阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗广州管圆线虫感染小鼠体液和细胞免疫机制研究

阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗广州管圆线虫感染小鼠体液和细胞免疫研究 阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗广州管圆线虫感染小鼠 体液和细胞免疫机制研究 南方医科大学级博士学位 阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗广州管圆线虫感染小鼠时 体液和细胞免疫机制的研究. 课题来源: 自选 业 称 专 名 免疫学 态 滓 学位申请人 卞?王 师 指 导 教 董文其 答辩委员会主席 朱家勇教授 答辩委员会成员 刘培庆教授 彭 涛教授 罗树红教授 李 明教授 论文评阅人 吴忠道教授 李 华教授 吴英松教授年月日广州博士学位论文 阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗广州管圆 线虫感染小鼠时体液和细胞 免疫机制的研究 博士研究生:李莹 指导老师:董文其 摘要 广州管圆线虫 隶属于圆线虫目、后圆线虫科、 后网线虫亚科、管圆线虫属,由我国学者陈心陶于年发现。其在中间宿主、 转续宿主、终末宿主和自然界中循环迁徙的过程就是其发育、繁衍的过程。 人 摄食生的或未完全熟的中间宿主,或被污染的水和食物可致血管圆线虫病 。感染后虫体迁徙途经的乙状结肠、肝、心、肺、脑等器官 均可能受到损伤,甚至脾、肾等虫体并未接触的部位都有可能因为免疫反应 受 损。患者临床表现多样,主要侵犯中枢神经系统,导致嗜酸粒细胞增多性脑膜 炎、脑膜脑炎、脑脊膜脊髓炎、脑脊膜神经根炎等,也可以累及其他 部位和器官,如肺部、眼部、乙状结肠等,只是发病例数极少。广州管圆线虫 病全球散发,目前已报告多个病例,主要在东南亚及太平洋各岛屿流行, 中国大陆、美洲大陆及加勒比海各岛屿有少量报道。我国以广西、海南、福建、 台湾为主的南方个省份为主要流行区域。 多种淡水螺作为中间宿主在更多地方的养殖和销售,使得广州管圆线虫病 成为我国最具潜在危险的食源性寄生虫病,研究认为广州管圆线虫幼虫入侵中 枢神经系统是其发育的关键阶段,其入侵宿主造成损伤的机制与多种因素有关。摘要 除虫体迁徙引起组织机械性损伤、虫体占位导致组织挤压损伤及颅内高压、虫 体分泌的代谢物质或死亡虫体释放的物质对神经细胞的毒性等外,机体对虫体 的防御、杀伤机制大多与免疫系统有关。据文献报道,广州管圆线虫感染后, 嗜酸粒细胞迅速升高;多克隆细胞激活迅速发生,产生大量、、、 ;体内十、细胞增多;外周血.、.、一、.等 类细胞因子明显升高,而.、、.【等类细胞因子则无明显变化, /细胞因子比例失衡。免疫网络具有复杂性和多重性,淋巴细胞在一定 条件下又可以相互转化,因此仅仅归结为/细胞因子失衡,或许简化了 广州管圆线虫病的发病机制,除了、淋巴细胞参与外,其它亚群淋巴 细胞也很有可能参与了发病。那么与、产生于同一前体细胞,且功能上 有密切关系的亚群是否也参与了广州管圆线虫病的发病呢它 们在发病及治疗过程中有何变化这些问题目前还未见报道。 细胞重要组成部分??辅助细胞,又称天然调节细胞 细胞发育而来,被某些特 ,,由胸腺细胞或外周 异抗原或特定因素激活后,主要通过细胞接触机制和分泌抑制性细胞因子. 和.等方式发挥对/细胞的非特异性抑制效应,在炎症反应中 避免过强的免疫应答造成的机体组织损伤,但如果抑制过度则可能减弱机体抗 感染作用,导致感染迁延不愈。该细胞亚群具有的免疫抑制和免疫无反应两大 特征,在感染免疫、肿瘤免疫、免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维 持机体免疫平衡等方面的作用日益受到关注,成为目前研究最为深入的调节性 细胞。近年来发现多种寄生虫感染过程中都有的参与,目前尚无其在广州 管圆线虫病发病中作用的相关文献报道。 阿苯达唑联合地塞米松是目前我国用用最广泛的广州管圆线虫病治疗方 法。由于对长期大量使用地塞米松可能带来的不良反应的担心,多项研究提出 多种替代治疗方法,但未见与地塞米松疗效的比较研究。甘草酸又称甘草甜 素, 是甘草中的主要活性成分。其中的甾体部分与肾上腺皮质激素结构相似,因此 具有较强的抗炎、抗过敏、解毒等糖皮质激素样作用,而对下丘脑、垂体、肾 博士学位论文 上腺轴无明显影响,故无明显糖皮质激素的不良反应。近年来发现它还具有抗 病毒、抗肿瘤、抑制.及免疫调节等作用。甘草酸可诱导干扰素产生、活 化细胞和自然杀伤细胞、纠正/失衡,从而发挥其免疫调节作用。