人兽共患寄生线虫病及病原线虫检测翻译

人兽共患寄生线虫病及病原线虫检测翻译 一、用FastDNA? kit提取寄生虫DNA 注释1：把粪便样本分成若干份，储存于－80（不加防腐剂），也可以把样品用重铬酸钾（5% w/v）以1:1 稀释，或用无水乙醇１：１稀释后在４度下保存。 二、需要的仪器设备： FastPrep FP120 Disrupter 或其他类似产品 三、试剂列表： １. 磷酸缓冲液 0.01M, pH 7.2 ２. EDTA 0.01M, pH 7.2 ３. 从FastDNA? kit中选择试剂： CLS-VF (Cell Lysis/DNA Solubilizing Solution for Vegetation, Cat. No. 6540-402) PPS (蛋白质沉淀液, Cat. No. 6540-403) Lysing Matrix Multi Mix E (Cat. No. 6914-050/100) Binding Matrix (Cat. No. 6540-408) SEWS-M (Salt/Ethanol Wash Solution) (Cat. No. 6540-405) DES (DNA Elution Solution) (Cat. No. 6540-406) ４.pvp (聚乙烯基吡咯烷酮) QIAquick PCR purification kit 四、 步骤： 1. 选择一个干净的1.5ml的离心管 2. 每个离心管取300-500ul粪便样品，14000g,4?，5min 3. 离心后用1ml PBS-EDTA悬浮沉淀，同样条件重复两次以上。 4. 最后一次离心后用PBS-EDTA重悬沉淀，获得大约300ul样品悬液。 5. 向管中加入300ul粪便样品悬浊液，400ul CLS-VF, 200 µl PPS, PVP使最后浓度达到0.1%-1%。 6. 用涡旋震荡器混合各组分，盖紧管盖，放入fp120破碎仪中。 7. 在FP120中以5.0-5.5速度运行10s 8. 在室温下离心14000g,5min 9. 转移600ul上清于另一离心管中。 10. 颠倒管子，逐渐加入600 µl of Binding Matrix and mix。 11. 室温下孵育5min. 12. 室温下14000g，离心1min.弃上清。 13. 加500 µl Sews-M重悬沉淀，用移液枪吹打使沉淀彻底悬浮。 14. 室温下14000g，离心1min.弃上清。 15. 离心10s,移去残留matrix表面残留液体。 16. 用100 µl DES重悬matrix，用移液枪吹打使沉淀彻底悬浮。 17. 在室温下孵育2-3min. 18. 14000g离心2min. 19. 将上清转移至干净的标签的离心管，在4?下保存DNA。 20. 可选择性步骤(对食物样品是必须的)用QIAquick spin column纯化DNA 21. 纯化的DNA贮存于4?。 人肠道内原生动物主要通过显微镜检测寄生虫在粪渣中，十二直肠，或小肠的活组织中发育 的各个时期来诊断。粪检法非常繁琐，并且要求显微镜操作员有熟练的操作技巧。而抗原检 测已经发展为直接荧光抗体（DFA），免疫酶测定（EIA）法和。抗原检测法快捷方便，并 且不需要有经验和技巧的形态学者来完成。在抗原技术的发展中更多的工作已经被完成。从 而出现更多的商业试剂用来检测肠道寄生虫，如隐孢子，溶组织阿米巴，蓝氏贾第鞭毛虫， 阴道毛滴虫。除此之外，用于血液或血清的抗原诊断测试可用来检测疟原虫和班氏丝虫。 新鲜的或储存的粪便样品适用大多数试剂盒进行抗原检测。 EIA试剂盒适用于检测排泄物的抗原来诊断肠道内阿米巴，致病性的溶组织阿米巴和非致病 性的类痢疾阿米巴两者形态相似 毛滴虫阴道炎 Cryptosporidium sp., 隐孢子虫 Cyclospora cayetanensis圆孢子虫C. parvum or C. cayetanensis Entamoeba histolytica 溶组织阿米巴 E. dispar类痢疾阿米巴 microsporidia spp微孢子虫microsporidia, Acanthamoeba spp., Pneumocystis jiroveci, and Dirofilaria spp. 微孢子虫棘阿米巴耶氏肺孢子虫犬心丝虫 Giardia lamblia蓝氏贾第虫 coccidian species 鸡球虫 Cryptosporidium隐孢子虫 圆孢子虫隐孢子虫孢属球虫 Isospora孢属球虫 在寄生虫疾病的诊断中，可以用PCR，RFLP，DNA测序等分子生物学技术分析。 粪便样品（不加防腐剂）在4?C 或冷冻运输。或者可以与2.5%重铬酸钾（1：1）或无水乙醇（1：1）混合后冷冻运输。在做PCR 之前，粪便样品须先进行涂片染色。其中三色染色 涂片用于蓝氏贾第虫、溶组织阿米巴类、痢疾阿米巴。抗酸染色涂片用于小球隐孢子虫和圆孢 子虫。所有的染色涂片都应首先检查，如果不能鉴定出寄生虫种类，需要进一步用PCR检测。 DNA PCR CDC检测隐孢子虫，圆孢子虫，溶组织阿米巴和类痢疾阿米巴主要用普通PCR和实时PCR（real-time PCR）。微孢子虫和蓝氏贾第虫主要用普通PCR来检测。提取粪渣中的DNA做为PCR模板，PCR产物用2%琼脂糖电泳检测后分析结果，确定寄生虫的种类。 这种主要用于鉴定隐孢子虫，球虫，圆孢子的卵囊。 新鲜的或福尔马林保存的粪便样品的沉淀物。 临床的十二指肠液，胆汁，肺部的样品包括唾液，痰，支气管沉积物，活组织切片等。 1.无水甲醇。 2.酸醇。 10 ml 硫酸 + 90 ml 无水乙醇。室温下储存. 3. Kinyoun的石炭酸品红。 4.3% 孔雀石绿。称取3g孔雀石绿溶解于100ml超纯水中。室温下保存。 1.在干净的玻片上滴1-2滴待测样品，涂片后于60度烘干，涂片不要太厚。 2.100%甲醇固定30s. 3.Kinyoun石炭酸品红染色1min,蒸馏水洗涤。 4.用酸乙醇脱色2min.蒸馏水洗涤。 5. 3%孔雀石绿复染2min, 蒸馏水洗涤. 6.60度烘干玻片。盖上盖玻片。 7.用40倍或更高倍镜检测，若确定内部形态结构，可选择100×油镜。 