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血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究(可编辑)

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血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究(可编辑)血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究(可编辑) 血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究 北京协和医学院;中国医学科学院 博士学位论文 血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究 姓名:刘娜 申请学位级别:博士 专业:妇产科学 指导教师:边旭明 20090501 北京协和医学院博士学位论文 血片法中孕期唐氏综合征筛查的初步研究 中文摘要 目的 1(探讨血片法唐氏综合征 DS 筛查的可行性,并对其行方法学的初步评 价。 2(比较血片法及血清法检测的精确度和相关性,选择合适的中孕期DS筛查 方案以开展血片法...
血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究(可编辑)
血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究(可编辑) 血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究 北京协和医学院;中国医学科学院 博士学位论文 血片法中孕期唐氏综合症筛查的初步研究 姓名:刘娜 申请学位级别:博士 专业:妇产科学 指导教师:边旭明 20090501 北京协和医学院博士学位论文 血片法中孕期唐氏综合征筛查的初步研究 中文摘要 目的 1(探讨血片法唐氏综合征 DS 筛查的可行性,并对其行学的初步评 价。 2(比较血片法及血清法检测的精确度和相关性,选择合适的中孕期DS筛查 以开展血片法的大规模临床应用。 3(获取实验人群生化指标的孕周特异性血片法中位数值,并初步探讨血片 法中孕期DS筛查风险的计算及筛查体系的建立。 方法 妇幼保健院产前筛查中心,收集符合入组及排除条件的孕妇末梢血及血清样本共 503例,登记相关I临床信息。 2 血片法技术路线的探索。研究血片洗脱、打孔及温度稳定性等。 HCG、uE3 3 选取其中的106例标本,分别行血清学与血片法AFP、Total FreeB HCG检测,对血片法进行方法学评价的同时,比较血片法与血清学方法 ’ 的相关性。 4 临床应用研究部分,在孕妇临床进行血清学DS三联筛查的同时,应用 血片法AFP+FreeB HCG筛查方案完成对全部503份末梢血样本的检测,并获取 实验人群生化指标的孕周特异性血片法中位数值。将检测值和孕妇信息输入风险 计算软件得孕妇MoM值和风险值,将筛查结果与血清学方法对比,初步探讨血片 法中孕期DS筛查的有效性。 5 妊娠结局的随访。 结果 1(血片慢速震荡洗脱1h、2h、4h及16h时,AFP及FreeBHCG测量值与 一2- 北京协和医学院博士学位论文 4?过夜洗脱测量值无显著差异。 2(血片中心及中心一边缘交界处AFP测量值无显著差异,而边缘处AFPN0量值 B 高于前两者,差异有统计学意义。血片中心、中心一边缘交界处及边缘处Free B HCC澳I量值均有显著差异,其中边缘处FreeHCG测量值最高,血片中心处最低。 学意义,而在35?下最长可以保存12天。Free―BHCG血片室温下可保存6天, 35?下最长可以保存3天,差异无统计学意义。 4(血片法方法学初步评价中,AFP、TotalHC6、uE3及FreeBHCG检测的 87(6一113(51,。 5(AFP、Total B HCG、uE3及FreeHCG血片法检测与血清法比较研究, AFP检测相关系数R O(93,线性回归方程为Y O(024+0(492X;TotalHCG检测相 B 性回归方程Y 1(471+0(844X;FreeIlCG检测相关系数R O(974,线性回归方 程为Y 3(804+0(931X。 6(末梢血片及静脉血片AFP测量值密切相关,相关系数为0(877;FreeB llCG的末梢血片及静脉血片测量值相关系数为0(901。两者末梢血片及静脉血片 ’ 测量值经T检验差异均无统计学意义 P 0(05 。 7(血片法和血清法共用Lifecycle软件的两个方案:血片法测量值的直接 拟合转换为血清学测量值,通过Lifecycle软件计算风险值,共筛查出DS高危 者10例;或根据各孕周病例血片法测量值直接获得各孕周中位数值,校正后通 过Lifecycle软件界和孕妇临床信息计算风险值,共筛查出DS高危者42例。 结论 1(血片慢速震荡洗脱1h与4"C过夜洗脱效果无显著差异。 2(打孔位置不同对血片测量值有影响,边缘处高于血片中心。 3(AFP+FreeB IlC6血片在室温下最长可保存6天,而在35?保存不超过3 北京协和医学院博士学位论文 天为宜。 B 4(血片法AFP及FreeHCG检测在精密度、准确性、与血清学方法相关性 等方面均优于血片法TotalHCG和uE3检测。 B 5(血片法AFP、TotalHCG、uE3及FreeHCG检测均与血清学方法有较好 相关性。 6(AFP+FreeB 0(65ng,ml。 7(静脉血片及末梢血片测量值无显著差异。 8(利用血片法测量值的直接拟合转换为血清学测量值模型,共筛查出DS 高危者10例;利用本研究获得的各孕周血片法中位数值,通过Lifecycle软件 共筛查出DS高危者42例。 