混合,室温 锄 。 孵育 。 .溶液:将无血清培养基?与嵋质粒充分混合,室温静置 。 .溶液与溶液混合均匀,室温下静置利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 .使用溶液将孔板中的待转染的细胞清洗次,再使用无血清的溶 液冲洗一次,加入. 无血清培养基。 .将溶液与溶液的混合液慢慢逐滴加入孔板中,上下摇动培养板,轻轻 混匀。在?,%的饱和湿度下,孵育。 .后,吸出原先的培养液缓缓加入新鲜的盼厦/%培养基。 .在?,%的,饱和湿度条件下培养,观察转染效率。 .. 转基因细胞筛选和扩大培养 转染后,.%胰蛋白酶消化细胞,并以×个/砌密度接种与 培养皿中, 更换新鲜的既压/%含有肛鲋叫弭的培养 液,每换液一起,连续培养。然后荧光显微镜下观察同时具有红色荧光 的单克隆细胞群,在培养皿底相应位置以记号笔标出克隆群落的位置。使用 山移液器吸头将除记号笔标注位置外的其他细胞刮出,然后胰酶 消化收集细胞, / 将获得的细胞传至新的培养皿中,使用浓度为删 %培养液扩大培养并冻存,细胞冻存方法与..相同。 ..转基因细胞的鉴定 根据表达载体序列设计特定引物片段、片段、同时设计 .基因片段为悄内参基因【】图.,表.。反应条件如下:?预 变性 、?交性 、?退火 、?延伸 ,个循环。 产物%琼脂糖凝胶电泳,染色照相。反应体系与方法.相同。 图. 特异性引物检测示意图 锄 强.. 心 爆? 端挪利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 表.检测用引物序列及大小 . 阻 岛 璐 .绒山羊体细胞核移植体系的构建 ..卵母细胞的体外成熟 ? 将从屠宰场采集到的山羊卵巢置于室温的生理盐水中, 内运回实验室。 生理盐水清洗卵巢次,使用眼科剪刀除去卵巢上多余的脂肪,再清洗次。使 用号针头的针管吸取山羊卵巢上的卵泡,然后在显微镜下挑选形态完好,卵 丘细胞完整、包裹致密的卵丘.卵母细胞复合体,使用卵母细胞成熟液 洗将采集到的清洗遍, .?、%和饱和湿度的条件下成熟培养。 后,将置于含.%的透明质酸酶的溶液中孵育,使用“ 移液器轻轻反复吹打,去除成熟卵母细胞表面的卵丘细胞,再用成熟液将 裸卵清洗次,在体视镜下挑出带有第一极体的成熟卵母细胞,放入培养箱中备 ’ 用。 ..核供体细胞的准备 将冻存的供体细胞解冻,分别以×个/、×个/、× /浓度 弭的伊%培养液的孔板中,待转 接种于含有?/ 细胞生长至%汇合度时,即可作为核移植细胞核供体。核移植前,消化细胞, 离心并使用的培养液重悬,室温静置后备用。在年秋季进行体 细胞核移植实验中,我们为保证实验的顺利进行均选择以及转基因 作为供体细胞,未选用细胞作为核供体使用。利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 ..体细胞核移植核移植操作去核、融合、激活 将成熟卵母细胞置于含有.嵋/锄的核移植操作液小滴中,滴中同 时加入供体细胞,在显微镜下使用显微操作仪进行去核和注核操作。先用去核针 吸出第一极体及其附近的的少许卵胞质,再将形体均匀表达红色荧光的供体细胞 从透明带缺口处注射到去核后的卵母细胞透明带下,用去核针调整细胞位置,尽 量将细胞与卵母细胞紧密结合,形成卵母细胞.供体细胞复合体。 将卵母细胞.供体细胞复合体在成熟液洗次,在.?、%和饱 和湿度条件下恢复,然后进行电融合。电融合步骤:待融合的卵母细胞. 供体细胞复合体在融合液中平衡 ,然后转入间距为.且覆盖有融合液 的融合槽中,用吸管调整卵母细胞方向,使卵母细胞.供体细胞接触面与两极平 行。以融合参数为 /,两次直流脉冲、 /次,间隔 的电脉冲 进行融合。