【doc】牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究

【doc】牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究 牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究 《黑龙江畜牧兽医>>2OO4年第5期实验研究?9? 牛有腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究 肖正中,赖松家.,邬苏晓 (1.广东韶关学院农业系,广东韶关512005;2.四川农业大学动物科技学院,四川雅安625014) 中图分类号:$823文献标识码:A文章编号:1004—7034(2004)05—0009—02 关键词:牛;有腔卵泡;卵母细胞;体外成熟 摘要:试验从屠宰场收集了48头青年黄牛,34头青年水牛的卵巢共164个.共回收可用卵母细胞864枚.水牛平均每 个卵巢可回收3.22枚可用卵母细胞,相当于黄牛(6.72枚)的一半试验结果表明:水牛卵巢生长卵泡少,卵母细胞产 量少,质量差;3种采集黄牛卵泡卵母细胞的方法,用抽吸加切割法平均从每个卵巢回收的可用卵数(7.71枚)都极显着 高于抽吸法(6.19枚)和切割法(6.44枚)(P<O.01).但是该法手续繁杂.适于一次且只能收集少量卵巢时使用;在黄牛 和水牛卵母细胞成熟培养液中用0.3PVP代替1OFBS,牛卵母细胞的体外成熟率无显着差异(P>O.05). 自从Brackett等[1]获得世界上第1头试管牛犊,随后世界 首例完全体外受精化孪生试管牛犊降生0].目前,试管牛生产 技术已逐步由研究向生产应用阶段发展.在牛体外胚胎生产 中,由于血清价格非常昂贵,造成体外胚胎生产的成本较高.虽 然血清对牛卵母细胞体外成熟有促进作用,但血清成分十分复 杂,血清中的激素,生长因子,细胞因子,维生素和其他物质差异 也较大,血清中还含有许多至今仍不明确的物质,造成胚胎生产 的不稳定.近年来,研究者对牛卵母细胞体外成熟培养和对早 期胚胎体外培养的注意力转向了无血清培养. 1与方法 1.1卵巢的收集 试验用的母牛卵巢从附近的屠宰场收集.牛屠宰后在 30min内摘下卵巢,放人盛有灭菌生理盐水的广口保温 瓶,在1,3h内运回实验室.然后,在超净工作台上将卵巢放 到盛有温生理盐水的小盘内,用小剪刀剪去卵巢周围的韧带及 残余的输卵管伞.再用加温的灭菌生理盐水洗卵巢2次.用无 菌滤纸吸干. 1.2采卵 1.2.1抽吸法用1OmL灭菌注射器配以尖部磨钝的12号 针头,选择直径为2,10mm的卵泡,轻轻吸取卵母细胞及卵 泡液.注入离心管中.放人CO.培养箱中静置15min后取出. 弃掉上清液.将沉淀物转入灭菌平皿中,以备检卵. 1.2.2切割法用薄刀片切割卵巢表面,然后用洗卵液冲洗 卵泡腔,以回收卵丘卵母细胞复合体(COCs). 1.2.3抽吸加切割法先用注射器抽吸卵巢表面明显的卵泡 后.再用薄刀片切割卵巢表面.冲洗卵泡腔.回收卵母细胞. 1.3卵母细胞的体外成熟(IVM) 用灭菌塑料培养平板制作200L的成熟培养液滴.每个液 滴表面用少量轻质灭菌石蜡油覆盖,放人CO2培养箱中平衡至 少2h.在实体显微镜下查找卵丘卵母细胞复合体(Cocs),依 据卵母细胞的质量进行分类:A级——卵丘细胞层完整而致密 的卵母细胞;B级——卵丘细胞层部分脱落的卯母细胞;C 级——卵丘细胞较少或卵丘细胞扩散的卵母细胞;D级——卵 收稿日期:2003—12—01 基金项目:国家”十五”攻关项目(2002BA514A23) 作者简介:肖正中(1972一),男,河南潢川人,助教,硕士. 丘细胞全部脱落的裸卵.将平皿中A级,B级卵母细胞(.--I用 卵)用新鲜洗卵液浸洗1,2次,然后转入已平衡至少2h的成 熟培养液滴中.放人培养箱中培养(培养条件38.5,39.O?,5 C()z,95空气和最大饱和湿度).培养22,24h后.在倒置显 微镜下观察.