酿酒酵母高尔基体糖基化及生物学功能的研究

酿酒酵母高尔基体糖基化及生物学功能的研究 酿酒酵母高尔基体糖基化及生物学功能的研究 酿酒酵母高尔基体糖基化及生物学功能的研究 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有无毒、容易培养、遗传背景清晰和对外源蛋白有糖基化修饰等优点，是理想的外源蛋白达宿主。酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，酵母基因组数据库关于酵母基因组的详细注释(annotation)是研究糖基化酶的结构与功能之间的关系，寻找关键的结构域及阐明这些与膜相连的糖基化酶的拓扑学(topography)结构的重要工具。由于定位于酿酒酵母内质网和高尔基体的糖基化酶基因基本已被分离，有目的性的敲除这些酶将促进阐明糖基化与细胞功能的机制。在真核细胞中，分泌蛋白和定位蛋白经常被复杂的寡糖链修饰，糖蛋白中的寡糖在许多细胞识别过程中起着重要作用，如肿瘤转移、细胞粘附、病原体入侵和免疫反应等。另外，糖基化影响蛋白质的生物合成、折叠、抗原性、免疫原性及其在血浆中的半衰期。酿酒酵母蛋白N-糖基化和其他真核生物一样，首先发生在内质网中，N-连接的寡糖转移至新生肽的天冬酰胺上。转运到定位之前，N-糖链还经过高尔基体中进一步修饰加工至成熟的糖链结构。本课题主要研究了酵母高尔基体糖基化过程及N-糖链outer chain在细胞生命过程中的生物学功能。Mnn1p和Och1p是酿酒酵母高尔基体糖基化过程中的起始阶段的两个甘露糖基转移酶，Mnn1p参与N-糖链outer chain形成α1，3-甘露糖，Och1p则在核心糖链Man_8GlcNAc_2上加上一个α1，6-甘露糖，从而引发outer chain的α1，6-backbone的形成和N-糖链的过度甘露糖基化。利用Overlap extension PCR的方法，我们在体外构建了等位基因敲除DNA片段。通过敲除DNA片段上的同源序列与酵母基因组发生重组置换，敲除酵母N-糖基化过程中的甘露糖基转移酶基因MNN1和OCH1，构建了两株蛋白糖基化突变菌株:mnn1突变菌株和mnn1 och1突变菌株。为mnn1 och1突变菌株蛋白的糖基化形式，我们采用热柠檬酸抽提的方法，提取了酵母细胞壁的甘露糖蛋白;利用高甘露糖亲和柱concanavalin A-sepharose 4B亲和层析纯化抽提液中的甘露糖蛋白。利用糖酰胺酶PNGase F水解释放糖蛋白中的糖链;采用Shim-pack clc-NH2氨基柱Size-fractionation HPLC分析了2-氨基吡啶衍生后 的糖链组份，结果表明，mnn1 och1突变菌株蛋白的糖链为单一组成，该组分的MALDI TOF,MS分子量鉴定为179 4.66Da，与Man_8GlcNAc_2-PA的分子量相同。结果说明了MNN1和OCH1基因的敲除阻断了内质网核心糖链(ER core type glycan)在高尔基体中形成高聚合度甘露糖的outer chain，在mnn1 och1突变菌株中蛋白糖基化是单一的核心糖链结构，Man_8GlcNAc_2。糖蛋白不仅是细胞结构的重要组成部分，也是细胞生命活动的主要承担者之一。在mnn1 och1突变菌株中，蛋白糖基化在高尔基体阶段修饰受阻，通过突变菌株细胞形态及生化特征观察，发现高尔基体糖基化缺陷影响了细胞一些正常的活动;比较野生型和mnn1 och1突变菌株的生长曲线，发现突变菌株细胞生长速度明显减慢，菌体密度也不高;通过温度敏感性实验和台盼蓝染色(trypan blue dye staining)考察了高尔基体糖基化突变对细胞活力的影响。结果表明单个敲除基因MNN1并不影响细胞的生长表型，如果同时敲除MNN1和OCH1基因后，突变菌株的生长对温度变得敏感，这种温度敏感性的生长依赖于渗透压稳定剂。在mnn1 och1突变菌株中，细胞还表现一些细胞分裂的缺陷，而且渗透压稳定剂也不能抑制突变菌株细胞分裂缺陷。高尔基体糖基化突变影响了新生细胞壁的形成，导致子细胞不能正常地从母体细胞分离出来，细胞的不完全分裂造成了mnn1 och1突变菌株生长高度聚集，细胞堆积。另外，高尔基体糖基化缺陷也影响到分裂过程中细胞核的迁移，对mnn1 och1突变菌株细胞的细胞核DAPI染色发现一些芽孢没有细胞核。mnn1 och1突变使得N-糖链的完全丧失outer chain，因此减少了N-糖链的甘露糖磷酸化位点，这减弱细胞与细胞之间相同电荷的排斥作用，也破坏细胞表面的水化层，从而影响细胞的粘度，导致mnn1 och1细胞易堆积沉降。细胞凋亡(apoptosis)的生物学意义主要在于清除多余的、有害及衰老细胞，这一机制仍然保留在单细胞生物中。