甘 草酸二铵是甘草酸的二铵盐,具有更稳定的结构和更强的生物活性,据其功能 推测可以使用在广州管圆线虫病的治疗中,或许能代替糖皮质激素的使用,以 减少不良反应的发生。但其是否真能发挥作用疗效如何发挥治疗作用的机 制具体有哪些与嗜酸粒细胞、、/平衡、细胞是否 有关这些问题尚不明确。 本项目拟通过对不同感染时间广州管圆线虫病小鼠模型相关免疫指标的检 测,了解免疫反应在其发病机制中的作用及具体机制;通过对不同方式治疗小 鼠免疫指标的检测及比较,了解治疗机制,进一步认识免疫发病机制在广州管 圆线虫病发病中所占的地位。本项目选取了广州管圆线虫病这一我国最具威 胁 的食源性传染病的发病机制进行深入研究,并拟通过对发病机制的进一步认 识, 找出更有效的治疗方法,具有实际应用价值。具体步骤如下:观察并详细记 录广州管圆线虫感染小鼠模型发病不同阶段的基础状况、临床表现、预后及 生 存时问。较小鼠感染后发病不同阶段外周血、脑脊液中嗜酸粒细胞比例、、 、、、.、水平。比较小鼠感染后发病不同阶段外周血 亚群数量及其中表达。从比较结果中认识体液免疫、嗜酸粒细胞、 炎症反应、细胞和组织病理变化在广州管圆线虫病发病中的作用。分 别以阿苯达唑联合地塞米松和阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗感染 小鼠,观察以上指标,探讨甘草酸二铵的治疗作用和可能机制。 通过实验优化了用以获取广州管圆线虫的人工消化法,最优实验流程为: 人工消化液中含胃蛋白酶,?消化小时后,过滤去除组织碎屑,以 洗涤滤液次,自然沉淀后收集沉渣中幼虫。以条广州管圆线虫感染期幼虫 成功建立广州管圆线虫病小鼠模型。初步观察到模型小鼠约自开始逐 渐出现毛发湿润、脊柱后凸、偏瘫和打转等体征,持续并到约全部死亡, 确定生存时间、体征和体重作为疗效观察指标。以外周血嗜酸粒细胞和的观 摘要 察确定和两个观察时间点;通过多个脏器的病理改变的观察,确认脑 部是做显著病理损伤的部位,出现脑膜炎、蛛网膜下腔出血、炎症,嗜酸粒细 胞广泛浸润,适宜用于疗效观察。实验观察感染和、治疗小鼠生存时间、 体重和外貌体征,发现治疗能够治愈部分小鼠,使其生存时间延长、体重恢 复、体征缓解,但对其余大多小鼠并不能改变死亡预后,只能稍延长生存时 问, 并不能改善体重减低和体征出现;疗效优于治疗,能够治愈全部小鼠, 使其生存时问延长、体重恢复、完全不出现脊柱后凸、偏瘫和打转等严重体 征, 毛发湿润延后出现但能很快恢复。观察感染小鼠和、治疗小鼠和 时体征、嗜酸粒细胞比例、、、、、、、、?丫/ .、、和细胞比例、颅内虫数、脑 部病理变化,发现:小鼠感染后外周血和脑脊液嗜酸粒细胞比例升高,和 治疗都能抑制外周血和脑脊液嗜酸粒细胞,但停药后脑脊液嗜酸粒细胞 比例反跳;小鼠感染后血清和脑脊液、、、升高,能抑制 血清和脑脊液、脑脊液、血清和,停药后均反跳;治疗与 一样可以抑制脑脊液,甚至能够更好抑制血清和脑脊液和脑脊液 ,但对脑脊液无影响;小鼠感染后血清和脑脊液.和升高, 治疗能够抑制血清、脑脊液中的一和,停药无反跳,治疗不能 抑制血清.和,甚至使得水平高于感染组,但能较更好抑制脑脊 液.和;小鼠感染后血清和脑脊液吖和..降低, 治疗能够恢复血清、脑脊液中的吖和?/一,停药后仍继续恢复, 治疗能更好恢复血清、脑脊液吖和./.;小鼠感染后外周血 细胞比例升高、和细胞比例无变化, 治疗与治疗一样能抑制这三种细胞的比例;上述指标中与体征出现和 加重关系最为密切的是脑脊液嗜酸粒细胞比例、血清和脑脊液水平、外周血 . 细胞比例,嗜酸粒细胞、、、相互间关系密切, 与关系密切,吖和一丫/一与嗜酸粒细胞比例、、、. 和负相关,外周血细胞比例与关系密切, 博士学位论文 和细胞比例间关系密切;感染小鼠脑部病理变化多样,以 脑膜水肿,嗜酸粒及其他炎症细胞浸润和蛛网膜下腔嗜酸粒细胞浸润最为典型。 能缓解部分小鼠的脑部病理损伤,其余则轻度改善;能够更好改善全部 小鼠脑部病理损伤。 总结以上结果,推测广州管圆线虫病体液与细胞免疫发病机制如下:广州 管圆线虫感染后虫体代谢分泌抗原及被杀死后释放的组织抗原激活抗原提呈细 胞??淋巴系树突状细胞,两者共同作用选择性活化细胞。活化的 细胞介导体液免疫分泌免疫球蛋白的同时,分泌特异细胞因子,趋化嗜酸粒细 胞进入虫体入侵组织。在免疫球蛋白的协助和活化作用下,嗜酸粒细胞发生脱 颗粒,杀伤虫体。过强的应答和嗜酸粒细胞分泌性毒素除杀伤虫体外,还 可能造成宿主组织损伤。幼虫在进化过程中产生了抑制宿主免疫反应从而保 护 自身延长寄生时问的能力,虫体某些抗原激活的同时,另一些进化了的分 泌性抗原或通过死虫释放的抗原激活了另一群树突状细胞。在外周血特殊 细胞因子的共同作用下,激活细胞,细胞发挥广谱免疫抑制作 用,使应答被控制在适度的程度,免疫球蛋白的合成和细胞因子的释放都 被抑制,嗜酸粒细胞的趋化和杀伤作用就被适度抑制。