猪轮状病毒的细胞培养

猪轮状病毒的细胞培养 猪轮状病毒的细胞培养 第6卷第4期 2002年12月 石河子大学(自然科学版) JournalofShiheziUniversity(Naturalnce) V01.6No.4 Dec.2002 文章编号:1(137—7383(2002)04-0281—04 猪轮状病毒的细胞培养 王鹏雁,陈创夫 (石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003) 摘要:在猴肾传代细胞系(MA-104)上成功培养了猪的轮状病毒.病毒接种前用胰 酶处理且维持液中不含血清,连 续传代后出现明显的细胞病变(cPE):细胞先肿大变圆,边界不清,后聚集,萎缩,直到 死亡脱落. 关键词:猪轮状病毒;细胞培养;细胞病变 中图分类号:$858.258.3;文献标识码:A 轮状病毒属于呼肠孤病毒科(Reovrridase)轮状 病毒属(Rotaviras),主要引起各种幼龄动物非细菌 性腹泻,是一种世界性传染病.RV自1973年Bish. op[IJ研究以来,曾停滞不前,主要障碍是难以在体外 培养,故被称为苛刻的病因.近年在国内外学者的 不断研究中,已成功分离和培养了多种动物的RV. 但是到目前为止,分离成功的多为A组RV,其他RV 毒株迄今未能适应细胞培养l2J.各种动物RV对细 胞的适应性也不相同,猪RV对细胞的适应性介于 中间.我们用胰酶处理猪轮状病毒后,接种MA.104 细胞,在连续传代后出现明显的细胞病变.这为猪 轮状病毒的基础研究和疫苗研制奠定了基础. 1材料与方法 1.1材料 猪粪样来自某猪场7日龄腹泻仔猪.病料用 PBS悬浮后5000r/rain离心30min,取上清冻存于 一 80~C待用. 培养用细胞为猴肾传代细胞系MA.104,来自军 需大学兽医研究所,液氮保存.营养液为MEM (GIBCO公司),pH=7.2—7.4;维持液为无血清的 MEM,pH=7.4—7.6,其中含有12/mL的胰 酶. 1.2方法 1.2.1细胞的复苏从液氮中取出冻存细胞安瓿, 立即投人37—4oqc水浴中摇动,迅速融解,1500— 2000r/rain离心10min后用75%酒精或新洁尔灭 将安瓿消毒,无菌打开盖子将上清弃去,用营养液轻 洗细胞沉淀后加含15%胎牛血清的营养液,37~C, 5%co2中培养,次日更换营养液,待细胞长成单层 时即可传代. 1.2.2?细胞的传代无菌将营养液弃去,加人少量 预温的0.25%胰酶(pn7.4—7.6)消化细胞,镜下或 肉眼见细胞开始脱落时,加人营养液轻吹使细胞完 全脱壁后分装培养.随时观察细胞生长情况,当细 胞长成单层后即可用于接种或冻存. 1.2.3细胞的冻存细胞长成单层且状态良好时, 用胰酶将细胞消化下来,吹打分散后离心去上清留 细胞沉淀,按要分瓶的量加入90%小牛血清,10% DMSO,每安瓿1mL左右,依次在一4cI=,一20cI=,冰 浴中冻结后低温中保存24h以上,置液氮中冻存. 1.2.4病毒的接种病毒的悬液用终浓度10 mL的胰酶37'13作用30rnin后接种MA.104单层细 胞(细胞用无血清的MEM洗2遍),每瓶接种量为 100止,37?,5%C02中静置培养1h后弃去毒液, 每瓶加含有1—2/mL胰酶的无血清MEM培养. 每天观察CPE出现情况,当CPE达到90%以上时收 毒,取其中一部分电镜观察病毒粒子的存在及结构, 一 部分一8ocI=冻存. 收稿日期:2O02.0801 作者简介:王鹏雁(19r71.),女,硕士生,从事动物分子病毒研究. 石河子大学(自然科学版)第6卷 2结果 倒置显微镜下正常的MA一104细胞为上皮细 胞,扁平不规则的多角形,中间有胞核.一般培养 72h即可长成单层.接种RV后培养3天未发现 CPE,但接着传代后开始出现CPE,多次传代CPE变 化为细胞肿大变圆,边界不清,后聚集,萎缩;有的细 胞间有胞浆相连;最后细胞死亡脱落.随传代次数 增加,病变程度加深,CPE出现时间加快.取出现 CPE的培养细胞超速离心电镜下可见典型的双层轮 状的病毒粒子.以上结果照相保存(图1,图2,图 3). 图1正常的MA.104细胞 图2MA-104接种轮状病毒后的细胞病变(a)E) 第4期王鹏雁,等:猪轮状病毒的细胞培养283 3讨论 图3轮状病毒接种MA.104后的细胞病变(C-PE) 猪的轮状病毒发生于世界各地,主要造成仔猪 的腹泻,给猪的生长和生产带来很大的损失.对此 病的治疗效果不佳,仍以疫苗预防为主,而细胞分离 培养的成功与否是疫苗研制的关键之一.1980年 美国Wyatt等将人wa株在无菌仔猪中连续传代后 转于非洲绿猴肾原代细胞培养成功,1981年日本 Sat]等用恒河猴传代细胞系(MA.104)直接从粪便 中分离出RV,1982年澳大利亚的Birch等用非洲绿 猴肾传代细胞(CV.1)分离成功.尽管最初分离的几 个RV株,如牛的Nebraska株和O株都易在细胞培 养中增殖,但在应用胎肠器官培养以及胎肠单层细 胞和胚肾细胞等许多原代或细胞系单层细胞培养物 如牛,猪和人RV时都 分离和增殖其他一些RV时, 不易成功,或增殖率不高,或不易传代.此外,1975 年BanatvalaL4J等将培养的猪肾细胞长成单层接种婴 儿粪便滤液离心沉淀后培养,24h后荧光抗体染色 呈阳性荧光,但是离心沉淀的细胞培养物却呈阴性. 1977年Bryden和1981年Bridger证明离心沉淀物可 以提高RV的阳性分离率,但仍不能使RV在细胞培 养中连续传代.