猪细小病毒疫苗研究与发展概况

猪细小病毒疫苗研究与发展概况 一猪细小病毒病简介 猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)感染而引起的胚胎感染及死亡，而母猪不现明显症状的繁殖障碍性疾病。本病广泛分布于世界各地，给养猪业造成巨大的经济损失。引起该病的猪细小病毒是Mary和Mahnet于猪瘟病毒的组织培养时发现的。从20世纪60年代中期，分离病毒和逐步明确其致病作用以来，已相继从欧洲、美洲和亚洲等很多国家分离到该病毒和检测到抗体。我国在20世纪80年代初就有该病的报道，先后从上海、北京、吉林和黑龙江等地分离到该病毒，血清学调查阳性率为80%。猪细小病毒常与其他病原混合感染而致病。邬捷等(1987)报道了我国猪细小病毒与乙型脑炎病毒混合感染。目前又相继有人报道猪细小病毒和圆环病毒、繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)混合感染的情况。正由于猪细小病毒感染面广且感染后造成严重的经济损失，许多学者进行了猪细小病毒病诊断防治的研究。 该病会导致传染性不孕，是一种特别常见而且特别重要的疾病。猪细小病毒是一种非常顽固的病原，在猪的小肠中繁殖，通常不表现临床症状。世界各地均有分布。如果在猪场里取样化验，几乎肯定会检测到这种病原，这种病毒在环境中可存活数月之久，且对大多数消毒剂都具有抵抗力，因此，这种病分布非常广泛，且很难根除。 感染的公猪及母猪是主要的传染源，病毒常由胎盘感染和交配感染传给胎儿，也可通过被污染的食物、环境由呼吸道、消化道传给易感动物，鼠类是重要的传播媒介。PPV主要感染胚胎、仔猪、育肥猪、母猪、公猪等，但只有母猪表现繁殖障碍，其它不同年龄、种类的猪只不表现临床症状。 本病的流行常发生于春秋产仔季节。常见于初产母猪，一般呈地方性流行或散发，一旦PPV传入阴性猪场，于3个月内几乎100,的猪只都会受到感染，在本病发生后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败。母猪怀孕期感染后，其胚胎死亡率可达80,-100,。猪感染细小病毒后1-6天可出现病毒血症，1-2小时后随粪便排出病毒，污染环境，7-9天后出现HI抗体，21天内抗体效价可达1:15000，且能持续数年。 二猪细小病毒病疫苗 近年来，公认使用疫苗是预防猪细小病毒病、提高母猪繁殖率的有效方法，目前已有10多个国家研制出了PPV疫苗。疫苗包括活疫苗与灭活苗。活疫苗产生的抗体滴度高且维持时间长，一般可达数年;而灭活苗的免疫期比较短，一般只有半年。疫苗注射可选在配种前几周进行，以使怀孕母猪于易感期保持坚强的免疫力。为防止母源抗体的干扰可采用两次注射法或通过测定HI滴度以确定免疫时间，抗体滴度大于1:20时，不宜注射，抗体效价高于1:80时，即可抵抗PPV的感染。在生产上为了给母猪提供坚强的免疫力，最好猪每次配种前都进行免疫，可以通过用灭活油乳剂苗两次注射，以避开体内已存在的被动免疫力的干扰。 最早发现和应用于临床的是PPV NADL-2弱毒株，该毒株是将PPV强毒在实验室利用细胞培养连续传代50次以上致弱的。临床试验证实，血清学阴性的妊娠母猪口服或鼻内接种NADL-2株，尽管有病毒血症存在，却不引起胎儿感染;若将该毒株经子宫内接种，可引起胎儿感染，从而导致繁殖障碍。Fujisaki等(1982)将PPV野毒PPV 90HS在猪肾细胞上低温(30 ?)连续传54代，产生HT弱毒株，该毒株接种猪后不产生病毒血症，但能诱导产生高滴度的抗体和较强的免疫力。 在此基础上，Akihiro等(1986)将HT株在猪肾细胞上培养并用紫外线照射后传代，获得了安全性更好的HT-SK-C株，利用该毒株生产的弱毒疫苗已在日本商品化。蒋玉雯等(1992)从广西初产母猪所产死胎脏器中，分离出一株PPV自然弱毒株N株。用该毒株接种PPV HI抗体阴性的4月龄猪和怀孕14,23天的后备母猪,结果不产生病毒血症、同居感染，母猪分娩正常，所产仔猪吃奶前HI抗体阴性。另外，免疫的妊娠母猪，用强毒攻击后49天剖杀，胎儿发育正常，胎心采血HI抗体阴性，取胎儿脏器进行组织培养也未分离到病毒，而对照猪攻毒后产生了病毒血症并导致繁殖障碍。叶向阳等(1996)将通过ST细胞连续传代获得弱毒株，经安全性试验证实该毒株有良好的安全性及其制成的疫苗有良好的免疫性。尽管在临床上已有多株弱毒疫苗应用，但是由于PPV强毒株的大量存在，人们对病毒重组及弱毒返强的担心一直使弱毒苗的应用受到一定限制。 自1976年开始，国外就有关于PPV灭活疫苗的研究报道，并于20世纪80年代在美国、澳大利亚、法国等国家普遍应用。我国潘雪珠等(1987)首先成功研制了PPV灭活疫苗，之后，王润之等(1989)、邬捷等(1989)、韩孝成等(2001)、肖驰等(2000)、吕建强等、叶向阳等(2002)也先后研制出PPV灭活疫苗。徐涤平等(1995)采用幼龄猪增殖PPV，并以蜂胶作为PPV感染症灭活疫苗的佐剂。