用从10%的福尔马林中保存的微孢子虫样品做为对照，按照每步的染色步骤操作，结果应为微 孢子虫被染色为桃红色，而背景色应该为均一的绿色。 : 1. 100% 2. 铬变素 2R 6.00 g Fast green（固绿） 0.15 g 磷钨酸 0.70 g 冰乙酸 3.00 ml 混合各组分，静止 30 minutes后加100 ml 蒸馏水， 每月用时准备新鲜的. 3. : 90% 乙醇 995.5 ml 冰乙酸 4.5 ml 4. 95% 5. 100% 6. . 1. 1.0%甲醇固定标本r5 minutes 2. 放入 染色 90 minutes. 3. 在酸乙醇中褪色 1 to 3 seconds. 4. 浸入95% 乙醇中清洗。 5. 100% ethanol 换两次，每次3 minutes 。 6. 二甲苯中换两次，每次10 minutes。 7. 待干后用树胶或其他封片，在100× 油镜下检测涂片。 这是 Specimen: 准备薄涂片 ，材料为尿液, 痰, 唾液或其他，空气中干燥。 对福尔马林固定的石蜡组织切片可在一系列的乙醇中脱蜡，在 1. 革兰氏染色试剂盒。 2. 染色: 铬变素 2R 1.0 g Fast green（固绿） 0.15 g 磷钨酸 0.25 g 冰乙酸 3.0 ml 混合各组分，静止 30 minutes后加100 ml 蒸馏水， 每月用时准备新鲜的. 3. Acid alcohol: 90% 乙醇 995.5 ml 冰醋酸 4.5 ml 4. 95% 5. 100% 1. 1605min 2. Perform Gram’s stain omitting the safranin step as follows: 将涂片放入龙胆紫溶液中30s,对于组织涂片延长至1min。 a. b. 用水洗去多余的染液。 c.将玻片浸入革兰氏碘液中保持30s.对于组织涂片可延长至1min. d. 用脱色液逐渐洗去革兰氏碘液。拿住盖玻片的一角，用脱色液逐滴滴入，直至 无色。此步骤需特别小心以便使孢子得到正确的染色。 e. 用冷水逐渐清洗多余的脱色液。 3. Perform chromotrope stain as follows: a. 将玻片放入预热的(50? to 55?C)染液中至少1min 。组织涂片可延长 30s 。 b. 用90%的酸醇清洗1-3s此步骤需特别小心以便使孢子得到正确的染色。 c.100%乙醇清洗两次，每次30s(用两个容器分开清洗)。 d. 干燥后用 按照说明用Cytoseal60 (Stephens Scientific)或其他的封片。对 组织涂片，在封片之前，用50%乙基乙醇或50%二甲苯清洗15s。 Modified Safranin Technique (Hot Method) 适用于 圆孢子虫隐孢子虫孢属球虫 一般用(cold)检测圆孢子虫的卵囊。但是使用那种染色技术，卵囊有时不能染上 色，有时能全染上色，很容易造成错辩。而 : 取新鲜的或福尔马林保存的粪便浓缩收集。其他类型的临床样品如十二指肠液也可被染色. 试剂：Reagents: There are three steps to this procedure, requiring the following solutions: 1. 酸乙醇 (3%HCL/Methanol): 缓慢向97ml的无水乙醇中加入3ml的盐酸。将试剂 储存在密闭的容器内，室温保存。 2. 番红染液。 (Available in Gram stain kits) 3. 3% 孔雀石绿。称取3g孔雀石绿溶解于100ml超纯水中。室温下保存。 Procedure: 1. 制作薄的玻璃涂片，干燥。 2. 酸醇中固定5min. 3. 用蒸馏水清洗。 4. 放入沸腾的染色液中1min. 5. 用蒸馏水清洗. 6. 用孔雀石绿复染1min. 7. 用蒸馏水清洗. 8. Dry the slide and mount with a coverslip using desired mounting media. Quality Control: A control slide of Cyclospora spp. from a 10% formalin preserved specimen should be included with each staining run. Cyclospora spp. oocysts will stain reddish-orange. The background should stain uniformly green. Quality Control: A control slide of Cyclospora spp. from a 10% formalin preserved specimen should be included with each staining run. Cyclospora spp. oocysts will stain reddish-orange. The background should stain uniformly green. Trichrome Staining Procedure It is generally recognized that stained fecal films are the single most productive means of stool examination for intestinal protozoa. The permanent stained smear facilitates detection and identification of cysts and trophozoites and affords a permanent record of the protozoa encountered. Small protozoa, missed by wet mount examinations (of either unconcentrated or concentrated samples) are often seen on the stained smear. The Wheatley Trichrome technique for fecal specimens is a modification of Gomori’s original staining procedure for tissue. It is a rapid, simple procedure, which produces uniformly well-stained smears of the intestinal protozoa, human cells, yeast, and artifact material. 