在哺乳动物和酵母中，蛋白整个糖基化过程缺陷，如ER糖基化起始阶段的基因突变或糖基化抑制剂，都诱导细胞的凋亡。本研究结果表明，N-连接糖链的不完整(高尔基体糖基化缺陷)足够引发酵母糖基化诱导的细胞凋亡。在trypan blue staining分析mnn1 och1突变菌细胞活力时发现，37?培养时细胞大量死亡，显 微观察发现部分死亡的细胞呈现与衰老细胞(ageing cell)相似的表征，如细胞表面疏松，皱褶。对mnn1 och1突变菌的凋亡形态学和生物化学特征进一步考察，结果显示，死亡的细胞中呈现细胞染色质浓缩(chromatin condensation)，胞核碎化(nuclear fragmentation)，磷脂酰丝氨酸外露(phosphatidylserine exposure)在细胞膜的外层，而细胞膜保持完整，这些细胞凋亡表型及生化的特征表明，mnn1 och1突变菌株细胞经历了程序性死亡过程(programme cell death)。活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是酵母细胞凋亡关键的调控子，利用荧光探针二氢罗丹明123(dihydrorhodamine 123)mnn1 och1突变菌株细胞内的ROS水平，结果显示，在28?和37?培养的细胞中，ROS都出现不同程度的积累，说明高尔基体糖基化缺陷诱导的细胞凋亡是通过ROS途径进行调控。高尔基体糖基化缺陷可破坏酵母细胞壁的结构完整性，导致大量细胞坏死(necrosis)，这一点通过mnn1 och1突变菌株增加了对50μg,ml的刚果红(Congo red)和细胞壁水解酶glucuronidase-lyticase敏感性以及 1.0M的山梨醇(sorbitol)提高了细胞存活率中得到证实。人干扰素-β(HuIFN-β)是成纤维细胞受病毒感染或诱生剂诱导产生的细胞因子，广泛应用抗病毒，多发性硬化和肿瘤化疗。HuIFN-β是糖蛋白，在Asn~(80)上有一个N-糖基化位点。将HuIFN-β基因导入酿酒酵母分泌型表达载体pYFD18，构建重组载体pYFD18-HuIFN，通过电击转化法，将重组载体分别导入w3031A(wild type)菌株。mnn1突变菌株及mnn1 och1突变菌株，筛选转化子并表达外源蛋白，利用Western blot检测酵母细胞内和发酵液中的HuIFN-β的表达，结果显示，HuIFN-β蛋白在胞内积累，都没有在α-factor信号肽的引导下分泌到发酵液中。而且野生型和mnn1 och1突变菌株的Western blot杂交条带大小相同，由此证明，β-干扰素在酿酒酵母中表达时，由于对酵母细胞的毒性，没有经过分泌途径进入高尔基体进行糖基化修饰而分泌到胞外，从而造成HuIFN-β以α-factor信号肽融合蛋白的形式在细胞内积累。 摘要9-12ABSTRACT12-16缩写简表16-18第一章 绪论18-41 1.糖生物学研究进展18-26 1.1 糖生物学的发展历程18-19 1.2 糖生物学的研究现状和展望19-20 1.3 寡糖链的生物学功能20-21 1.4 糖蛋白与蛋白糖基化21-24 1.5 糖链分析方法的研究进展24-26 2.酿酒酵母糖基化的研究进展26-33 2.1 酿酒酵母在糖基化研究中的应用26-27 2.2 酿酒酵母的N-糖基化机制27-33 2.3 N-糖基化与酵母细胞形态33 3.酵母细胞凋亡33-39 3.1 动物细胞凋亡的特征34 3.2 单细胞生物的凋亡34-35 3.3 酿酒酵母细胞调亡35-36 3.4 酿酒酵母细胞调亡的研究意义36-37 3.5 酿酒酵母细胞凋亡的特征37 3.6 外源性诱导的酵母凋亡37-38 3.7 内源性诱导的酵母凋亡38-39 3.8 酵母细胞凋亡的研究展望39 4.本论文的研究工作39-41第二章 酿酒酵母糖基转移酶的基因敲 除及糖基化分析41-62 1.材料与方法42-51 1.1 质粒与菌株42 1.2 分子克隆用酶及试剂42 1.3 培养基配方42-43 1.4 主要仪器和设备43 1.5 溶液及配置43-44 1.6 酵母DNA的快速提取法44 1.7 选择性标记基因和同源片段的扩增44-45 1.8 PCR扩增片段的回收45 1.9 URA3,HIS3基因的TA克隆45 1.10 大肠杆菌感受态细胞的制备45-46 1.11 连接产物的大肠杆菌转化46 1.12 质粒的SDS碱裂解法制备46-47 1.13 同源置换DNA片段的重叠延伸PCR的构建47-48 1.14 融合片段PCR产物的琼脂糖凝胶回收48 1.15 酿酒酵母电转化菌体的制备48 1.16 线性DNA的酿酒酵母电转化48-49 1.17 重组子的基因组PCR筛选49 1.18 酿酒酵母细胞壁蛋白的制备49 1.19 甘露糖蛋白的分离49-50 1.20 N-糖链的释放(release)和纯化50 1.21 N-糖链的2-氨基(2-aminopyridine)衍生50-51 1.22 吡啶化糖链的HPLC和MALDITOFMS分析51 2.