药学论文-融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用

药学论文-融合蛋白HSP70EGFP的达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用 融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用 【摘要】 目的: 树突状细胞(DCs)对热休克蛋白70(HSP70)融合蛋白的内化作用. : 首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白HSP70?EGFP. 实验中所用DCs来源于人外周血. 内化实验分3组进行:将1，2组DCs分别与融合蛋白HSP70?EGFP和蛋白EGFP孵育30 min;第3组先将DCs与HSP70孵育30 min，再与HSP70?EGFP孵育30 min. 之后将3组 ，1，2和24 h，流式细胞仪检测含DCs转至37? 孵箱内，培养0.5 HSP70?EGFP或EGFP的DCs数量. 应用IL?12 Eli?spot法检测HSP70?EGFP等抗原促进DCs分泌IL?12的效果. 结果: ? 成功获得了重组蛋白HSP70?EGFP， Mr约为97 000，HSP70?EGFP表达量占总蛋白的35.7%. 纯化后的融合蛋白HSP70?EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光. ? 流式细胞仪检测结果显示在37? 孵育0.5 h后，HSP70?EGFP孵育的DCs组阳性率为63.3%，其余两组为阴性. 在37? 孵育1，2和24 h后，3组阳性率均大于80.0%. IL?12 Eli?spot检测结果显示，在刺激DCs活化及分泌IL?12的水平上，HSP70?EGFP与脂多糖(LPS)之间的差别无统计学意义(P>0.05)，而HSP70?EGFP的活化DCs能力明显高于EGFP (P=0.001). 结论: ? 受体介导的吞噬作用在DCs内化HSP70?EGFP的初始阶段起主要作用，随孵育时间的延续，吞饮作用占主要地位. ? HSP70?EGFP可促进DCs分泌特征性细胞因子IL?12. 【关键词】 吞噬作用;受体介导;树突细胞;重组融合蛋白质类;热休克蛋白质70;绿色荧光蛋白质类 热休克蛋白家族在肿瘤免疫中发挥着免疫佐剂的功能，对开发肿瘤疫苗具有重要意义. 许多研究采用标记的热休克蛋白观察 HSP?肽复合物在抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)上的呈递过程，发现 APC 表面存在 HSP 受体,1-2,. 有研究发现，gp96融合蛋白与受体结合后，可以激活树突状细胞(dendritic cells，DCs)分泌IL?12和TNF?α，增强其抗原递呈能力,3,. 而对热休克蛋白70(heat shock protein, HSP70)融合蛋白在抗原递呈细胞上的递呈过程的研究报道较少. 我们设计了HSP70和具有示踪功能的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的融合蛋白HSP70?EGFP，以探讨DCs内化外源性抗原的方式及不同抗原对DCs的活化效果. 1和方法 1.1材料 新鲜全血由健康志愿者提供;质粒pIRES2?EGFP(美国Clontech公司);原核表达载体pET28a(+)?HSP70由第四军医大学病教研室陈广生博士构建;Ni?NTA His.Bind 树脂(美国Novagen公司产品);rhIL?4，rhIL?2(美国R&D生物公司产品);rhGM?CSF由厦门特宝生物工程公司生产;鼠抗人McAbCD1a，CD80和HLA?DR(美国Sigma公司);羊抗鼠IgG?FITC(武汉生物制品公司);人IL?12 Eli?spot系统(法国DIACLONE公司产品);蛋白 HSP70，MAGE1由第四军医大学病理学教研室惠赠;蛋白EGFP的制备按,3,的方法进行. 1.2方法 1.2.1载体的构建 根据EGFP的基因序列，设计引物，用PCR技术从质粒pIRES2?EGFP中扩增EGFP，上游引物为:5′? CCT GAG CTC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG ?3′， 下游引物为:5′? GCG CTC GAG TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT G?3′，分别 包含了SacI和XhoI的内切酶位点(划线部分). 将EGFP基因克隆到pET28a(+)?HSP70原核表达载体上，与HSP70基因融合，转化E.coli DH5α宿主菌，挑取单克隆菌落，提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物进行10 g/L琼脂糖 凝胶电泳. 1.2.2融合蛋白的表达 将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)，用卡那霉素筛选. 培养含有HSP70?EGFP融合基因的BL21大肠杆菌至对数生长期，加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L，4? 诱导表达12~18 h，收菌. SDS?PAGE融合蛋白的表达. 1.2.3HSP70EGFP融合蛋白的分离与纯化 用50 mmol/L磷酸缓冲液+300 mmol/L NaCl， pH 8.0，充分悬浮细菌，冰浴、超声裂解细菌，离心收集上清变性蛋白. 