将融合后的卵母细胞.供体细胞复合体放入成熟液清洗次,然后置 后检查融合情况,挑出已经融合的重构胚胎并统计 于培养箱中恢复 . 融合率。的砚激活液中平衡 将挑出的融合重构胚胎置于在含有 ,再放入含订.的培养液中,于.?、%和饱和 湿度条件下培养。 ..克隆胚胎的体外培养 将激活后的重构胚用龃发育液洗次,再放入含“发育液的四孔板 中,在.?、%和饱和湿度条件下培养, 后统计卵裂率,挑取卵裂 球均匀,形态正常的克隆胚胎用于胚胎移植。部分胚胎继续培养,七天之后观察 囊胚发育情况并进行统计。 .胚胎移植与产羔 ..受体羊的前期准备 在进行大规模胚胎移植时期,每天早晚通过公羊试情的方法观察受体母羊发 情情况。公羊试情需穿戴专门的试情布,以母羊稳定接受公羊趴胯为发情标志。 发情母羊空腹 后用于手术移植。手术前半小时注射麻药静松灵. 进行麻 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 醉,固定于手术架。 ..外科手术法胚胎移植 在受体羊靠近乳房下侧,腹中线处使用手术刀划开约长的开口,用手轻 轻勾出山羊子宫,观察并判断受体羊的卵巢排卵点位置。同时在实验室取出发育 至细胞的克隆胚胎,根据胚胎数目以及受体羊数目,用胚胎移植枪头吸取一 定数量的克隆胚胎。通过输卵管移植的方法将胚胎移入具有排卵点侧的输卵管 中。移植完毕后对受体羊双层缝合伤口,并作消毒处理。 ..受体羊的术后管理与试情 受体母羊在手术结束后单独进行饲养,并进行一定量的补饲管理。在手术 后,待伤口愈合,进行试情观察是否返情。两个情期未返情的受体 羊具有妊娠情况,并对其进行超检查,进一步确定是否怀孕。对怀孕受体羊 董 单独管理,保障其营养水平与一定的运动量。 ..克隆羔羊的产羔与管理 待受体羊进入预产期后,每隔观察母羊情况,是否有生产迹象, 如蹬地、坐卧不安、阴道红肿等。如果母羊有难产迹象,则需要 进行人工助产, 防止克隆羔羊出现窒息等现象。 结果 .阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞以及耳尖成纤维细胞的分离培 养 成功分离得四只的胎儿图.,培养后得到了细胞以及两个成体来 源的细胞。细胞形态正常图.,生长力旺盛,可用于下一步的转基 因转染。利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 图. 天大小域山羊胎儿及绒山羊耳尖成纤维细胞 蚰 喀. 曩他时 曩.蛆薛由? 曩 二监 :天大小绒山羊胎儿实物图 :显微镜下耳尖成纤维细胞 : :? ??鼬.阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定 性别鉴定结果如图所示,使用.共鉴定了四个绒山 羊胎儿的性别,电泳结果显示号、号胎儿为雄性,号、号胎儿为雌 性。 图.绒山羊胎儿性别鉴定结果 衄 .. 铭?姐弛驴昼卿 盯。??卜 ? 三一 ??. ? ~ ?盛 : 【盯:.分别为号、号、号、号胎儿成纤维细胞产物;:公羊耳 尖成纤维细胞产物;:母羊血液基因组产物::公羊血液基因组产 物:: 空白对信号;: .、.、。、. : ;: :匝姨【盱;:舯 列托 撇 : ;:咖;: 柚 : 【 向吣; 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 .转基因阿尔巴斯绒山羊细胞的获得及鉴定 以郭旭东等优化的转染条件为基础进行细胞转染是可得到良好 的转染效 果,并可以获得较多的表达红色荧光转基因克隆图.。在经过长时间 药物筛选后,所得到的转基因在形态上无明显变化,增殖速度正常。提取 转基因细胞基因组进行检测,结果显示外源目的基因片段已经整合如基 因组中图.。