另外,虫体某些抗原在 体液免疫整体被抑制的同时,能够激活一些非特异性细胞克隆,产生大量非 特异性,以封闭嗜酸粒细胞上的受体,进一步抑制嗜酸粒细胞杀虫作用。 这些抑制作用的结果就是宿主对虫体的杀伤作用减低,但又不是完全无应答, 这样就使幼虫不被过多杀死,宿主也不会由于杀伤能力太弱致虫数过多消耗过 大而死亡;同时免疫反应对宿主机体造成的损伤减轻,这样就不会由于针对虫 体的免疫反应过于强烈导致宿主死亡。最终目的是使得宿主在带虫的同时能够 更长时间、更好的存活,有利于虫体长期寄生。和都对广州管圆线虫病 有治疗作用,疗效更好。阿苯达唑杀死幼虫,活虫抗原诱发的的激活减 少,待己激活的代谢减少后体液免疫、应答和活化均减轻,但用 药后死亡虫体却可能释放抗原物质引发不同的免疫应答,这一应答除包括激活 应答、体液免疫甚至应答外,似乎并不抑制应答。地塞米松这时 摘要 发挥免疫抑制作用,除应答以外,地塞米松还可以直接抑制嗜酸粒细胞、 体液免疫、应答和,或许还可能通过增多来进一步抑制应答, 同时恢复血脑屏障功能。但这一抑制作用使得免疫损伤减轻的同时,不利于残 存活虫的杀伤,且地塞米松直接诱导免疫细胞凋亡发挥抑制作用,并不清除抗 原,故天疗程结束后残存活虫分泌抗原和尚未完全清除的死虫抗原仍能引发 免疫反应,导致嗜酸粒细胞、免疫球蛋白和反跳。可能由于反跳后的 抑制作用,应答并没有反跳,但少了地塞米松的抑制,迸一步回升, 厂因此回升。虽然具体机制不明,但甘草酸二铵与阿苯达唑联合治疗可能 具有更好的杀虫作用,待已活化的代谢清除后,活虫分泌抗原引发的嗜酸粒 细胞、体液免疫、和应答都将更轻微,但死虫抗原诱发的免疫反应却 可能更早、更强烈或时间更长。而甘草酸二铵是通过增加,改善/平 衡来抑制应答的,故作用缓慢而持久,时虽有作用但还不足以完全抑 制,已经逐渐恢复。停药后在残余抗原物质的刺激下,进一步回升, 也有反跳,使逐渐降低,/恢复。两种治疗对的作用没有 差异,具体作用机制还有待迸一步实验验证。甘草酸二铵或许能够更好恢复血 脑屏障功能,使得脑脊液中各项免疫指标都有较好恢复。总之甘草酸二铵联合 阿苯达唑用于广州管圆线虫病的治疗时疗效好于地塞米松联合阿苯达唑,其 作 用机制可能与更好的杀虫作用和血脑屏障功能恢复和免疫抑制有关。 本研究进一步深化了对广州管圆线虫非适宜宿主免疫发病机制的认识;找 到一种更好的治疗方式,并探讨了它的治疗机制,为临床治疗提供了依据。 关键词:广州管圆线虫调节性细胞甘草酸二铵地塞米松阿苯达唑免疫反应 博士学位论文 . : .圮 似. , % . , ,, . ,,,., , ,, . . ,,,,. . ., ,,, . . 南 .. .,. :。’’。 ,,. . , ;,,,; , ,十 ;?,?,一,一 ,?,吖 仃’ .,胞. . , 十/十? ?.;,. , ,嘶 , , , , 黟心 .,. . . . . , , 一 . 】, ,仃 / , . 彳?,.脏 ? ,,/, . 彳.册加,,给括 ., .骶:/ , .舯.,,,,.,面. 陀 船 . , ,. 砒 .. .、:、鹤 ,, , ?, ,. 哪麟 砥 ? . . . ,,, , 嬲廿 咧 ’ . 廿 璐 , , , . , , , , ,, . , , , . ,,,,,一,,丫’/一, , , , ,, . . , .,,, . , , , , ; . , . ; , . 吖/ . , .十十, . ., , ,,.. 吖/ ,, .十 ,,,一,十 . 博士学位论文 , .,; .. : ,.,.., , ., ., . ,. ,. , ,,,,. , ,, . . . , . . ,. . , , , ,, ,. , ’。 , ,, ,, , , , .. . . ? , ,, , . , , ,, .田 厂 ., ,, . , ,,, . 博士学位论文 目 录 摘要??.. 第一章 前 言?。 第二章材料与方法第一节实验设计 第二节研究方法??.. 第三节实验涉及的试剂与仪器??. 第四节数据收集和统计? 第三章结果与结论第一节广州管网线虫感染小鼠模型的建立. 第二节小鼠感染和治疗中生存时间、体征和体重改变的观察?. 第三节 小鼠感染和治疗中机体免疫反应及损伤的检测?. 第四章讨论?. 第一节广州管圆线虫病概况. 第二节广州管圆线虫病体液与细胞免疫发病机制. 第三节阿苯达唑联合地塞米松和阿苯达唑联合甘草酸二铵两种治疗的疗 效及其对广州管圆线虫病相关免疫指标的影响?. 全文小结? 参考文献. 综述??..? 附 录 附录. 成果??目 录 致 谢 原创性声明 统计学证明??州管圆线虫 虫亚科,管 转续宿主、 虫在鼠肺动 间宿主转续 动物或饮用 幼虫受污染的水和食物,幼虫穿过宿主肠壁进入血流,经肝、心到肺和中枢系 统继续发育。