用22 μm滤膜过滤，Ni离子亲和层析柱层析，250 mmol/L咪唑溶液洗脱，收集洗脱峰. SDS?PAGE分析纯化蛋白. 1.2.4树突状细胞的培养 采用文献,4,的方法分离、诱导及分化外周血中的DCs. 在培养的不同阶段收集悬浮细胞，在光镜下观察细胞的形态，用流式细胞仪检测DCs表型. 1.2.5内化实验 实验分为三组，每组含1×106 DCs，孵育蛋白浓度为100 mg /L. 将1，2组DCs分别与EGFP和HSP70?EGFP于4?孵育30 min;第3组DCs先与HSP70在4?C孵育30 min，洗涤3遍，再将DCs与HSP70?EGFP在4?孵育30 min. 之后将三组DCs转至37?，50 mL/L CO2孵箱内，分别培养0.5，1，2和24 h. 流式细胞仪检测胞内含EGFP的DCs数量，阴性对照组除孵育蛋白为MAGE1外，其余各项同1，2组. 1.2.6Eli?spot 检测 用人IL12 Eli?spot系统(Human IL?12 Eli?spot system)检测活化成熟后释放IL?12的DCs细胞频数. 依刺激物不同，分别为:1 mg/L LPS;95? 灭活10 min的1 mg/L LPS;10 mg/L HSP70?EGFP;10 mg/L EGFP;无刺激物. 实验分5组进行，每组设3个复孔，加入培养5,6 d的1×105 DCs作为效应细胞. Eli?spot检测按照试剂盒使用说明进行. 统计学处理: 用SPSS 12.0 统计学软件进行方差分析，实验数据以x?s表示，P<0.05认为差异有统计学意义. 2结果 2.1重组质粒pET28a(+)HSP70EGFP鉴定 EGFP的PCR产物经10 g/L琼脂糖电泳，在740 bp处可见单一条带，与预期结果大小一致(图1). 重组质粒pET28a(+)?HSP70?EGFP用BamHI, SacI和XhoI酶切后，经10 g/L琼脂糖电泳，可见被切下约740 bp，1990 bp和2730 bp左右的单一条带，分别与EGFP, HSP70和HSP70?EGFP的编码基因大小一致(图2). 2.2融合蛋白的表达、纯化 转化后BL21细菌经0.1 mmol/L IPTG 4?诱导12~18 h，其全菌蛋白SDS?PAGE电泳结果见图3. 薄层扫描分析结果显示，目的蛋白表达量在35,以上. 镍离子亲和层析表明，用250 mmol/L咪唑溶液可以洗脱出融合蛋白HSP70?EGFP，目标蛋白纯度达到90.6,，纯化后的融合蛋白HSP70?EGFP溶液在室光下呈黄色，经紫外线灯照射时发出鲜绿的颜色. 2.3外周血来源DCs的培养及鉴定 经细胞因子诱导后，于第2，5和8 日采用流式细胞仪检测培养细胞表型， 1a分别为: 0.18，0.25和0.41;CD80分别为: 0.28，0.67其结果显示，CD 和0.75;HLA?DR分别为: 0.26，0.73和0.75. 8 d时，在倒置显微镜下观察可见胞体增大，形状不规则，突起明显. 2.4DCs内化蛋白的观察 孵育0.5 h后，流式细胞仪检测结果显示，第1，2和3组胞内具 在37? 荧光的DCs分别占总DCs数量的63.9%，4.2%和3.5%. 在孵育1，2和24 h后，第1，2和3组中胞内具荧光的DCs占总DCs数量的百分率分别为: 85.3%，83.2%，80.7%; 90.3%，91.4%，88.8%和87.4%，86.1%，89.2%，组内及各组间平均值的差异无统计学意义(P>0.05). 2.5IL12酶联免疫斑点实验结果 HSP70?EGFP刺激物组平均斑点数为134.09?7.05/1×105 DCs细胞，明显 高于灭活LPS刺激物组，平均斑点数为:(33.78?1.40/1×105 DCs细胞)和 EGFP刺激物组，平均斑点数为:(23.13?0.31/1×105 DCs细胞)(P<0.01)，与LPS刺激物组，平均斑点数为:(146.36?6.91/1×105 DCs细胞)比较，差异无统计学意义(P>0.05). 3讨论 HSP70与不同抗原的融合蛋白作为肿瘤疫苗，具有明显的抗肿瘤免疫作用,5-8,. 其原因在于HSP70具有免疫载体分子的作用，能增强与之结合抗原的抗原性，并发现HSP70融合蛋白可诱导机体产生特异性CTL反应的部分主要为其N端约360 aa部分,9,. 本将EGFP连接于HSP70 C端，获得重组蛋白HSP70?EGFP，研究DCs对HSP70融合蛋白的内化作用. HSP70?EGFP的获得，不仅保持了HSP70诱导细胞免疫活性的功能，还提供了可发出绿色荧光的EGFP，免去再标记HSP70融合蛋白的过程，为示踪DCs对HSP70融合蛋白的内化作用提供了新手段. 有研究发现结构型Hsc70和葡萄糖调节蛋白94(glucose?regulated protein, GRP94/gp96)结合APCs(B细胞、巨噬细胞和DCs)通过特异性膜受体被内化,10-12,. Basu等,13,的研究发现，gp96?肽复合物经APC摄取后由MHC?I分子递呈给免疫系统，这一过程是由受体CD91所介导的. α2巨球蛋白受体又称为低密度脂蛋白相关蛋白，被确认为gp96和hsc70在鼠APCs的受体. gp96?肽复合物被摄取后的加工过程需要在蛋白酶体和抗原加工相关转运蛋白的协助下，通过经典的内源性抗原递呈途经与APC表面MHC?I分子结合. 本研究发现，DCs表面存在HSP70受体，介导了HSP70?EGFP的内化，并且该受体可被过量HSP70所饱和，受体介导的内化作用同时被抑制. 随孵育时间的延续，三组实验中胞内具荧光的DCs均占总DCs数量的绝大多数，表明随着时间的推移，除受体介导的内化作用外，DCs对可溶性蛋白的吞饮作用导致了HSP70?EGFP及EGFP的内化. IL?12 Eli?spot检测结 果表明，HSP70?EGFP可以诱导DCs分泌细胞因子IL?12，而IL?12有强烈的抗 病毒和抗肿瘤效应，被誉为免疫系统行使抗病毒、抗肿瘤的核心调控因子，也 被誉为机体天然免疫系统的关键蛋白质，因而HSP70?EGFP具有促进机体的抗病 毒、抗肿瘤免疫效应的作用. 