【doc】乳糖酶和酿酒酵母的共固定化及其在乳清发酵中的应用

【doc】乳糖酶和酿酒酵母的共固定化及其在乳清发酵中的应用 乳糖酶和酿酒酵母的共固定化及其在乳清 发酵中的应用 2008NO.3 ? 54?SerialNo.180ChinaBrewingInn.vati.nandKn.w1edgeTrans 乳糖酶和酿酒酵母的共固定化及其在乳清发酵中的应用 李雪雁,弋凌云 (兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050) 摘要:利用凹凸棒土的强吸附作用,首先将乳糖酶吸附于凹凸棒土上,再采用壳聚 糖溶液包埋的制成乳糖酶与酿酒酵母细胞 的共固定化凝胶颗粒.实验结果明,凹凸棒土与壳聚糖的适宜比例为5:l,加酶量 为300u/glEl凸棒土,室温下吸附时间为4h:所制得 的共固定化酶.酵母细胞发酵乳糖的适宜pH值和温度分别为6.0和32"C,乳糖浓 度13%,l5%;在适宜的发酵条件下,以20%的乳清(乳 糖含量为13.42%)为底物发酵30h,酒精浓度达8.3%(v/v),乳糖转化率达93.2%. 关键词:共固定化;乳清;乳糖酶;酿酒酵母;凹凸棒土;壳聚糖 中图分类号:TS252.42文献标识码:A文章编号:0254—5071(2O08)03一O054—04 Co-immobilizationandapplicationoflactaseandSaccharomycescerevisiaeinwheyfermen tation LIXueyan,YILingyun (CollegeofLifeScienceandEngineering,LRP-Z1101lUniversityofScienceandTechnolog y,LRP-Z1101l730050,China) Abstract:ThelactasewasabsorbedonattapulgiteandCO--en~appedwithSaccharomycesce revisiaebychitosansolutiontomakingCO--immobilized gelparticles.TheimmobilizationconditionsandcharacterizationoftheCO-immobilizedlac tase-S.cerevisiaewerestudied.Theresultsshowedthat theratioofattapulgitetochitosanwas5:1,theoptimumloadoflactasewas300u/g(attapulgite )andtheabsorptiontimeis4h.Theoptimaltechnical conditionswereasfollows:temperatureat28~(2,pHvalueas4.9andlactoseconcentrationw as13%~15%.Undersuchconditions,with20%whey (1actoseconcentrationwas13.42%)asthesubstrate,thealcoholyieldcouldreach8-3%(v/v) andtheutilizationratiooflactosewas93.2%after30h fermentationwiththeCO.immobilizedlactase.S.cerevisiae. Keywords:CO-immobilization;whey;lactase;Saccharomycescerevisiae;attapulgite;chit osan 乳清主要是生产干酪及干酪素的副产物,乳清中干物 质含量为6%,8%,其中乳糖为3%,5%,粗蛋白1%,粗脂 肪0.3%,0.4%.在我国,随着干酪产量的不断增加,乳清的 排放量相当可观,无论从资源综合利用还是环境保护的角 度看,都必须把乳清的再利用问题提到议事日程上来[11. 乳清可以作为发酵生产燃料乙醇的工业原料,但由于乳清 中的可发酵性糖主要为乳糖,一般的酿酒酵母不能发 酵乳糖,为此许多研究者通过选育可利用乳糖的酵母菌种 发酵乙醇;另一条可行的途径就是利用8.半乳糖苷酶先 将乳糖水解,进而用酿酒酵母发酵生产乙醇,即运用2步 法生产.