关键词 唐氏综合征 产前筛查 血片法 北京协和医学院博士学位论文 ishAbstract Engl on maternaldriedblood Studyprenatal spotscreenlng forDown syndrome Objective 1(Theaimofthis isto Down study adaptprenatalsyndromescreening todriedblood to the ofDBSwith spots DBS (AndexplorefeasibilityAFP, Total orwith HCG( HCG,uE3 AFP,FreeB onthe and between―run , 2(Throughstudy prevision within―run andthedetection1imitof meanto a scale recovery DBS,we develop1arge DBS method( screening prenatal 3(To the andclinicalvaluesof methods explorefeasibility screening on obtainthe median DBS,we gestational―age―specificvalues, andinput itwiththeclinicalinformationintothe softwareto the lifecycle get risk( Methods 1(Theserum andDBSof503 werecollectedfromthe samples gravidas Maternal obstetricclinicsof unionmedical andHaidian Beijing hospital andChildHealth to hospital,fromDecember,2008 col informationswere lected simultaneously( 2(To the ofDS the exploreway screening,westudy and ofdriedblood stability spot( 3(Serum andDBSobtainedfrom116 daswere specimens gravi analyzedby conventional and the methodologyby adaptedassaysrespectively( limits and anddetection Precision within―runbetween―run ,recovery studieswereconducted( 4(Serum andDBSobtainedfromall503 specimens were withtwomethods(Fromthe singletonpregnanciesanalyzed results, (5( 北京协和医学院博士学位论文 weobtainthe median to the values, evenget gestational―age―specific risk the software( throughlifecycle computed the outcomesofthe503 tocorrectour 5(Follow―uppregnancy gravidas results( Results isno differencebetweenAFPandFreeBHCGafter 1(There significant forlhorfor24h( either eluting locationof canaffectthemeasurementofAFPand 2(The peforation FreeBHCG( 3(AFPcan stablefor28 inroom thanfor keep days temperature, other 12 in 13HCGcan stablefor6 inroom days35?:Free keep days lefor3 in35?( days temperature,whi 4(Thewithin―run of andFreeBHCG previsionAFP,TotalHCG,uE3 assays are 6(35―7(71,,6(2―12(4,,9(29―16(35,and6(4― 9(99,,respectively( Between―run are prevision rateofthesemarkersare 9(44―15(23,(The 85(82―104(39,, recovery 87(6―113(51,。 74(47―104(11,,70(15―143(1,and between 5(Therewasa correlation strongstatisticallysignificant in thelevelsofthesemarkersinserum and specimensDBS R O(93, 0(691, these variances 0(863,0(974,respectively (Foranalytes,theprecision forserumes( were tothose themanufacturer compared presentedby sampl areno inDBSof bloodand 6(There significantdiscrepancyperipheral markers value fromcenter venousblood P 0(05 :thetestinggethigher toside P O(05 ( direct 7(Two weredrafted(Onemodelwas protocols