结果与分析51-59 2.1 选择性标记基因及同源片段的扩增51-52 2.2 敲除线性DNA片段的构建52-53 2.3 酿酒酵母mnn1和mnn1och1突变菌株的构建53-55 2.4 酿酒酵母mnn1och1突变菌株的蛋白糖基化分析55-59 3.讨论59-61 3.1 Ochlp和Mnnlp基因对酿酒酵母N-糖基化的影响59-60 3.3 N-糖链的磷酸化60 3.3 突变菌株的应用前景60-61 4.本章小结61-62第三章 高尔基体糖基化缺陷对酵母细胞分裂的影响62-76 1.材料与方法63-66 1.1 菌株63 1.2 主要试剂63 1.3 培养基及溶液配置63-64 1.4 主要仪器和设备64 1.5 生长曲线测定64 1.6 细胞核染色64 1.7 温度敏感性试验64-65 1.8 台盼蓝(trypan blue)染色65 1.9 聚集态生长的细胞分离65 1.10 细胞的阿利新兰(alcian blue)染色65-66 2.结果与分析66-73 2.1 糖基化缺陷影响酿酒酵母的生长66-67 2.2 糖基化缺陷导致酿酒酵母细胞温度敏感67-70 2.3 糖基化缺陷影响酵母细胞分裂70-72 2.4 糖基化缺陷影响细胞表面负电荷密度72-73 3.讨论73-75 3.1 突变菌株缺陷与糖链的不完整性相关73-74 3.2 细胞壁破坏导致突变菌株温度敏感性74-75 3.3 糖基化影响细胞分裂75 4.本章小结75-76第四章 高尔基体糖基化缺陷与酵母细胞的死亡76-95 1.材料与方法76-80 1.1 菌株与培养基77 1.2 主要试剂和仪器77 1.3 溶液及配制77 1.4 细胞活力检测77-78 1.5 刚果红敏感性试验78 1.6 Glucuronidase-lyticase敏感性实验78-79 1.7 细胞核fragment检测79 1.8 细胞凋亡DNA ladder检测79 1.9 磷脂酰丝氨酸外露(PS exposure)的FITC-annexin V染色79-80 1.10 活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的测定80 2.结果与分析80-89 2.1 糖基化突变对酵母细胞活力的影响80-82 2.2 mnn1 och1突变菌株细胞染色质浓缩(Chromatin condensation)82-84 2.3 mnn1 och1突变菌株细胞膜磷脂酰丝氨酸外露84-86 2.4 糖基化突变导致细胞壁缺陷86-88 2.5 mnn1 och1突变菌株细胞内活性氧自由基的积累88-89 3.讨论89-94 3.1 细胞壁缺陷导致突变菌株细胞大量坏死90 3.2 内质网糖基化与细胞凋亡90 3.3 高尔基体糖基化与细胞凋亡90-91 3.4 酵母糖基化诱导的细胞凋亡调控机制91-92 3.5 ROS在酵母细胞凋亡中的作用92 3.6 酵母糖基化缺陷ROS积累机制92-93 3.7 糖基化与细胞凋亡的研究展望93-94 4.本章小结94-95第五章 干扰素在酿酒酵母中的克隆及表达95-108 1.材料与试剂96-101 1.1 载体和菌株96 1.2 试剂和主要仪器96 1.3 培养基96-97 1.4 溶液的配制97-98 1.5 目的基因的PCR扩增98 1.6 YFD18质粒的SDS碱裂解法制备98 1.7 目的基因与载体的限制性内切酶消化98-99 1.8 单酶切克隆载体的去磷酸化99 1.9 目的基因与载体的连接反应及转化99 1.10 重组质粒的制备及正向插入的筛选99 1.11 重组质粒酵母细胞的转化99-100 1.12 酵母中质粒DNA的提取100 1.13 发酵液的浓缩处理100 1.14 酵母胞内蛋白样品的制备100 1.15 Western-blot100-101 1.16 亲和层析纯化101 2.结果与分析101-105 2.1 干扰素-β基因的扩增及重组载体的构建101-103 2.2 酿酒表达菌株的构建103-104 2.3 干扰素的表达及western blot分析104-105 3.讨论105-107 3.1 mnn1 och1突变菌株在蛋白表达宿主菌中的应用106 3.2 HuIFN-β在酿洒酵母中的表达106-107 4.本章小结107-108References108-124附表124-125致谢125-126攻读学位期间发表的学术论文126-127学位论文评阅及答辩情况表127-128英文文章128-166