本研究将乳糖酶和酿酒酵母共固定化,建立的共 固定化生物催化体系能够更充分地发挥酶和细胞的各自 特点,可以实现在单一培养装置中糖化与酒精发酵作用同 步进行,以期为我国乳清资源的综合利用及乙醇的生产 拓宽途径. 本文主要采用壳聚糖包埋酿酒酵母进行共固定化.而 酶与微生物的共包埋固定化还必须解决2种催化剂在形 体大小上的显着差别,既要防止体积较小的酶从共包埋 载体中泄漏,又要防止载体孔径太小造成的立体屏障[2】. 据有关文献报道,壳聚糖与其他载体材料如磁性材料, 无机吸附类载体材料等耦合使用,可以克服单一壳聚糖 载体固定化酶和细胞时,壳聚糖凝胶比表面积不大,微球 密度较小,易于漂浮等缺点,而吸附剂的加入可以降低固 定化细胞的疏漏,增加细胞在载体中的分散性,进一步提 高酶和细胞的固定化性能.试验选用凹凸棒土作为吸附 剂,将其作为填充增强剂与某些聚合物制备复合材料利用 凹凸棒土具有的强吸附作用,首先将乳糖酶吸附于凹凸棒 土上,然后再加入到壳聚糖溶液中,制成乳糖酶与酵母的 共包埋凝胶颗粒,这样不但提高了凝胶颗粒的强度,克 服了细胞活性发挥在空间上受限的不足,而且降低了酶 的泄漏. 1材料与方法 1.1材料仪器 实验材料及主要仪器:乳糖酶(酶活力约3000U/g), 哈尔滨美华生物技术有限公司生产;壳聚糖(脱乙酰度 为>90%):食品级,济南海德贝生物工程公司生产;乳清 粉:市购;戊二醛(25%):上海化学试剂站分装厂出品;其 他试剂均为分析纯.Uv.9200紫外一可见分光光度计:北 京瑞利分析仪器公司. 菌种:安琪牌酿酒活性干酵母. 1.2培养基 固定化酶.酵母活化增殖培养基阁:葡萄糖2%,蛋白 胨1%,酵母膏1%,调节pH5.5. 乳糖发酵培养基:乳糖12%,蛋白胨1%,酵母膏1%. 乳清发酵培养基:乳清粉加水,调浓度为20%,测定其乳 糖含量为13A2%,实验新用培养基均在ll5?灭菌30min. 收稿日期}2007—08.31 作者简介:李雪雁(1965.),女,甘肃兰卅1人,副教授,研究方向为发酵工程. 创新与借鉴中国酿造2008年第3期 总第180期?55? 1-3买验方法 1.3.1分析检测方法 固定化酶活力的测定:将0.2g固定化酶加入0.8mL (pH6.8)磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶液,38%保温 3min,加入0.2mL浓度为5mmol/L的邻硝基苯酚一B—D一半 乳糖量(0NPG),准确反应10min.加2mL(1mollL)Na2CO3, 将酶灭活,取反应液于波长420nm处测定吸光度值,根据 曲线计算固定化酶活力. 酶活力定义为:在测定条件下G8?,pH6.8,反应10min) 每分钟催化生成1Ixmol邻硝基苯酚(ONP)所需的酶量, 为一个酶活力单位(U). 乳糖的测定:莱因一埃农氏法;酒精含量的测定:比重 法;酵母细胞数的测定:血球计数板法;共固定化颗粒强度 测定:感官法. 1.3.2乳糖酶与酒精酵母的共固定化 活性干酵母的活化及菌悬液的制备:将一定量的活性 干酵母用2%的蔗糖溶液28?活化2h;将活化后的菌液于 3000r/min离心15min,弃去上清液,用无菌水制备菌悬液, 控制酵母细胞浓度约为1×10.个/mL. 凹凸棒土吸附固定乳糖酶:称取5g乳糖酶,用pH值 为6.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液溶解,定容至100mL (稀释酶液的酶活力约为150U/mL);称取5g凹凸棒土加 入到一定量的稀释酶液中,用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶 液补充至25mL,在室温下搅拌吸附4h,抽滤,得吸附固定 了乳糖酶的凹凸棒土. 乳糖酶与酵母菌细胞的共固定化:用1%的乙酸溶液 配制1%壳聚糖溶液,取5mL的活化酵母细胞悬浮液,与 上述吸附了乳糖酶的凹凸棒土一起加入到100mL浓度为 1%的壳聚糖溶液中,搅拌混合均匀.然后将混合液用注射 器逐滴滴入10%NaOH与95%乙醇组成的混合液(体积比 为4:1)中,制成02mm-3mm的凝胶颗粒,过滤收集凝胶 颗粒,用无菌水洗涤2次,真空干燥,即得乳糖酶与酵母细 胞共固定化凝胶颗粒. 共固定化酵母细胞的增殖嘲:将共固定化凝胶颗粒加 入一定体积的增殖培养基,28?,160r/min通气振荡培养 16h~20h后,测培养液内游离细胞数,当游离酵母数为 1xl0.