新鲜的粪便或固定在聚乙烯醇中的粪便涂到载玻片上，空气中自然凉干或60?C 加热。保存在 乙酸钠-乙酸-福尔马林溶液中的样品也可以。 The specimens usually consist of fresh stool or stool fixed in polyvinyl alcohol (PVA) smeared on microscope slides and allowed to air dry or dry on a slide warmer at. Stool preserved in sodium acetate-acetic acid-formalin (SAF) or some of the one-vial fixatives can also be used. : There are seven steps to this procedure, requiring the following solutions: 1. 70% 乙醇加碘 将碘结晶物加入70%的乙醇直至溶液变黑色。使用时用70%乙醇稀 释直至溶液出现略带红褐色或农茶的颜色。 2. 70%乙醇(两次)。 3. 三色染色。 4. 90% 酸乙醇。 90% 乙醇 99.5 ml 冰醋酸 0.5 ml 5. 95% 乙醇 6. 100% 乙醇 (twice) 7. 二甲苯或其他二甲苯替代物。 (twice) : 1. 对聚乙烯醇涂片，放在70%乙醇加碘液中10min.对于其他定影液，按照厂商说明操作。 不包含汞的氯化物的保存样品可不加碘。Place slide in 70% Ethanol for 5 minutes. 2. 再次放入70% 乙醇中r3 minutes 3. 放入三色染液中10 minutes. 4. 在加有乙酸的90%乙醇的中褪色1 to 3 seconds. 5. 用 100%乙醇清洗数次。 6. 100%乙醇两次, 每次3min. 7. 二甲苯中两次，每次10min. 8. 用树胶或其他封片。 9. 在100倍油镜下检查涂片。microscopically utilizing the 100× objective. Examine at least 200 to 300 oil immersion fields. Quality Control: A control slide of a known protozoan such as Giardia spp. from a PVA preserved specimen should be included with each staining run. When the smear is thoroughly fixed and the stain is performed correctly, the cytoplasm of protozoan trophozoites will have a blue green color sometimes with a tinge of purple. Cysts tend to be slightly more purple. Nuclei and inclusions (chromatoid bodies, red blood cells, bacteria) and Charcot-Leyden crystals have a red color sometimes tinged with purple. Glycogen is dissolved by the solvents and appears as a clear area in the organism. The background material usually stains green providing a nice color contrast with the protozoa. calcofluor white萤光染色步骤 这种化学荧光技术适用于微孢子虫，棘阿米巴，， 耶氏肺孢子虫和犬心丝虫。 化学荧光试 剂, 如Calcofluor, Fungi-Fluor or Uvitex 2B, 这些都是光学照明试剂，都可以作为快速廉价的筛选试剂。这些试剂非常灵敏但是不够特异。除寄生虫外很多生物也可能产生荧光。这种测 试方法可以作为一种快速的筛选工具，但是不能用于物种的鉴定。 样品： 在载玻上加入10µl福尔马林处理的新鲜的或保存的样品，制成薄的涂片。样品包括粪便，尿液， 或其他标本。60?C烘干。（大概5-10min）. 需要的溶液 There are two steps to this procedure 1. 无水甲醇。 2. 0.01% Calcofluor white试剂: 准备 0.01% 溶液用0.1M Tris-buffered。pH 7.2 1. 制作薄的玻璃涂片，样品可以是粪便或其他标本。 2. 甲醇中固定30min。 3. 用 0.01% calcofluor white 试剂染色 1 minute. 4. 用蒸馏水清洗后干燥。 5. 用1#盖玻片封片。 6. 在带有蓝光滤片的紫外荧光显微镜下， 400nm或更少的波长下检测样品。 7. 筛选微孢子, 用50× 或100×油镜 检测涂片。examine the smear with a objective. 筛选微孢子荧光在黑色背景下将发出显亮的蓝白色. 每一步的染色都要有对照。对照可选择保存在10% 福尔马林溶液中的微孢子样品或其他粪 便。 样品处理 8.