在大鼠等适宜宿主中童虫经静脉再回到鼠肺内发育成成虫;而 在 人体内,其生活史大多止于中枢神经系统,只有个别病例报告在病人肺内发 现 成虫。人摄食生的或未完全熟的中间宿主或被污染的水和食物可致血管圆线虫 病【】。感染后虫体迁徙途经的乙状结肠、肝、心、肺、脑等 器官均可能受到损伤,甚至脾、肾等虫体并未接触的部位都有可能因为免疫反 应受损。患者临床表现多样,主要侵犯中枢神经系统,导致嗜酸粒细胞增多 图.广卅管圆线虫生活史【】 . 第一章前言 性脑膜炎、脑膜脑炎、脑脊膜脊髓炎、脑脊膜神经根炎等,也可以累 及其他部位和器官,如肺部、眼部、乙状结肠等,只是发病例数极少。广州管 圆线虫病全球散发,目前已报告多个病例,主要在东南亚及太平洋各岛屿 流行,中国大陆、美洲大陆及加勒比海各岛屿有少量报道。我国以广西、海南、 福建、台湾为主的南方个省份为主要流行区域,近年来也有多次爆发事件。 它涉及到的食品安全等公共卫生问题不可小视,甚至对旅游业也会造成影响。 ,、一鬈篱忑?誊。‘?。?,名 /。‘ ’.’ 、. 受,一?. 卷蛳钿” ??““,一。气’:?。....:蒸 ‰ 二势;二渺科哼茕?妒 。一。 ‰一他 。? 。~毛. . ,, ?‘,.啊?州蛐 五,? 一、、 ’? 。 ?、一’??., 一~‘??立奠‘。‰写 ‖。二??穹了‘ ’色 阜蠹四 图广州管圆线虫病世界分布【】 .多种淡水螺作为中间宿主在更多地方的养殖和销售,使得广州管圆线虫病 成为我国最具潜在危险的食源性寄生虫病。关于广州管圆线虫及其所致疾病的 研究也逐渐增多。而现有文献大多有关流行病学调查,关于致病机制和药物治 疗等基础理论方面的研究相对较岁刀。目前认为广州管圆线虫幼虫入侵中枢神经 系统是其发育的关键阶段,但对其入侵宿主造成损伤的机制目前尚不十分明确, 认为是多种因素共同参与的结果。在中枢神经系统受损的机制中,血脑屏障 功 能障碍和中枢神经系统功能障碍是两个关键机制。在广州管圆线虫感染的 博士学位论文 /小鼠模型中观察到脑脊液中的总蛋白、白蛋白、白细胞数、总蛋白和白 蛋白的脑脊液/血清比值都有升高,提示血脑屏障渗透性增高,据此认为广州管 圆线虫感染时存在血脑屏障功能障碍。虫体移行破坏、蛋白水解酶溶解毛细血 管基底膜、血管内皮因子增加内皮通透性等机制可能导致血脑屏障的损伤。广 州管圆线虫是一种嗜神经性线虫,生活史中选择性迁徙至宿主的神经系统,并 在其中发育和长期寄生,宿主神经系统在幼虫发育中起到至关重要的作用。虫 体在中枢神经的寄生导致严重的神经功能紊乱,临床表现为中枢神经系统多种 急慢性炎症及损伤。除虫体移行、占位造成机械损伤外,免疫因素作用重大。 首先,虫体抗原性物质可导致多种炎性细胞浸润,炎性细胞聚集后分泌大 量炎性因子,产生炎症反应,对脑组织造成损害,致其水肿、充血,一些炎性 因子甚至导致脑组织细胞的中毒反应。嗜酸性粒细胞作为该病炎症反应的效应 细胞,在脑脊液中升高的嗜酸性粒细胞趋化因子及其受体等因素共同作用 下, 大量进入脑和脊髓【,。聚集的嗜酸性粒细胞释放多种颗粒蛋白,除嗜酸粒神 经 毒素、嗜酸粒阳离子蛋白、嗜酸粒蛋白等导致普肯野氏细胞退化外,磷脂酶 参与破坏虫体表面【】,嗜酸粒过氧化物酶导致宿主神经系统综合型。嗜酸 性 粒细胞引起脑损伤的机制还有可能与细胞因子激活的刚虹、和/或氧化应 途径等有判引。 激激活的/、和/或表达增加激活的? 其次,广州管圆线虫感染时,小鼠细胞亚群发生变化。在感染后的第周 细胞开始升高,第周细胞开始升高,然后逐渐下降;用特异性单抗去 除小鼠的后,再使其感染,发现小鼠体内虫数明显增多;在十细胞中, 外周血细胞因子检测发现感染后.、.、.、.等类细胞因子明 显升高,而.、丫、.【等类细胞因子则无明显变化;不仅是在 血清,在脑脊液、脾细胞和颈部淋巴结细胞培养上清液中,类细胞因子反应 都占优【,】。型细胞因子.在诱导嗜酸性粒细胞增多及杀死广州管圆线幼 虫过程中起重要作用。富含.的.转基因小鼠感染后,嗜酸性粒细胞迅速 且显著地升高,对幼虫的攻击强烈;而.缺陷而致.无功能的小鼠感染 后,嗜酸性粒细胞不升高,对幼虫没有攻击作用。因此认为感染后脾脏和脑脊 第一章前言 液中的细胞分泌.,能诱导脑脊液中的嗜酸性粒细胞升高,并参与对虫体 的杀伤机制。阻断了.反应,就抑制了宿主嗜酸性粒细胞增高反应及杀虫效 应【?。但仅仅将广州管圆线虫病的免疫发病机制归结为失衡,或许过度 简化了广州管圆线虫病的发病机制。免疫网络具有复杂性和多重性,淋巴细胞 在一定条件下又可以相互转化,提示除了、淋巴细胞参与外,其它亚群 淋巴细胞也很有可能参与了发病。