至于HSP70?EGFP进入胞质后的加工途径怎样，如 何转运并释放EGFP，是否增强抗原递呈的效果，还有待于进一步研究. 【】 ,1,Wallin RP, Lundqvist A, More SH, et al. Heat shock proteins as activators of the innate immune system,J,. Trends Immunol, 2002, 23(3): l30-135. ,2,Kol A, Lichtman AH, Finberg RW, et al. Cutting edge: heat shock protein(HSP)60 activates the innate immune response: CD14 is an essential receptor for HSP60 ,. J Immunol, 2000,164(1):13-17. activation of mononuclear cells,J ,3,曲萍，隋延仿，叶菁，等. 增强型绿色荧光蛋白的基因克隆、表达及蛋白 纯化,J,. 陕西医学杂志, 2006, 35(10): 1235-1237. ,4,张建芳，于 文彬，徐修礼，等. 树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用,J,. 第四军医大学学报, 2001, 22(19): 1777-1780. ,5,Li Z, Qiao Y, Liu B, et al. Combination of imatinib mesylate with autologous leukocyte?derived heat shock protein and chronic myelogenous leukemia,J,. Clin Cancer Res, 11(12): 4460-4468. ,6,Jing Y, Chen GS, Song HP, et al. Heat shock protein 70 / MAGE?1 tumor vaccine can enhance the potency of MAGE?1?unspecific cellular immune responses in vivo,J,. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53(9): 825-834. ,7, Honghai Z, Weirong W, Qiujun L, et al. Fusion protein of ATPase domain of Hsc70 with TRP2 acting as a tumor vaccine against B16 melanoma,J,. Immunol Lett, 2006, 105(2): 167-173. ,8,赵子粼， 鄢莉，崔建东，等. 热休克蛋白,抗原肽复合物疫苗预防肝癌术后复发32例 ,J,.第四军医大学学报，2005,26(22):2076-2078. ,9,Huang Q, Richmond JF, Suzue K, et al. In vivo cytotoxic T lymphocyte elicitation by mycobacterial heat shock protein 70 fusion proteins maps to a discrete domain and is CD4(+) T cell independent. ,J,. J Exp Med, 2000, 191(2): 403-408. ,10,Singh?Jasuja H, Toes RE, Spee P, et al. Cross?presentation of gycoprotein 96?associated antigens on major histocompatibility complex class I molecules requires receptor?mediated endocytosis,J,. J Exp Med, 2000, 191(11): l965-1974. ,11,Castellino F, Boucher PE, Eichelberg K, et al. Receptor?mediated uptake of antigen/heat shock protein complexes results in major histocompatibility complex class I antigen presentation via two distinct processing pathways,J,. J Exp Med, 2000, 191(11):1957-1964. ,12,Arnold?Schild D, Hanau D, Spehner D, et al. Cutting edge: Receptor?mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen?presenting cells,J,. J Immunol, 1999, 162(7): 3757-3760. ,13,Basu S, Binder RJ, Ramalingam T, et al. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin,J,. Immunity, 2001,14(3):303-313.