个/mL左右,即完成增殖过程. 1.3.3共固定化酶.酵母的酒精发酵 工艺: 乳清粉一加水,调节浓度一灭菌,冷却一糖化及发酵一蒸馏一酒精 .共固定化乳糖酶与酵母-?共固定化母细胞的增殖 实验发酵条件:采用共固定化酶一酵母分批酒精发酵 方法,分别对发酵温度,pH值,乳糖浓度,发酵时间等影响 进行单因素实验. 2结果与分析 2.1共固定化条件的确定 2.1.1凹凸棒土加量对凝胶颗粒强度的影响 尝试将壳聚糖与凹凸棒土耦合制备固定化凝胶,发现 两者之间的比例有一定的,若凹凸棒土添加量过大, 反而会使凝胶颗粒结构疏松甚至无法形成颗粒.实验分 别将凹凸棒土2g,3g,4g,5g,6g,7g,8g搅拌分散于100mL 浓度为1%壳聚糖乙酸溶液中,按乳糖酶与酵母菌的共固 定化方法在不加酶和酵母的情况下制备凝胶颗粒,以不加 凹凸棒土制备的凝胶颗粒作对照,从颗粒的成型,弹性, 强度及密度等方面进行综合感官评定. 实验结果表明,随着凹凸棒土添加量的增加,凝胶颗 粒密度及机械强度提高,但当凹凸棒土添加量>6g后,颗 粒强度及弹性则会随之降低,添加量>8g时甚至难以成型. 2.1-2凹凸棒土添加量对共固定化细胞发酵性能的影响 分别在100mL浓度为1%壳聚糖乙酸溶液中添加凹 凸棒土3g,4g,5g,6g,制备共固定化酶一酵母凝胶颗粒;增 殖后在乳糖浓度为12%,pH值为6.0,温度为30%时进行 发酵实验,30h后测定酒精浓度,其结果见表1. 表1凹凸棒土添加量对共固定化颗粒性能的影响 Table1.Effectofattapulgiteamountonthequalityofco-immobilized particles 注:"+"一般,"++"较好,"卅"好. 由表1可见,随着凹凸棒土添加量的增加,发酵液的 酒精度增大.其原因可能是:(1)凹凸棒土加量与乳糖酶 被吸附的量有关.(2)与凝胶颗粒的相对渗透性有关.凹 凸棒土加量增大,共固定化凝胶颗粒的渗透性增强,有利 于酵母的发酵作用,但颗粒的强度及弹性随之降低.综合 考虑颗粒强度,酶的吸附,酵母的发酵作用及降低成本等 各因素,实验确定凹凸棒土添加量为5g,即凹凸棒土与壳 聚糖之比为5:1时进行共固定化. 2.1.3乳糖酶加量的影响 凹凸棒土吸附承载酶的能力是有一定限度的.在载体 量一定的条件下,当加酶量相对较少时,载体分子表面没 有吸附足够的酶蛋白,载体并没有被完全利用,导致固定 化酶的活性较低;而当加酶量相对较多时,载体所吸附的 酶蛋白也较多,但由于载体表面吸附的酶蛋白量过多会造 成酶分子相互聚集成团,酶分子的活性中心有可能被遮 盖,反而使酶的活性也降低.实验分别取5%稀释酶液 6mL,8mL,10mL,12mL,14mL,16mL,18mL,各加入凹凸棒 土5g,用pH6.5的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液补充至 20o8N0.3 ?56?SedalNo.180ChinaBrewingI 皿.vati.naJ1dKn.w1e起eTrans 25mL,在室温下搅拌吸附4h,抽滤,真空干燥.分别测固 定化乳糖酶的酶活力和回收率,结果见图1. ? 套 溢褂 回 回避 化酶活力 收率 6l0l2l4l6l20 加酶量/mL 图1乳糖酶加量对乳糖酶活力和回收率的影响 Figure1.Effectoflactasecontent 由图1可知,随着乳糖酶加量的增加,固定化酶活力 增加,但酶的回收率却随着加酶量的增大而减少.兼顾固 定化酶的表观活力和酶回收率,实验选择加酶量为10mL (相当于300U/g凹凸棒土),此时固定化乳糖酶活力为 109.7U僮,酶回收率为37.3%. 2.1.4酶吸附时间的影响 分别在不同的时间,室温进行乳糖酶的吸附固定,测 定固定化酶活力,结果见图2. 蜒 溢 囤 时l司/h 图2酶吸附时间对固定化酶活力的影响 Figure2.EffectofabsorPtiontimeonactivityofimmobilizedlactase 由图2可看出,室温吸附4h~5h时固定化酶活力较 高,载体的酶吸附能力已趋于饱和.随着时间的推移,固 定化酶活力略有升高,但总体变化不大.