EDTA作为抗原修复液用于脑石蜡片NMDA-R2A免疫组织化学检测的方法与效果探讨

EDTA作为抗原修复液用于脑石蜡片NMDA-R2A免疫组织化学检测的方法与效果探讨 EDTA作为抗原修复液用于脑石蜡片NMDA-R2A免疫组织化学检测的方法与效 果探讨 四川解剖学杂志2007年第15卷第l期?79? ? 技术交流? EDTA作为抗原修复液用于脑石蜡片NMDA_R2A 免疫组织化学检测的方法与效果探讨 郑翔,彭谨,马玉琼,章为 (四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学与神经生物学教研室,成都 610041) 石蜡切片进行免疫组织化学染色的优势在于能得到极为 清晰美观的组织形态,其中修复待检测物质的抗原性(抗原修 复)是一个关键步骤.抗原修复的效果直接影响到最终的染 色结果.用pH值6.0的枸橼酸(柠檬酸)缓冲液进行微波修 复或高压修复目前使用最广,是国内外绝大多数实验室的首 选方法.该方法能有效修复大多数物质的抗原性,得到阳性 强,结果美观的图像,重复性好,颇受广大实验工作者的欢迎. 但经过长期实践和总结发现枸橼酸缓冲液用于抗原修复有一 个比较隐蔽的缺陷:它能使某些膜受体的阳性分布区域向细 胞质内扩大.比如NMDA-R2是一种广泛分布于脑内的促离 子型谷氨酸受体,免疫电镜显示它应当分布在神经细胞的突 触后膜上Eli.但使用枸橼酸缓冲液对大鼠中脑石蜡切片进行 抗原修复后,阳性结果分布于神经细胞的整个胞质(图1B);这 与NMDA-Rz^的实际分布有明显出入.由于细胞质阳性的图 像比较美观,并且这种阳性的成因也有解释的余地,因此常常 被实验人员误认为是正常的.我们尝试了其它一些修复方 法,综合比较后认为乙二胺四乙酸(EDTA)溶液对于NMDA- Rz这类膜受体的检测是一种更好的抗原修复液,并对其使用 方法和效果探讨如下. 1材料和方法 1.1实验动物的选择和标本获取 成年健康SD大鼠12只,体重300士18g,性别不拘.用 戊巴比妥钠40nag/kg腹腔麻醉.采用Zamboni固定液灌注 后取下全脑,修块约4Hlm厚,继续浸泡固定12h.酒精梯度 脱水,常规石蜡包埋.行4btm冠状面石蜡切片.载玻片用明 矾明胶于65?处理10min,自然晾干.裱片后,石蜡切片置 于40?恒温干燥箱烤片12h,然后进入脱蜡和免疫组织化学 染色程序. 1.2主要试剂和设备 枸橼酸修复液:枸橼酸三钠(c6H5Na.07?12H20)3g, 枸橼酸(c6H807?H20)0.4g,溶于1000ml蒸馏水中,用1 mol/LNaOH将pH值调整为6.0.EDTA修复液:EDTA? 2Na?2H2O0.002mol,蒸馏水1000ml,用1mol/LNaOH调 整pH值为7.0,8.0和9.0(制备三种pH值便于效果比较). 该液体临用前配置.兔抗大鼠NMDA-R2原液:博士德 BA0613;SABC浓缩型试剂盒:中杉SPN-9001;DAB:Sigma 108H1308.显色液含DAB0.003g,用5mlpH7.6的Tris 缓冲液配制,临用前加入3H20215l.主要设备:Olym— pusBH2显微镜,OlympusC5060WZ数码相机,接照相目镜 (4E15192);Ao820型轮转式切片机;GalanzWD800微波炉; ImagePro图像分析系统5.0版本. 1.3抗原修复和染色方法 为方便修复条件的比较,EDTA修复液的用法采用三种 通讯作者:章为,教授. .方案一(37?):同样将水化的石蜡切片浸入室温20? 左右的第一份EDTA修复液10min,然后转入37?恒温箱中 继续浸泡2h,中间摇动几次.