此外,感染个体发生多克隆细胞激活, 外周血和脑脊液中产生大量、、、】,并通过以下途径引起虫体 及宿主损伤:中和分泌性抗原或与虫体组织抗原结合介导对虫体的杀伤作用, 该过程还可能存在补体的调理作用;在循环、肺部、甚至中枢神经系统中发 现了补体【,经典补体途径被激、活【”,在局部产生细胞毒性反应;补体活化过 程中产生的炎性介质,如、、等还可能参与循环和局部炎症反应的 发生机制。 阿苯达唑早已常规应用于广州管圆线虫病的治疗中。阿苯达唑是苯并咪唑 的一种衍生物,能够结合虫体一微管蛋白并抑制其聚合,从而减少其葡萄糖摄 取,能有效杀死广州管圆线虫。但在虫体死亡过程中释放的大量炎性物质除自 身能导致局部炎症损伤外,也能趋化其他炎症活性物质参与炎症发生。因此单 用阿苯达唑治疗广州管圆线虫病时,部分个体出现严重的并发症。兔感染广州 管圆线虫后,阿苯达唑杀虫治疗组与非治疗组相比,无论是组织病理学还是核 磁共振检查,中枢神经系统病变都更明显【】。为抑制这种并发的炎症反应,阿 苯达唑联合地塞米松在国内已被广泛应用于广州管圆线虫病的治疗。但地塞米 松的长期、大量应用可能带来多种副作用,如:医源性库欣综合征面容和体态、 体重增加、并发感染、易出血倾向、低血钾综合征、胰腺炎、消化性溃疡或穿 孔、青光眼、白内障、良性颅内压升高综合征、糖耐量减退等,停药时还可能 有低热、食欲减退、恶心、呕吐、肌肉或关节疼痛等停药综合征表现。如停药 时炎症尚未完全控制则可能出现免疫反跳情况。因此,很多研究一直在寻找能 够抑制炎症反应的其他药物。黄芩、茵陈散和龙胆泻肝汤作为中草药被认为具 有抑制炎症作用而与阿苯达唑联用于广州管圆线虫病,起到良好治疗效果,但 博士学位论文 并无与地塞米松联用阿苯达唑疗效比较的资料。 细胞重要组成部分一辅助细胞,又称天然调节细胞 细胞发育而来。该细胞 ,,由胸腺细胞或外周 亚群具有的免疫抑制和免疫无反应两大特征,被某些特异抗原或特定因素激活 后,主要通过细胞接触机制和分泌抑制性细胞因子?和?等方式发挥 非特异性抑制效应,在炎症反应中避免过强的免疫应答造成的机体组织损伤, 但如果抑制过度则可能减弱机体抗感染作用,导致感染迁延不愈;免疫无能性 则表现在对多种免疫刺激呈无应答状态,也不分泌.。在感染免疫、肿瘤 免疫、免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡等方面 的作用日益受到关注,成为目前研究最为深入的调节性细胞。近年来细 胞参与寄生虫发病的报道逐渐增多,目前尚无其在广州管圆线虫病发病中作用 的相关文献报道。甘草酸又称甘草甜素,是甘草中的主要活性成分,其中的甾 体部分与肾上腺皮质激素结构相似,因此具有较强的抗炎、抗过敏、解毒等糖 皮质激素样作用,而对下丘脑、垂体、肾上腺轴无明显影响,故无明显糖皮质 激素的不良反应。近年来发现它还具有抗病毒、抗肿瘤、抑制及免疫调 节等作用。甘草酸可诱导干扰素产生、活化细胞和自然杀伤细胞、纠正/ 失衡、甚至抑制细胞,从而发挥其免疫调节作用。据其功能推 测甘草酸可以使用在广州管圆线虫病的治疗中,或许能代替糖皮质激素的使用, 以减少不良反应的发生。但其是否真能发挥作用疗效如何发挥治疗作用的 机制具体有哪些与嗜酸粒细胞、免疫球蛋白、/平衡、 细胞是否有关这些问题尚不明确。 本研究通过对感染及阿苯达唑联合地塞米松、阿苯达唑联合甘草酸二铵两 种治疗过程中多项体征与免疫指标的观察,初步了解免疫因素如何参与广州管 圆线虫病发病机制及甘草酸二铵疗效和作用机制。本研究选取了广州管圆线虫 病这一我国最具威胁的食源性传染病的发病机制进行深入研究。随着全球气候 变暖、世界范围内物种交流的加快,这一疾病的分布范围逐渐增加,同时对食 品安全和旅游业的影响不容轻视。而这一疾病关于发病机制的研究报道较少, 第一章前言 不明确之处又多。本项目拟通过对免疫发病机制的研究,探讨和完善该病发病 机制的认识,从而找出更有效的治疗方法。 博士学位论文 第二章材料与方法 第一节实验设计 一、研究内容指标 观察是否参与广州管圆线虫病发病机制,在治疗广州管圆线虫病时阿 苯达唑联用甘草酸二铵是否与阿苯达唑联用地塞米松具有类似的疗效,其中 机 制是否与嗜酸粒细胞、类血清因子和细胞亚群有关。 .观察并详细记录广州管圆线虫感染小鼠模型发病不同阶段的基础状况、 临床表现、预后及生存时间。 .比较小鼠感染后发病不同阶段外周血、脑脊液中嗜酸粒细胞比例、、 、、、、、?、/一比值、外周血亚群 数量及其中表达水平。 .观察各项免疫指标相互关系及其与体征的关系。 .从结果中进一步认识嗜酸粒细胞、体液免疫、炎症反应和细胞 在广州管圆线虫病发病中的作用。 .分别以阿苯达唑联合地塞米松和阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗感染小 鼠,观察以上指标。探讨甘草酸二铵的治疗作用和可能机制。 第二章材料与方法 二、技术路线实验流程图? 