将卵母细胞有第一极体释放,保持卵丘细胞问分泌 黏稠的基质,细胞层显着膨大,细胞以卵子为中心,大体呈放射 状向四周扩散者判定为已成熟,记录成熟的卵母细胞数. 1.4试验设计 试验1:采用单因子试验设计,比较黄牛和水牛卵巢回收 卵母细胞的效果. 试验2:采用单因子试验设计.比较抽吸法,切割法和抽吸 加切割法3种采卵方法的优劣,探讨哪种方法即操作方便又能 在最短时间内获得最多的可用卵母细胞. 试验3:采用单因子试验设计,在成熟培养液中用0.3 PVP代替1OFBS.研究用PVP代替FBS的可行性. 1.5统计分析 用SPSS10.0软件对试验结果进行丁检验和方差分析, 以检验各试验组问的差异显着性. 2结果 2.1卵母细胞的采集(结果见表1) 表12种牛卵巢回收卵母细胞的结果比较 种类头数触臌肝V / M舭率 黄牛4896685(7.14=t=1,21)645(6.72=t=1,03’)94,59=t=5,90 水牛3468252(3.71=t=0.69)219(3.22~O.63)87,5O~O.11 注:同列肩注字母不同表示差异极显着(P<O.01). 从表1可以看出.从单个黄牛卵巢回收的卵母细胞数(平 均为7.14枚)极显着(P<0.01)多于从单个水牛卵巢回收的 卵母细胞数(平均为3.71枚);回收的可用于IVM的卵母细胞 数(平均为6.72枚)也极显着(P<0.01)多于从单个水牛卵巢 回收的可用于IVM的卵母细胞数(平均为3.22枚). 2.2卵母细胞分离方法比较(结果见表2) 表2显示,用抽吸加切割法从单个卵巢表面回收的卵母细 胞数(平均为8.39枚)极显着(P<O.01)多于用抽吸法和切割法 回收到的卵母细胞数(平均分别为6.31和6.97枚).且用切割 法从单个卵巢回收的卵母细胞数也显着(P<0.05)多于用抽吸 ?10?实验研究 HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicineNO.5,2004 法回收到的卵母细胞数;用抽吸加切割法从单个卵巢表面回收 的可用于IVM的卵母细胞数(平均为7.71枚)也极显着(P< 0.01)多于用抽吸法和切割法回收到的卵母细胞数(平均分 别为6.19枚和6.44枚),抽吸法和切割法之间差异却不显着 (P>0.05). 表23种收集卵母细胞方法的效果比较 注:同列肩标小写字母不同者表示差异显着(P<O.05);同列中肩 标大写字母不同者表示差异极显着(P<O.O1). 2.3PVP和FBS对牛卵母细胞IVM效果的影响 (结果见表3) 表3PVP和FBS对黄牛和水牛卵母细胞体外成熟的影响 种类不同处理培养卵数IVM /枚成熟数/枚成熟率 注:成熟率一排出第一极体卵数(成熟卵数)/培养卵数×100. 从表3可以看出,黄牛卵母细胞IVM后.添加1OFBS 组与添加0.3PVP组卵母细胞的成熟率(分别为8O.48和 77.71)差异不显着(P>0.05);水牛的两组间卵母细胞的成 熟率(分别为64.86和61.37%)差异也不显着(P>O.05). 3讨论 试验结果表明,黄牛卵巢发育良好.卵母细胞产量多.卵丘 卵母细胞完整.质量较好,而水牛卵巢卵母细胞产量少,C级, D级卵母细胞较多,质量差.同谭世俭等?报道的结果一致. 并且有些水牛卵巢既无卵泡也无黄体.呈静止状态,这是制约 水牛体外受精研究进展的一个重要因素. 研究比较3种收集卵母细胞的方法,作者认为,该3种方 法都可在生产中根据实际情况选择使用.抽吸法操作方法迅 速,一直是应用于牛,绵羊,山羊的一种主要的获取卵母细胞的 技术.然而,由于抽吸法使用针头的原因,易造成卵母细胞丢 失和卵丘细胞损坏],出现不完整的COCs或裸卵.作者认为 这种缺点在试验过程中是可以部分克服的,操作时要小心谨 慎.切忌不要抽吸过猛.这样可避免出现不完整的COCs或裸 卵.切割法也是操作比较方便的一种采卵方法,能在较短的时 间内采集较多的卵母细胞.但回收卵中无用卵的比例增加.由 于抽吸法和切割法操作简便,迅速,在卵巢来源充足的情况下. 应用这两种方法采卵效果最佳.而且卵巢和卵母细胞在外界暴 露的时间短.不会由于该因素而影响以后的培养效果.