方案--(6O?):将水化的石蜡 切片浸入室温20?左右的第一份EDTA修复液10min,中间 摇动数次;转入已置于60?预热的第二份同样的修复液25 min,然后自然冷却至室温.方案三(95?):常温浸泡10min 后,转入沸腾后刚好停止加热的第二份同样的修复液中浸泡2 , 3rain,自然冷却至室温.枸橼酸修复液的使用方法为[2]: 将水化的切片放入修复液内,置于微波炉中用中火煮沸10 min,自然冷却至室温.免疫组织化学SABC程序染色;其中 2牛血清白蛋白封闭30min,第一抗体统一为37?孵育1h 然后转入4?孵育12h,生物素标记的第二抗体和链霉卵白 素辣根过氧化物酶复合物都采用37?孵育30min的方法. 显色反应后,切片晾干1h,从80酒精开始梯度上行脱水,二 甲苯透明,中性树胶封片.Nissl染色的方法是:水化的切片 浸入0.5硫堇水溶液中置于37?恒温箱染色30min,经 95乙醇快速分色15~30s,转入正丁醇中脱水两次,同上透 明,封片.照相后,图片用ImagePm5.0进行分析处理. 2实验结果 2.1两种修复方法显示神经细胞的NMDA_ R2A分布有明显差异. 如图1(A—C)所示,SD大鼠三叉神经中脑核有明确的 NMDA-I%A分布.图1A标示出观察到的NMDA阳性神经元 在脑冠状切片上的位置(参照大鼠脑图谱E3],取距前囟一 10.04标准冠状面).图1B是枸橼酸修复液做抗原修复后的 免疫组化程序检测结果;图1C是前者的相邻切片经 EDTA修复液(照片中的切片采用的是pH8.0,95?方案;选 择理由见下文)处理后进行同样检测的结果.图1B和1C对 比可以发现,用枸橼酸修复处理的切片上,阳性结果充满整个 胞浆;而经EDTA修复的切片,阳性结果绝大部分局限在胞膜 附近. 2.2神经元NMDA_A的阳性分布与Nissl染 色的阳性分布部位互补. 取相邻的两张切片分别用于NMDA-R2免疫组织化学检 测(EDTA修复)和Nissl染色,拍照后在保证照片中的各个结 构基本重合的情况下,裁剪成同样面积,用ImagePro软件进 行图像分析.NMDA-R2A阳性区域(棕黄色,ImagePro中R: 118—199,G:0—160,B:0—132)面积占整张照片面积的 6.15(均值,n=30;其它数据从略.下同),如图2a.将两张 切片的照片重合,用虚线勾划出其中NMDA-R2呈阳性的两 个细胞的轮廓(图2b);分析图2b中标有虚线的这两个细胞, 它们的Nissl染色阳性区域(蓝色,ImagePro中R:125-159, ? 80?SlCItUANJOURNALOFANATOMYVOL15NO.12007 G:O一165,B:98—255)面积占整张照片面积的4.14.对 比图2a和2b发现,两种检测的阳性分布似呈互补关系.Im- agePro软件分析结果中,两种检测阳性区域面积之和占整张 照片的1O.29.虚线内总面积占照片的11.16,考虑到胞 核内除去核仁部分(面积占0.59)两种检测都为阴性,故两 种检测单独进行时的阳性结果分布面积之和与细胞的有阳性 部位的总面积(占1O.57)是十分接近的.这些数据配合形 态学图像提示,经过EDTA修复处理后NMDA-R2的阳性分 布与Nissl小体的分布部位互补. ,一二筝 2.3EDTA修复液在pH8.0,95?修复的条 件下综合效果最好. 如表1所示,抗原修复处理的温度越高,免疫组织化学染 色的阳性结果越强.pH值为7.0时3种修复温度都不能得 到满意的阳性强度,而当pH值为8.0或9.0时在95?的修 复条件下都能获得典型的强阳性结果.pH值为9.0时,略微 有一些背景着色,而且每次修复操作有不低于1O的脱片率. 