转基因经冷冻解冻后未发生明显变化,可用于体细胞核 移植供体。 图.转基因荧光照片 瑚 .. 酗 嘲 ? 熏 ~熬 :可见光下的转基因× :荧光激发下的转基因×利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 图.鉴定外源基因在转基因中的整合情况 铂.. 即虹 : 妇呲:普通对照 组片段结果::转基因成纤维细 胞片段结果::质粒片段 结果。 : 仃;: ;:;: 臼:咖 协 .绒山羊体细胞核移檀技术体系的建立 ..转基因绒山羊克隆胚胎体外发育能力检测 在大规模进行胚胎移植前,先根据建立起的体细胞核移植技术进行克隆胚胎 的体外发育能力检测。结果显示重构胚胎的融合率为.%, 卵裂率为.%, 囊胚率为.%表.,并且获得的转基因克隆胚胎形态常,高效表达红色荧 光蛋白图.。以上结果显示在体细胞核移植中得到的数据与等获得的 结果【】相似,说明我们建立的体细胞核移植体系稳定,该体系可以用于大规模生 产克隆胚胎和胚胎移植。利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 图.表述红色荧光蛋白的转基因克隆胚胎? ? 逛.. 心 :可见光下的转基因克隆胚胎×:荧光激发下的转基因克隆胚胎× × × 血 曲血 袁.:转基因克隆胚胎体外发育情况 . 、,蛆 他 珊寥 ..绒山羊转基因克隆胚胎的大规模生产 在转基因克隆胚胎生产体系建立的基础上,我们在实验牧场进行了大规模的 转基因克隆胚胎生产,具体结果如表.所示。在年秋季,共采集卵母细 胞枚,其中成熟枚,成熟率为.%;共获得枚卵裂胚胎, 卵裂率为.%。由于在胚胎移植时,我们选择的是输卵管移植法,所移植胚胎 均处于.细胞期,所以转基因克隆胚胎未进行长期培养。利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 表.转基因克隆胚胎的规模化生产 . 心 廿 .转基因克隆羔羊的产羔与管理 年秋季共移植胚胎枚,移植受体只次。年获得克隆羔羊 只转基因细胞克隆只,体细胞克隆只,出生率为.%出生数/移植 受体数。年出生的转基因克隆羔羊生长无明显异常,状况良好表.。 袁. 年出生克隆羔羊统计 . 廿 住北讨论 选择供体细胞类型时,我们将成纤维细胞作为的首选,这是因为在山羊体细 胞核移植研究中以成纤维细胞作为核供体获得克隆动物的报道较多【】,并且成 纤维细胞易于获得与纯化,对培养条件按无特殊要求,其增殖速度较快,利于基 因转染。用于克隆核供体的成纤维细胞的种类有很多【,,本实验中主要分离了 胎儿成纤维细胞与耳尖成纤维细胞。但是在最终的体细胞核移植实验中只选取了 胎儿成纤维细胞和转基因胎儿成纤维细胞作为核供体。这是因为 与相比,其增殖速度较慢,相同转染条件下基因整合效率低,且在利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 药物筛选时,非转基因细胞容易被杀死。基于上述原因我们在最先的克隆实验中 选择了。 外源基因转入细胞基因的方式除了脂质体转染法之外还有电转染、病毒转 染、化学转染等方法,而在本研究中主要使用电转染与脂质体转染这两种方法。 其中脂质体转染方法与电转染相比具有其操作简单,不需要特殊的仪器设备与试 剂,转染过程比较温和,对细胞损伤较小,细胞死亡率低【 ,因此作为我们主 要的基因转染方法,并进行了一定的优化【】。 在卵母细胞的融合以及激活方法的优化条件中,课题组之前做了大量的工作 【,,因此在本章的实验中未进行进一步优化与摸索。同样的技术体系在实验室 中得到的克隆胚胎的融合率与卵裂率均高于在牧场中的数据,这可能是因为实验 室相比与牧场各个方面的条件均比较优越,比如电力的稳定、实验室温度的控制、 洁净度的保持等。