故选择酶的吸附 时间为4h. 2.2共固定化酶一酵母的乳糖酒精发酵性能 S 时间/h 图3温度对乳糖酒精发酵的影响 Figure3.Effectoftemperatureonalcoholfermentationoflactose 2.2.1温度对发酵的影响 用乳糖发酵培养基,在pH值为6.0,温度分别为30%, 32?,34?和36?时进行酒精发酵,其结果见图3. 由图3可以看出,在发酵前期,同一时间内随着温度 的升高酒精体积分数升高,这是由于乳糖酶的适宜温度 为38?左右,温度较高时有利于酶的作用,乳糖水解速度 较快,发酵速度也就相应较快.但发酵后期,发酵温度较 高时,酒精浓度反而较低,原因是较高温度使酵母易于衰 退.在32%酒精体积分数升高速度最快,可以确定32%为 共固定化酶与细胞发酵的适宜温度. 2.2.2pH值的影响 乳糖酶与酵母所适宜的pH范围不完全一致【n】,因而 首先测定了固定化乳糖酶的最适pH值.按凹凸棒土吸附 固定乳糖酶及乳糖酶与酵母菌细胞的共固定化方法,不 加活性酵母制备固定化乳糖酶颗粒;分别在pH值为5.6, 6.0,6.4,6.8,7.2,7.6的缓冲体系中测定固定化酶的酶活, 结果见图4. 120 110 蜒100 龆 90 囤 80 5.66.06.46.87.27.68 pH值 图4pH对固定化酶活力的影响 Figure4.EffectofpHontheactivityofimmobilizedlactase 由图4可知,固定化酶的适宜pH值范围较宽,在 pH6.4~7.0固定化酶活力较高. 由于酒精酵母在pH5..0具有较高的活性,测定共 固定化酶一酵母在乳糖发酵培养基中温度为32%,pH值 分别为5.0,5.5,6.O和6.5时发酵的酒精浓度,30h发酵结 束时的结果见图5. S 5.o5.56.O6.5 pH值 图5pH值对发酵的影响 Figure5.EffectofpHonfermentation 图5表明,当pH6.0~6.5时,酒精发酵效果较好,酒精 如加?如 5756555453 创新与借鉴中国酿造2008年第3期 总第180期?57? 体积分数高于其他实验组.选择pH6.0为发酵条件,可兼 顾乳糖酶和酵母二者的适宜pH值范围,并使乳糖酶充分 发挥糖化作用. 2-2-3乳糖浓度对发酵的影响 在发酵温度为32?,pH值为6.0,乳糖发酵培养基的 乳糖浓度分别为10%,12%,15%,18%,20%时进行酒精发 酵,测定乳糖浓度并计算乳糖转化率,结果见图6. 95 90 褂 85 耱 80 75 糖 糖 糖 糖 糖 243O3642 时间m 图6乳糖浓度对乙醇发酵的影响 Figure6.Effectoflactoseconcentrationonaceticacidfermentation 由图6可见,总体上乳糖浓度较低时,乳糖转化率较 高,发酵时间较短.乳糖浓度为10%,15%时,发酵时间为 30h,乳糖转化率超过92%,而乳糖浓度在18%和20% 时,发酵速度较慢,最终乳糖转化率也较低,说明乳糖浓 度过高对共固定化酶与细胞的活性有抑制作用.因此确定 乳糖浓度?15%,适宜范围为13%~15%. 2-3共固定化酶.酵母发酵乳清 l2 l0 厂, 8 蔷 4鬻 2 o o12l8243036 时间m 图7乳清酒精发酵转化率 Figure7.Utilizationrateofwheyalcoholfermentation 用20%的乳清(乳糖含量为13.42%)为底物的乳清发 酵培养基,在pH值为6.0,发酵温度为32?条件下发酵, 结果见图7. 由图7可见,在适宜的发酵条件下,30h酒精度为 8.3%(v/V),乳糖转化率为93.2%. 3结论 采用包埋.吸附耦合的方法制成乳糖酶与酿酒酵母 细胞的共固定化凝胶颗粒.通过实验,确定了凹凸棒土与 壳聚糖的适宜比例为5:1,乳糖酶加量为300U/g凹凸棒 土,室温下吸附时间为4h;所制得的共固定化酶.酵母细 胞发酵乳糖的适宜pH值为6.0,温度32?,乳糖浓度< 15%;在适宜的发酵条件下,用乳糖含量为13.42%的乳清 发酵培养基进行酒精发酵,30h后测定酒精浓度为8.3% (v/V),转化率达93.2%.表明应用该方法制各的共固定化 酶.酵母细胞基本能够满足工业生产的要求. 参考文献: [1]马晓燕,郑辉,李英军.紫外诱变原生质体选育发酵乳清高产酒精 的克鲁维酵母[J].酿酒科技,2006,146(8):37.39. 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