人们还发现,RV体外培养成功与否 固然取决于细胞种类,但更重要的是用胰酶处理细 胞,震荡和培养温度以及粪液中病毒粒子的完整性. ClarktSj等和Bamett【6j等的研究明,胰酶直接作用 于病毒颗粒而不是宿主细胞;Gam[]等认为,胰酶 最初是作用于复制阶段,在胞外环境中直接影响病 毒粒子,从而使非感染性的病毒粒子转变为感染性 的病毒粒子.关于胰酶促进RV感染性的机制,可 能是由于对细胞的直接影响或破坏了病毒增殖的抑 制机制. 我们采用MA一104细胞来培养猪的轮状病毒, 一 方面是因为MA.104细胞是RV生长最适宜的细 胞,另一方面,研究表明除了某些牛,猪轮状病毒外, 其他动物的轮状病毒在细胞物中增殖时一一般不产生 CPE或只产生轻微而不稳定的CPE.实验中首先将 腹泻仔猪粪样用PBS悬浮后低速离心将一些碎片, 大分子物质沉淀,病毒因为分子小而留在上清中,因 此取上清冻存备用. 早期研究中用常规方法培养MA.104很难分离 RV,随着科技发展,对RV的分子生物学研究发现, 用胰酶处理病毒后可以增加病毒对细胞的感染性. 我们采用常规方法培养了MA一104细胞后接种RV 时,一批单层细胞直接接种冻存的病毒上清液,而同 时将病毒悬液用终浓度10tc,/mL胰酶37?作用30 min,后再接种另一批单层的MA.104细胞.另一批 细胞的培养液,维持液相同,37,5%co2条件下培 养,传代.结果在传第2代时,接种用胰酶处理的病 毒的一批细胞出现CPE,而常规培养的则未见CPE. 随着传代次数的增加,CPE表现为细胞肿大变圆,边 界不清,颗粒增多,细胞变暗;有时出现融合灶以及 拉网现象;但仅表现粗糙感,细胞并不脱落. . 有研究_8J表明,在接种病毒后转瓶培养易出现 石河子大学(自然科学版)第6卷 CPE,但我们在实验中发现,采用静置培养,出现 CPE的时间及CPE的程度与转瓶培养结果无太大 的区别,即静置培养完全可以达到一般实验目的的 要求.至于培养温度则仍以37oI=,5%co2条件最 佳. 我们还对接种病毒后采用的维持液做了研究, 即单层MA.104细胞接种用胰酶处理过的病毒后同 时采用常规维持液(含2%血清的MEM)与实验用维 持液(不含血清,但含有1—2t,e,/mI.的胰酶)同样条 件培养.结果发现不含血清,但含胰酶维持液培养 细胞出现CPE的时间要比常规培养的快,而且CPE 的程度也要高c'这可能还是与胰酶作用可以增加病 毒感染力有关. 我们通过实验得出培养猪轮状病毒的最佳条件 为: 1)采用MA.104细胞培养; 2)病毒接种前用终浓度10t,e,/mL胰酶37oI=作 用30rain,病毒接种后37oI=,5%co2静置培养; 3)维持液中不加血清,但含有1—2t,e,/mL的胰 酶. 致谢:本实验得到了军需大学军事兽医研究所 涂长春研究员和余兴龙博士后热情的指导和帮助, 在此向他们表示真诚的感谢! 参考文献: [1]BishopI1F.~imsp,,aic,asinpepithdialcellsduodenalmll— c08afromchildenwithacutegastroenteritis[J].I.,lincet,1973,2: l281. [2]殷震,刘景华.动物病毒学?第2版[M].北京:科学出 版社.1997. [3]SatoK,I瑚蛔Y.1solalion0fttm忍毗incellcultures [J].ArchViml,l987,69:155.160. 【4]BanatvalaJE,Tott~dellB,Chi~eTL,da/.Invitrodetee. 1ion0fhuman忍毗[J].Laeent(1I),1975:821. [5]ClarkSM,BarnettBB.Spen,noveRS.Pl~lCtionofhigh-titer It口twithtryp6i,l[j].ClinlVlieroboil,1979,9:4l3_4l7. 【6]Bm-nettBB,SpencnoveI1S,ClarkML.Effect0fenzylne8Oil 忍毗infectivity[J].JClinlVlicroi~,1979.10.111.113. [7]GrahamDY,EstesMK.Proteolytieenhancement0f忍毗 infectivity:Boologicmeehani~ns[J].Virology,1980,101:432-439. 【8]FukushoA,ShimiziilY.ItoY.IsolationofCytopathic忍蛾 incellrollercultureinthepresenceofa'ryr~in[J].ArchVirol, l981.69:49-60. CdlCIlltureot"PorcineRotavirus WANGPeng-yan,CHENChuang-fu (College0fAnimalScience&Technology,University,Shihezi832003,Claim) Abstract:PorcineRota~/rusWillsculturedsuccessfullyonMA?104cells.Theviruswastreat edbytrypsinbeforeinoculat. ingandtherehadno8el,-ainmaitainInedium.Thecytopathiceffectwasclearlyobservedafter serialpassages:cellround. ing,obscurecellbounary,disintetg~on,cellgranular. AtlastcelldiedanddetachedfiromthegIa. Keywords:porcineRotatirus;cellculture;cytopathiceffect'