图.实验流程 ?..广州管圆线虫感染小鼠模型的建立 首先优化从宿主螺获得虫体的人工消化法。方法成熟后以条和条广 州管圆线虫幼虫分别灌胃感染只小鼠,称为模型组和模型组, 空白对照只。观察记录外貌和行为的变化、体重变化和生存时间;分别 于感染前、感染后、、天外周血涂片计数嗜酸粒细胞比例,收集血清冻 存,后检测;感染后天每组处死只小鼠,取脑、肝、脾、乙状结肠等 脏器做石蜡切片染色观察病理变化。 .小鼠感染和治疗中生存时间、体征和体重改变的观察博士学位论文 只小鼠每组只随机平均分入组,空白组、模型组、阿苯 达唑联合地塞米松治疗组和阿苯达唑联合甘草酸二铵治疗组 。以每只小鼠条广州管圆线虫感染期幼虫灌胃感染,组以 代替。于感染后第天开始灌胃给药,连续给药天,组给阿苯达唑 //和地塞米松.//,组给阿苯达唑//和甘 草酸二铵//,组以代替。观察外貌和行为的变化至感染后 天实验结束,不采集标本。 .小鼠感染和治疗中机体免疫反应及损伤的检测 据预实验结果,只小鼠每组只随机平均分入组:空白天组一、 空白天组.、模型天组.、模型天组.、阿苯达 唑联合地塞米松天组.、阿苯达唑联合地塞米松天组 .、阿苯达唑联合甘草酸二铵天组一、阿苯达唑联合 甘草酸二铵天组.。小鼠感染治疗同上。.、.、 .和.在感染后天乙醚麻醉后心脏穿刺放血处死,一、 .、.和.在感染后天处死。外周血和脑脊液沉渣涂片 计数嗜酸粒细胞比例,收集血清和脑脊液上清冻存,后检测、、、、 .、和吖;同时收集抗凝全血流式检测细胞。感染后天处 死的每组只小鼠,随机只取脑部检测脑内虫数,另只取脑进行病理检测。 第二章材料与方法 第二节研究方法 一、广州管圆线虫的获取 从南方医科大学公共卫生学院病原生物学系获得广州管圆线虫感染后周 的褐云玛瑙螺变种??白玉蜗牛。以人工消化法获得期幼虫。分离并收集螺 肉,剁碎成泥状,加入人工消化液消化,以目筛网过滤,收集滤液,沉淀 分钟,洗涤沉淀次后取沉渣镜检,收集广州管圆线虫期幼虫,保存于 生理盐水中,内用以感染小鼠。对各实验条件胃蛋白酶用量、消化温度、 消化时间、沉淀洗涤液种类和沉淀收集方法进行优化。 二、广州管圆线虫感染小鼠模型的制作 选取/小鼠.周,雌性,体重约?为研究对象,禁食水 小时后,吸取保存幼虫的生理盐水灌胃感染小鼠。 三、感染小鼠外貌和体征的观察和记录 据预实验结果,小鼠感染广州管圆线虫的过程中会逐渐出现毛发湿润、脊 柱后凸、偏瘫、打转和狂躁等表现。判别如下: 毛发湿润:全身毛发不光滑,成绺。 . 脊柱后凸:站立和行走时胸腰段脊柱向后凸出。 偏瘫:站立时向一侧偏斜,行走时一侧肢体无力,或出现侧翻。 打转:提尾悬空时自发身体水平旋转。 狂躁:在笼内间断高速运动,开笼盖自行跃出。 详细记录每只小鼠的外貌和体征改变及出现时间;记录数据采集时间和死 亡时间。 四、脑脊液样液收集 小鼠处死后小心打开颅腔,完整移出脑部,放入培养皿中,以 充分冲洗颅腔,脑表面和各脑室。收集冲洗液,以离心分钟,取 上清冻存,称为“脑脊液样液”,本研究中代表脑脊液。 博士学位论文 五、嗜酸粒细胞计数 新鲜外周血或脑脊液样液沉渣重悬液山,滴于载玻片,推成薄层涂片,晾 干。以瑞氏染液浸染分钟后以稀释的染液复染分钟,水洗,晾干。 倍显微镜下计数每个白细胞中嗜酸粒细胞的个数。 六、检测 以双抗夹心法检测、、、、、和?。实验方 法如下: .、、、检测根据试剂盒说明书进行操作 包被:包被抗体每稀释到包被稀释液成包被液。每孔加山包 被液。,过夜。洗板次。 封闭:封闭液每孔加.。,。洗板次。 加样:取标准品/.加入管稀释液.中,管混匀后 取加入管稀释液.中,管混匀后取加入管稀释液 中,以此类推,管混匀后吸弃.,管只加稀释液.;./ .加入管稀释液.中,管混匀后取.加入管稀释液中, 管混匀后取加入管稀释液中,以此类推,管混匀后吸弃, 管只加稀释液.;./.加入管稀释液中,管混匀 后取.加入管稀释液中,管混匀后取.加入管稀释液 中,以此类推,管混匀后吸弃.,管只加稀释液.;./ 山加入初始管稀释液.中,初始管混匀后取加入管稀释液. 中,管混匀后取.加入管稀释液.中,管混匀后取加入 管稀释液中,以此类推,管混匀后吸弃,管只加稀释液.: 所有样品据预实验结果稀释: 倍、 倍、 倍、 倍,超出检测范围的样品改变稀释倍数重新检测。标准品样品分别每孑加., ,.。洗板次。 ,洗板次。 二抗:二抗:稀释,每孔加.,第二章材料与方法 ~。 显色:取显、显等量,混匀,每孔加,锡纸包裹, 终止:取终止液,每孔加。 测定:在波长下测量各孔的吸光度值值。测定应在加终止液 后以内进行。 计算:以标准品值为值,标准品浓度为值,取双对数后曲线拟合, 得到标准曲线及直线回归方程,以样品测得值推算出样品浓度。 ..、检测根据试剂盒说明书进行操作 加样:取标准品?/、/ 加入管稀释液 .