而且在牧场实验时,大部分克隆胚胎在激活后便进行了胚 胎移植,因此未对胚胎采取长时间的培养与观察,卵裂速度较慢的克隆胚胎可能 就被忽略而未列入统计数据中,这也可能是造成牧场中数据较低的原因。 在受体羊的管理方面,主要注意保持怀孕母羊合理的饲养水平, 切忌盲目地加大 营养,同时保持受体母羊一定的运动量,以上措施可防止造成胎儿巨大而产生难 产现象。与体细胞克隆羔羊相比转基因克隆羔羊的妊娠时间会向后推迟几天,具 体数据见第三章,妊娠时间的延长在一定程度上表明可能会出现难产现象,因此 要注意母羊的状况,随时准备人工助产。 年度共移植受体羊只,获得体细胞克隆以及转基因羔羊只,受 胎率为.%,根据以上实验结果表明转基因克隆绒山羊技术体系已经基本建立。 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 参考文献 ..,..%..砌.,姗 ? 幻 锄 卜苫、矾 .. 劬 】 叫,.,.,.肌,., 仃埘距皿 .狐聆,.:. 】 ,..,..飚,..鼬,.,眦 ? 舶仃 .舶., . : 】 , , 伍:肌 印舢 ,.:.】 ,.,.,.,., ?疆. 肋. ,硎撕 . ,. :】 ,..,..,..,., 即小巧 惦 ? 们. 行嘶 : ,.:?. 【】 金永,毛囊细胞特异表达胸腺素肛基因转基因绒山羊研究, 内蒙古 大学:中国优秀硕士学位论文全文数据库. 】 马玉珍,扈廷茂,王建国,等,绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及 转基因研究. 中国实验动物学报,.:...】 ,.,.,..锄,., 锄矗巩 . . , : 嘶 】 ,.,.,..肌,.,的 ?. .觚 .,. : 】 ,.,,.,., 利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究’ 啪 姗 . 时腮 ,? 刁 ,.,.,.,.,仃 , / 仃 巧 ..鼢 ?. .:?? 习 ,,.,.,., 舶 . : ,.:?. ,.,.撕,.彻黜,.,腩 ? 卅 呻 眦印 . ,.:. 李松,丁方荣,戴蕴平等,不同转染方法转染牛体细胞效率的比较. 农业生 ? 习 物技术学报,.:.. ??,???,? ? 金永,袁建龙,朱兵等,不同激活方法对绒山羊卵母细胞孤雌发育的影响. . 农业生物技术学报, :.?.利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 第二章供体细胞类型和受体羊条件对绒山羊体细胞核移植 效率的影响 引言 自年世界第一只体细胞克隆动物诞生以来【】,体细胞克隆与转基因技 术相结合,生产转基因动物已然成为家畜品种改良的新手段【圳。但是核移植技 术效率低下是目前面限制其发展的主要问题【】。影响体细胞核移植技术效率的因 素有很多,包括受体细胞类型、核移植技术体系、受体动物、卵母细胞来源等。 其中供体细胞类型是其中的重要因素之一【】,体细胞的来源、遗传修饰以及 性别都会对克隆效率产生影响。等】以牛的成体耳尖成纤维细胞与胎儿成纤 维细胞作为核供体进行对比,发现其植入前克隆胚胎发育能力无差别,但未进行 进一步的胚胎移植实验;转基因克隆细胞与非转基因克隆相比较时,大多数研究 表明转基因克隆效率可能会低于非转基因克隆效率【,】;供体细胞性别也可能是 】 影响克隆效率的因素之一,最早报道的克隆哺乳动物为雌性动物【,等【 报道雌性细胞做为核供体其克隆效率高于雄性细胞,但&幻等【 】的结果显示出 雌雄细胞间的克隆效率未有明显的不同。