[资料]核与胞质蛋白提取方法

[资料]核与胞质蛋白提取 细胞质与细胞核蛋白提取方法 裂解液A: 裂解液B: HEPES 10mmol/L，pH7.9 HEPES 20mmol/L，pH7.9 KCl 10mmol/L NaCl 420mmol/L MgCl2 1.5mmol/L MgCl2 1.5mmol/L DTT 1mmol/L DTT 0.5mmol/L 甘油 5% 甘油 25% EDTA 0.2mmol/L EDTA 0.2mmol/L NP-40 1% PMSF (使用前加入) 1mmol/L PMSF (使用前加入) 0.5mmol/L aprotinin 3mg/L aprotinin 5mg/L leupeptin 3mg/L leupeptin 5mg/L pepstainA 2mg/L pepstainA 3mg/L 注意:红色斜体字成分可用蛋白酶抑制剂混合物代替，使用前加入 方法如下: 1.将细胞收集到EP管中，离心(4000r/min，5min，4度)。 2.用PBS洗三次，离心同上，弃上清。 3.加入100微升缓冲液A，冰上孵育10min，离心(14000r/min，1min)，弃上清。 4.将沉淀重悬于60微升缓冲液B中，混匀，冰上30min，离心(14000r/min，15min，0度),收集上清，弃沉淀。 (核蛋白提取后可用裂解液A透析2h，合并用于IP;或用其他溶液稀释后用浓缩离心管替换溶液后用于IP或其他实验) 裂解液A的作用主要用于释放胞浆蛋白和膜蛋白，裂解液B用于释放核蛋白，NP-40既是一种面活性剂又是一种去垢剂，它的作用是既 可破坏细胞膜(较温和)，又可结合释出的蛋白防止沉淀，所以通过第一步离心去上清后大部分胞浆蛋白和膜蛋白可去掉。