经一系列试验和实际应用表明，以蜂胶作佐剂制备的PPV灭活疫苗有安全、使用方便、易于保存等优点。能刺激动物产生高滴度抗体和显著的免疫保护效果。 PPV灭活疫苗的研制中，应用的灭活剂有福尔马林、β-丙内酯(β-PL)、AEI(N-乙酰乙烯亚胺)以及BEI(二乙烯亚胺)等。Fujtsakui用福尔马林灭活病毒制成的疫苗，诱导免疫动物产生了较高滴度的抗体，但保护效果不理想;潘雪珠等(1998)比较了福尔马林和AEI的灭活效果，证实AEI优于福尔马林;Joo等(1977)用β-丙内酯灭活的疫苗，可使猪产生的抗体至少持续4个月以上。免疫佐剂是影响PPV灭活疫苗效果的重要因素。Molitor等(1985)比较了13种不同佐剂用于PPV灭活疫苗的效果，结果发现50,氢氧化铝胶、顺丁烯乙酰(EMA)、CP-20961、油水乳剂及DDA作佐剂的疫苗，均诱导猪产生了高滴度的抗体，而用油佐剂、SDS、L-121、氢氧化铝和油乳剂混合物、SDS和氢氧化铝混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前在PPV灭活苗的制备中，经常采用的佐剂是氢氧化铝和油水乳剂。 细小病毒常与伪狂犬病毒(PRV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等引起繁殖障碍的病毒混合感染，研制出灭活多联疫苗可以简化免疫程序，降低临床应激反应，适合规模化养猪业的发展趋势。Ide-s等(1977)首先报道PPV和JEV两种的共同免疫研究，产生的PPV和JEV抗体水平分别与相应单苗的相同。Men-geling等将通过细胞培养增殖的PPV和PRV，制成灭活二联疫苗用于免疫预防试验。对免疫母猪的血清学检测结果证实，经二次免疫后，母猪的PRV中和抗体和PPV HI抗体滴度,与采用单苗免疫的抗体水平相当或稍高。从而说明,PRV-PPV灭活二联疫苗具有良好的免疫保护作用。1986年，邬捷等在国内首次报道用PPV苗和JEV苗共同免疫成功，并获得明显效果，死仔率下降至10.77%,0%。1989年，邬捷等用PPV灭活苗与JEV灭活苗混合或同时免疫后备母猪均取得了满意的效果。姜天童等(1996)利用幼龄胎猪生产PPV,利用小鼠增殖JEV，分别灭活后制成灭活二联疫苗，通过二联苗和单联苗比较试验显示，二联苗与两种单苗免疫猪产生的PPV和JEV抗体水平无显著差异。以上试验均证实两种病毒抗原同时刺激机体没有相互干扰作用。 弱毒疫苗有免疫原性好，免疫后产生抗体快，且免疫维持时间较长等优点， 但由于弱毒疫苗存在返强的危险，使得弱毒苗在应用上存在一些限制。现在常用灭活疫苗，但由于灭活疫苗产生抗体时间较长，产生效果不稳定等原因，所以寻找和发现安全有效的疫苗仍是目前研究的主题。 细小病毒VP2基因是细小病毒主要的衣壳蛋白，并能自我装配成类病毒粒子，可能成为研究的主要方向。Martlnez等(1992)将PPV VP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表达的VP2多肽能自我装配成类病毒粒子。用其接种母猪能诱导产生免疫应答。赵俊龙等进行了有关PPV核酸疫苗的研究，动物试验初步表明，核酸疫苗，能诱导产生较高水平的体液免疫和细胞免疫。 三猪细小病毒疫苗市场分析 我国2006年底出栏商品猪6.2亿头，年底存栏母猪4600万头，1995-2006年间10年时间，存栏母猪增加700万头，年出栏商品猪增2.4亿。按照粗略估算，可能使用猪细小病毒疫苗的规模化猪场中的母猪存栏数为3000万头，考虑到加强免疫、加倍量免疫等因素，我国猪细小病毒疫苗的市场需求量可估算为6-8千万头份以上，销售额应接近1亿元。由于猪细小病毒对种猪的危害很大，现在很多种猪场都要对饲养的种猪和后备种猪进行免疫接种，因此，市场前景非常好。 四目前我国市场上的猪细小病毒疫苗 目前我国已经取得新兽药证书的猪细小病毒疫苗有:上海农科院畜牧兽医研究所研制的猪细小病毒油乳剂灭活疫苗(三类新兽药，(94)新兽药证字第0 4号)，华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司联合研制的猪细小病毒病灭活疫苗(wH一1株)(三类新兽药，(2006)新兽药证字71号)。 在农业部2005年4月统一核发文号之前，各地取得猪细小病毒灭活疫苗的文号有6个(桂生药字(2003)191138;皖生药字(2001)111138;农生药字(2002)561138;黑生药字(2002)071138;辽生药字(2001)051138和晋生药字(2002)031138)，目前在市场上销售猪细小病毒灭活疫苗的厂家主要有:上海佳牧生物制品有限公司(技术依托为上海农业科学院畜牧兽医研究所)、齐鲁动物保健品有限公司、武汉科前动物生物制品有限责任公司、上海海利生物药品有限公司、上海松江生物药品有限公司等。 总体来讲，猪细小病毒病是猪的一种非常重要的传染病，开发猪细小病毒疫苗对任何一家动物生物制品企业来讲都是非常有意义的。