所以, 作者认为抽吸法和切割法是目前常用的两种采集卵母细胞的 方法.抽吸加切割法虽然能采集最多的可用卵母细胞.但该法 操作烦琐,费时,卵巢和卵母细胞在外界暴露的时间长,如环境 条件达不到要求.必然会影响IVM和IVF.所以.作者认为第 3种方法适于在适宜的环境条件下(如无菌.室温达25?以上 等).一次只能收集少量卵巢时使用.即在卵巢来源紧张的情况 下采用此法比较适宜.当然.对于技术操作熟练的人员可根据 具体条件选择合适的采卵方法. 从表3结果可以看出.不管是对黄牛或是对水牛的试验 中.在成熟培养液中用0.3PVP代替1OFBS对卵母细胞 的成熟率无显着影响,从而说明用0.3PVP代替血清是可行 的.这同Saeki等报道的结果一致.在牛卵母细胞的体外成 熟研究中,血清应用很多.价格昂贵.应用无血清培养系统可以 准确调配培养基的各个组分,便于精确研究卵母细胞的调节机 制,而且还可以在体外胚胎生产上大量节约成本.所以无血清 培养是今后牛IVF发展的主要方向之一. 参考文献: [1]BrackettBG,BousquetD,BioceML,eta1.Normaldevelopment followinginvitrofertilizationincowEJ].BiolReprod,1982,27: 147—158. 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Studyoninvitromaturationofbovineoocytesderivedfromantralfollicles XIAOZheng—zhong,LAISong—jia,WUSu—xiao (1.DepartmentofAgriculturalEngineering,ShaoguanCollege,Guangzhou512005,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China) Keyword:bovine;antralfollicle;oocyte;invitromaturation Abstract:Thisexperimentcollected164ovariesfrom48yellowcattlesand34buffalosattheslaughterhouse,andacquired864oocytesused.Aspi— rationof68buffaloovarieshadprovidedanaverageof3.22utilizableoocytesperovary,whichwasabout1/2obtainedfromyellowCOWS(6.72). Theresultsindicatethatgrowingfolliclesofbuffaloovariesareless,theyieldofoocytesislessandquantityisworsethanthatofyellowcow.This researchcomparedthemethodsofthreekindsofovumcollection.Recoveryoocytesusedwiththemethodofaspirationandincisiontogetherwerean averageof7.71perovary,significantlyhigherthanthoseoocyteswiththemethodofaspirationandmethodofincision(6.19and6.44,respectively. P<O.01),butitsprocedureiscomplicated,itissuitableforcollectingflfewovariesonce~with0.3PVPsubstitutingforlO%FBSinculture mediaforIVMoffollicularoocytes,thematurationrateofcattlehadnosignificantdifferencebetweenthem(P>0.05).(009)