因此关于供体细胞类型与克隆效率之间 的关系在不同的物种间会出现不同的结果【】,具体原因尚不清楚。目前供体细胞 类型与克隆效率之间关系的研究主要集于模式生物中【,】,在大家畜中的研究 也主要以牛【’,”为主,关于山羊尤其是绒山羊在此方面研究尚未见报道。 受体动物也是影响克隆效率的之一,在克隆猪上的研究表明与胚胎移植时期 受体动物的排卵情况有着明显的联系【 。受体动物的年龄也是 其中重要的因 素【,,在胚胎移植的过程中受体动物管理决定着胚胎移植的成败【。研究表 明受体动物的的营养生理水平好坏可决定超数排卵的效果【,所以反之未经 处理的受体羊其排卵点的多少是否也可在一定程度反映出受体羊的生理水平而 影响胚胎移植的效率有关方面的研究上未见报道。 本实验在先前建立的绒山羊体细胞核移植技术体系基础上【”,以成纤维细 胞为主要实验材料,探讨不同核供体细胞类型胎儿成纤维细胞与成体成纤维细利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 胞、转基因体细胞与非转基因体细胞、不同性别的细胞等以及不同年份受体羊 排卵数对克隆效率的影响,以便为今后进一步完善绒山羊转基因克隆技术提供实 验依据。 材料与方法 .试剂及耗材 与第一章相同。.绒山羊胎儿成纤维细胞 ,与成体耳尖成纤维细胞 ,的分离及性别鉴定 与第一章相同。 .绒山羊成纤维细胞的转染和筛选以及鉴定及供体细胞的准备 以脂质体介导法将本实验构建好的真核表达载体转入成纤维细胞,使用进行药物筛选,获得转基因胎儿成纤维细胞, ,分别命名为、、、【。根据转 基因载体上的特殊序列设计引物,对获得的转基因细胞进行检测以判断外源 基因的整合情况?】,同时进行生长曲线与染色体数目分析,判断转基因细胞基本 正常,可作为核供体细胞。 将待用的供体细胞分别以×个/血的浓度接种到孔板中,使用 %培养液,%、饱和湿度环境下培养。待生长状态恢复,出 现%汇合时,使用.%蛋白酶消化,离心收集细胞后,一培养液重悬 细胞待用。 .绒山羊卵母细胞的采集,体外成熟与核移植操作 绒山羊的卵母成熟与核移植操作与第一章相同,重构胚胎培养至 后统计 卵裂率。利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究 胚胎移植与克隆羊的生产 待克隆胚胎发育至细胞时,挑选形态较好的胚胎移入同步发情的受体羊 体内【,每只受体羊移植胚胎数在枚左右。在胚胎移植的时候记录受体母羊 卵巢排卵点的多少。相同并以连续两个情期未返情为标准来判断初次妊娠率。绒 山羊待预产期临近时对即将临产的受体羊进行重点监护,防止难产等情况的发 生。对转基因克隆的羔羊进行静脉取血,提取基因组:再根据外源基因的特殊序 列设计特异性引物,进行鉴定,。 动物实验均在内蒙古大学转基因动物安全管理办公室的监管下完成。转基因 动物管理符合中国农业部《转基因生物安全管理办法》规定。 .克隆效率计算 计算不同供体细胞类型来源胚胎不同个体来源、不同成纤维细胞种类、转 基因与非转基因、不同性别的融合率、卵裂率、妊娠率、出生率、出生后存活 率以及胎儿死亡率,以分析细胞类型对克隆效率的影响;在统计受体羊对克隆效 率的影响时,统计每年含有两个及两个以上排卵点的受体羊在所有受体羊的比 例,并与当年的总克隆效率进行对比。 .数据分析 所得到数据经软件分析 。表使用一般线性模 型多变量检验?~,表、、使用卡方检验。 结果 本年度共获得枚重构胚胎,其中融合枚,体外培养枚,共 卵裂枚。克隆胚胎形态正常,转基因胚胎大部分表达红色荧光蛋白,可用 于胚胎移植生产转基因克隆动物。挑选出枚形态较好的克隆胚胎进行胚胎 移植实验,共移植受体羊只,出生只,一周后存活只表.。死亡 羊羔多表现为全身水肿、呼吸困难、胎儿巨大、消化不良等症状。