中,管混匀后取加入管稀释液中,管混匀后取加 入管稀释液山中,以此类推,管混匀后吸弃,管只加稀释液。 血清样品稀释倍,脑脊液样液样品稀释倍。每孔加样.,,, 洗板次。 二抗:每孔加入酶标试剂。。,,洗板次。 显色:每孔先加入显色剂斗,再加入显色剂,轻轻震荡混匀, 避光显色分钟。博士学位论文 显色:每孔加入 “,轻轻震荡混匀,。避光显色。 终止:取终止液,每孔加入.。 测定:在波长下测量各孔的吸光度值值。测定应在加终止液 后以内进行。 计算:以标准品值为值,标准品浓度为值,取双对数后曲线拟合, 得到标准曲线及直线回归方程,以样品测得值推算出样品浓度。 七、流式细胞术检测细胞根据试剂使用说明书进行操作 取 抗凝全血标本于试管中,加入抗. .上,抗. .,,。加入预冷混匀洗涤,离心,吸弃 上清。 将/原液加入稀释液稀释至 /工作液,每管加入 现配的/工作液,震荡重悬,?,.。 将 原液加入稀释液稀释至 ,每管加入现配的 ,离心,吸弃上清。重复次,加预冷, 重悬。 加/ ., 。不洗,直接加入抗 ,?,。 加入现配的 ,离心,吸弃上清。重复次。 重悬细胞,上机检测。 以 以 分析流式细胞数据。 八、病理切片的制作及染色 取材:小鼠处死后收集脑、肝、脾、乙状结肠组织,切成... 以内的小块。 固定:用%中性甲醛固定。 洗涤与脱水:流水冲洗,依次浸泡于%、%、%、%、%、 %、%、%酒精各。 透明:两次浸泡于二甲苯各。 第二章材料与方法 浸蜡与包埋:三次浸泡于石蜡各。在包埋机上包埋为蜡块。 切片:在切片机上切为薄片,浮于温水中左右。 贴片与烤片:将蜡片于温水中展平后,捞至玻片上铺正,将载玻片。烤 干。 染色:切片脱蜡、水化、染色、脱水、透明均在脱水机中完成。二甲苯 透明后,迅速擦去周围多余液体,滴加适量滴中性树胶,以洁净盖玻 封博士学位论文 第三节实验涉及的试剂与仪器 一、所用溶液配制 ., ., ., .,加 . ,调到.,定容至,高压灭菌室温保存。 人工消化液 ,缓慢加入浓 ,胃蛋白酶,混匀。 ., .,加 ,调到.., 稀释的染液 定容至。取该液加原液,混匀, 常温保存。 包被液. .加至,?保存。 ,混匀成 液。 液, ., 封闭液 ,混匀成。. , ., ,混匀,即刻使用。 ,稀释液 ,混匀,即刻使用。 , . 洗液 , ,混匀,常温保存。 液:四甲基联苯胺,无水乙醇或, 补充定容至,保存。 显色液 液:. .,柠檬酸., .,加 ,调到.~.,定容至,保存。 终止液 蒸馏水.,逐滴加入浓硫酸%.,常温保存。 二、所用试剂和药物 . . : 瑞氏染液 广州市外显子生物技术有限公司 吉姆萨染液 广州市外显子生物技术有限公司 . ,..,. 一,. . . ,. ,. 第二章材料与方法.? 深圳市达科为生物技术有限公司 丫 一.. . ,. . ... ,. ? 一 .. ,. / ... ,. 一.. ,. .. ,. ... ,. . 阿苯达唑片 中美史克 甘草酸二铵胶囊 江苏正大天晴药业股份有限公司 三、所用仪器倒置显微镜 低速离心机 . 长沙湘仪离心机仪器有限公司沈板机 ,. .. 电热恒温培养箱 黄石市恒.中医疗器械有限公司 酶标仪 ,. . 流式细胞仪切片机 ,.包埋机 ,. 脱水机,. . 电热恒温干燥箱 海尔集团 博士学位论文 第四节数据收集和统计分析 实验数据以.处理。平均值以:表达。.认为差异有 比较基线体 显著性。动物随机分组由完成,分组后以. 重的组间差异。以.法绘制各组生存曲线,组间生存时间比较采用 生存分析;体重比较采用重复测量数据方差分析,组间多重比较采用 ,组间多重比较采 :体征出现和持续时间比较采用. 用。预实验嗜酸粒细胞比例和血清水平为重复测量数据,比较采 用重复测量数据方差分析,组间多重比较采用;实验嗜酸粒细胞比 例、血清、、、、一、和吖水平和 细胞数为析因分析数据,比较采用析因分析方差分析,组间多重比较采用 ,组间多重比较采用。 。脑内虫数比较采用. 第三章结果与结论 第三章结果与结论 第一节广州管圆线虫感染小鼠模型的建立 既往文献报道中关于广州管圆线虫获得方法各实验条件并不统一,小鼠的 感染虫数也不尽相同,且很少有感染过程中小鼠外貌体征的观察。为熟悉实 验 方法,优化实验条件,初步观察小鼠外貌体征变化进行预实验,同时挑选体液 免疫中与寄生虫感染关系密切的和寄生虫感染的主要效应细胞嗜酸粒细胞 占白细胞的比例进行检测,初步观察小鼠感染广州管圆线虫后免疫反应。/ 小鼠只,随机平均分为组,每组只。基线体重无差异表.。制作 观察表,详细记录每只小鼠体征变化,记录标本采集和死亡时间,不同时间采 集标本进行检测表.、.。 表..小鼠基线体重比较 . ?:., . 表.小鼠观察记录表 .. 口外周血涂片、收集血清:回收集抗凝全血;一脑脊液涂片、收集脑脊液样液、 组织标本。 