游离氨基酸总量的测定

游离氨基酸总量的测定 植物体内游离氨基酸总量的测定 方法一: 一、原理 游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。 二、仪器设备 分光光度计;电子天平;容量瓶25ml或50ml 3个;漏斗(直径6厘米)3个、滤纸适量;20ml刻度试管 7支;移液管0.5ml 3支、5ml 1支;试管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜(封试管口);吸水纸;擦镜纸适量;电炉;水浴锅(含铁丝筐)。 三、试剂 1. 3%茚三酮试剂 称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10天。 2. 氰酸盐缓冲液(按以下方法配制): (1)NaCN贮备液0.01mol/L(490mg/L)。 (2)醋酸缓冲液:称360g醋酸钠(含三分子结晶水)溶于约300ml无氨蒸馏水中，加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。 取溶液(1)20ml，用溶液(2)定容到1L。 3. 标准氨基酸 精确称取在80?下烘干的亮氨酸13.1mg(或α-丙氨酸8.9mg)溶于10%的异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5μmol，或氨基氮7μg。 4. 95%乙醇;异丙醇(分析纯)。 四、操作步骤 1. 标准曲线的制作 取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。加完试剂后混匀，在100?水浴中加热12min(加热时封口)，取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度(以空白管为参比)，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。 2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片(或其它组织)，洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.10~0.20g(视氨基酸含量多少而定)，共称3份，分别加入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞(或系上塑料薄膜)，置沸水浴中20min以提取游离氨基酸，到时取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀。 3. 样品测定 另取4支洁净干燥的试管，其中3支分别加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm下测其光密度。 根据光密度查标准曲线(或用回归方程计算)即可求出提取液中氨基酸的浓度。 方法二: 一、原理 游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其颜色的深浅 与游离氨基酸的含量成正比。 二、仪器设备 分光光度计;电子天平;容量瓶25ml或50ml 3个;漏斗(直径6厘米)3个、滤纸适量;20ml刻度试管 7支;移液管0.5ml 3支、5ml 1支;试管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜(封试管口);吸水纸;擦镜纸适量;电炉;水浴锅(含铁丝筐)。 三、试剂 1. 3%茚三酮试剂 称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到100ml容量瓶里，贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处，不宜久放，使用期约10天。 2. 氰酸盐缓冲液(按以下方法配制): (1)NaCN贮备液0.01mol/L(490mg/L)。 (2)醋酸缓冲液:称360g醋酸钠(含三分子结晶水)溶于约300ml无氨蒸馏水中，加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L。 取溶液(1)20ml，用溶液(2)定容到1L。 3. 标准氨基酸 精确称取在80?下烘干的亮氨酸13.1mg(或α-丙氨酸8.9mg)溶于10%的异丙醇中，并在100ml容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度，混匀，即为1mmol/L的标准氨基酸贮备液，置冰箱中保存。为了制备工作液，可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合，此液浓度为0.5mmol/L，即1ml含氨基酸0.5μmol，或氨基氮7μg。 4. 95%乙醇;异丙醇(分析纯)。 四、操作步骤 1. 标准曲线的制作 取20ml刻度试管18支，按下表1加入各试剂。加完试剂后混匀，在100?水浴中加热12min(加热时封口)，取出在冷水中迅速冷却，立即于每管中加入5ml 95%乙醇，塞好塞子，猛摇试管，使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色，此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度(以空白管为参比)，以氨基酸浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。 表1 各试管加入试剂量 2. 样品提取 选取有代表性的植物叶片(或其它组织)，洗净擦干，剪碎混匀，迅速称取0.10~0.20g(视氨基酸含量多少而定)，共称3份，分别加入20ml刻度试管中，再加蒸馏水10ml盖塞(或系上塑料薄膜)，置沸水浴中20min以提取游离氨基酸，到时取出在自来水中冷却，把上清液滤入25ml容量瓶中，之后再往试管中加5ml蒸馏水，置沸水浴上再加热10min，过滤并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，摇匀。 3. 样品测定 另取4支洁净干燥的试管，其中3支分别加入0.5ml提取液，另一支加0.5ml蒸馏水，然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml，加完试剂后盖塞，置沸水浴上加热12min，冷却后，再分别加5ml 95%乙醇，摇匀，以空白作参比，在波长570nm下测其光密度。 根据光密度查标准曲线(或用回归方程计算)即可求出提取液中氨基酸的浓度。 4. 计算 游离氨基酸含量 式中 C:由直线方程计算的值，即0.5ml试样中氨基酸的微摩尔数(μmol); V:样品提取液经稀释后的总体积(ml); W:样品重(g)。 测定结果按表2记录。 表2 游离氨基酸总量测定记载表