相比之下,pH值为8.0的修复液既不会造成背景着色也不造 成脱片.所以,综合比较起来,采用pH值8.0的EDTA修复 液进行95?抗原修复效果最佳且非常稳定. 表1不同修复条件下免疫组织化学检测的阳性强度 修复条件pH7.0pH8.0pH9.0 37?++ 6O?+++++ 95?+++++++ 3讨论 NMDA-RzA是中枢神经系统的一种兴奋性氨基酸受体, 在哺乳动物脑内分布广泛.免疫电镜研究显示,功能性的 NA受体的阳性分布部位都集中在突触后成分中贴近神 经细胞胞膜的条形区域中Ll].我们发现目前在石蜡切片上 广泛使用的枸橼酸缓冲液热抗原修复法得到的结果与现有理 论以及电镜结论不符,整个神经细胞的胞浆呈现阳性.这种 胞浆阳性的结果由于比较明显和美观,被很多实验人员认为 是正常结果,未做进一步分析.另一方面,由于通过免疫组织 化学检测到膜受体分布于胞浆中在分子代谢水平也有解释余 地,因此长期以来对该阳性结果的矛盾未给与足够重视.如 果使用EDTA溶液作为抗原修复液就可以观察到典型的膜阳 性的结果,与现有理论和电镜研究证据一致.至于为什么两 种修复液的作用会出现这种差异,由于目前各种抗原修复的 化学反应原理都尚未完全明了,还不能给出满意的答案.另 外,有研究认为特定的物质在修复后会恢复原来的带电状态, 有利于通过抗原一抗体反应检出[5].我们的实验也支持这一假 说,因为pH值与蛋白分子的带电状态密切相关,而实验显示 pH值8.0到9.0时检出的阳性结果最强,7.0时阳性结果很 弱甚至呈现阴性. NMDA-Rz与大多数膜蛋白的合成和装配方式相同,与 内质网和核糖体等结构有关.这些结构在神经细胞中正好对 应为Nissl小体L6].实验显示Nissl小体的位置基本上没有 NMDA-R2阳性分布,说明在MDA-Rz合成和装配的阶段 尚未形成特有的抗原决定簇,不能与其特异性抗体结合.而 本实验使用的抗体针对的是NMDA-R2的N'端到M1结构域 之间的一个特异性结构,它对于NMDA'RzA发挥正常功能是 必不可少的[7].所以,这一结果也肯定了具有正常功能的,成 熟的NMDA-Rz的确位于神经细胞的胞膜.相比之下,传统 的枸橼酸修复法不能准确地显示这种分布. 综上,pH值为8.0的EDTA溶液是NMDA-R2A免疫组 织化学检测的理想抗原修复液;采用常温浸泡10min,95?水 浴修复2-3rain的程序十分方便和快捷,既不造成脱片也不增 加背景着色;关键是该方法确保了NMDA-R2这类脑内膜受 体的阳性分布在石蜡切片免疫组织化学检测中能准确地显示 出来.除此以外,我们在其它一些膜受体的免疫组织化学检 测中也观察到类似的结果,说明该修复方法与枸橼酸法相比 具有普遍的优势. 参考文献 [1-1GalvanA,KuwaiiraaM,SmithY.GlutamateandGABAreceptors andtransportersinthebasalganglia:whatdoestheirsubsyrmptic localizationrevealabouttheirfunction[J]?Neuroscienee,2006, 143:351—375. [2]梁晓莉,病理学基础与实验技术[M].第1版,北京;军事医学科学 出版社,2004.209--210. [3]PaxinosG,WatsonCTheratbraininstereotaxiecoordinates [M].3Ed,SanDiego:AcademicPress,1998.figure60. 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