博士学位论文 口外周血涂片、收集血清:?收集各组织标本。 一、人工消化法的实验条件优化结果 人工消化法【?,即人工模拟胃内环境消化螺肉,获得广州管圆线虫的方法。 具体方法是:粉碎螺外壳,分离出螺肉并剁碎,以:比例加入人工消化液, 消化后过滤去除螺组织碎屑,滤液洗涤后收集幼虫。既往文献中关于人工消 化 液配方、消化条件、洗涤液及收集方法均不尽相同。本实验优化了这些不明 确 的实验条件表.。人工消化液中含胃蛋白酶,。消化小时后,过 滤去除组织碎屑,以洗涤滤液次,自然沉淀后收集沉渣中广州管圆线虫 感染期幼虫,以此方法能更快得到更多活性更好的幼虫。 表.人工消化法实验条件优化结果.?:每人工消化液含有浓盐酸,纯水,及胃 蛋白酶。 二、小鼠外貌体征观察结果 观察不同感染虫数感染小鼠生存时间、体重变化和外貌体征变化趋势,结果 如下。由于和组天后均删失,故无法检验三组间生存时间差异的显著 。 性。但从组短期内全部死亡的结果看生存时间短于和组图 因组不表现体征,故无法检验三组体征出现及持续时间差异的显著性,如仅 第三辛结果与结论 比较与两组,见组体征出现时间提前.,但体征持续时 间无差异.图. 、表.。具体来看,组小鼠约自 先后出现毛发湿润、脊柱后凸、偏瘫、打转等体征,但在左右自愈,未见 后遗症,全部存活超过天,生存时间与正常对照组相似。组小鼠提前 自左右出现毛发湿润、脊柱后凸、偏瘫、打转等体征,并持续到全 部死亡,生存时间缩短图. ,其中只时出现狂躁,数据未计入 表.。、, . ?? 。丕 ? 刁 ? 一零可:西芑山?。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。’。。。。。’。。。。。。。。。。。。。。。’。。。。。’。。。。。’。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。’。。。。。。。。。。。’。。。。。。。。。。。。。。’’。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。’。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。’。。。。。。。。。。。。 博士学位论文 表..不同虫数感染小鼠生存时问和症状出现持续时间比较 .叩 ?矛?????面??百?????话丁一 ??? . ???? :?????????????? ???????????? .. . . . . . ?? . . . . . ..轴 . . . . . . . . . . . . . .?? . . . . . . ?? . . . . . . ?? ??? . . . . . . ?? ..’.?. . . ‘。‘:。。。。‘。。‘。。。。。‘‘。。。。。。。。。’。。。。。。‘。‘‘。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。 ‘。。。。。‘。。。。。。。。。。。。。。。?? 。。。。。。??。。。。。。。。。。。。。‘。。。。‘。。。。。??‘。。。。。。。。 比较三组体重时,以最后一次的测得值暂时代替缺失值,以重复测量方差 分析处理数据,见、和三组问差异显著.,组间两两比较 见与无差异.,低于和.表.;随 感染时间延长小鼠体重先升高后降低.;时间与分组之间交互效应显 著,即两组在不同时问体重变化的趋势不同.表.、图。具 体来看,空白小鼠体重逐渐升高,小鼠体重在正常范围波动,而小鼠体 重自开始进行性减低直至死亡。自以上生存时间、体征和体重的比较中看 出,与之间多项指标相似,而则与和不同,因此为更好 的广州管圆线虫病模型。第三章结果与结论 表.不同虫数感染小鼠体重多重比较 . . ?: . 表..不同虫数感染小鼠体重比较 .?. .? .吟 .? . .?? ‘ ,.,... ? . 博士学位论文 兰 善 重 委 目 图..体重比较轮廓图?.三、不同虫数感染小鼠外周血嗜酸粒细胞比例和水平 比较结果 . 感染小鼠外周血嗜酸粒细胞比例比较结果 初步观察不同感染虫数外周血嗜酸粒细胞比例变化。以最后一次测得值暂 时代替缺失值,以重复测量方差分析比较各组嗜酸粒细胞比例,结果如下。、 和组间比较,外周血嗜酸粒细胞比例差异显著.,组间两两 表 比较见三组问差异均显著,高于,而高于和. .;随感染时间延长嗜酸粒细胞比例先升高后降低.;时间与分组 之间交互效应显著,即两组在不同时间体重变化的趋势不同.表、 图.。具体来看,空白小鼠外周血嗜酸粒细胞少见,小鼠感染后外周血 嗜酸粒细胞逐渐增多,而小鼠感染后早期即升高,此后反而进行性 下降图。组外周血嗜酸粒细胞升高较组更为明显,更适合作为 治疗研究的动物模型。