potential thevalueofserum thevalueofdriedbloodto transforming byregression the thecorrectedlocal analysis:andother:Throughcalculating MOMofdriedblood theriskvalue gestational―age―specificassay,weget 一6一 北京协和医学院博士学位论文 of patientsbyLifecycle( Conclusions blood elutionof1 hourissuitable( 1(Fordried spot,the 2(As locationof ondriedblood control,the perofation spot quality amainrolein play assay( 3(Driedblood forAFPandFree0HCG can stablefor spot assaykeep 6 inroom for3 in35?( days temperature,anddays 4(Thereisa correlationbetweenthelevels statisticallysignificant in andinDBS( of andFree13HCG serum AFP,TotalHCG,uE3 specimens 5(ItisfeasibletousetheseDBS with B adaptedassaysAFP, Free HCGinmaternalserumscreeni ngprograms( 6(ThedetectionlimitofAFPandFreeB HCGare 1(51u ,ml,0(65ng,ml respectively( areno inDBSof bloodand 7(There significantdiscrepancyperipheral blood( venous oflocal medianvaluesisto 8(Obtaininggestational―age―specific easethe ionofDSriskwithDBS(Theotherof risk computat way obtaining thevalueofDBStothevalueofserum( valuewithDBSistotransform words Key blood Down screening,dried syndrome,prenatal spot (7- 北京协和医学院博士学位论文 英文缩略语表 ABBREVIATIONS 缩略语 英文名称 中文名称 Down Syndrome 唐氏综合征 AFP Q―Fet0Protein 甲胎蛋白 FreeHCGFreeBHumanChorionic 9 Gonadotrophin游离B人 类绒毛膜促性腺激素 HumanChorionic 人类 绒毛膜促性腺激素 Gonadotrophin Estriol 游离雌三醇 Unconjugated Driedblood 血片法 spot Cvs ChorionicVilli Sampling 绒毛膜穿刺术 Coefficientofvariation 变异系数 MoM OftheMedian Multiple 中位数倍数 DetectionRate 检出率 False-PositiveRate 假阳性率 TR-FIATime-ResolvedFluorescence 时间分辨荧光免疫分析法 ImmunoAssay LIN Linear 直线方程拟和模型 Logarithmic 对数方程拟和模型 Quadratic 二次方程拟和模型 CUB Cubic 三次方程拟和模型 E】【P Exponential 指数方程拟和模型 MSAFP MaternalserumAFP 母血甲胎蛋白 (1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名:交,朔f 签字 日期: 2009年6月10日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j量塞迹塑医堂瞳有关保存、使用学位论文的 管理办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论 文被查阅和借阅。本人授权j丝塞迹塑医堂瞳可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名:奠J姗 导师签名:迎他嘿 签字日期:2009年6月10日 签 字日期:2009年6月10日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位:北京友谊医院 电话: 通讯地址:北京友谊医院妇产科 邮编: 北京协和医学院博士学位论文 ―1厶―b 翮 青 染色体异常是人类常见的重大出生缺陷,多伴有多发畸形或 严重的智力障 碍。唐氏综合征,11P21一三体综合征 Down’Ssyndrome,DS 是 其中最多见的 命只有16(2岁,临床表现以中到重度智能及体格发育障碍为主,50,有先天性 心脏畸形,如房、室间隔缺损,动脉导管未闭、法洛四联症等;消化道畸形、脐 疝、唇裂、腭裂及多指 趾 、并指 趾 等畸形亦较多见;该症患者白血病的 效治疗方法,主要是加强护理,针对性地进行智力和劳动技能训练,使其能够自 食其力地生活。因此应用产前筛查和诊断的方法以降低该类患儿的出生率是当前 产前诊断的重要任务。 自20世纪60年代起,人们即开始利用羊水细胞染色体核型分析的方法迈出了 的时间提前到早孕期。然而,作为有创性检查手段,羊膜腔穿刺及CVS均有一定 20,。此后,越来越多的DS血清学标记物被发现并广泛利用。 为多种标记物来筛查胎 LDS,是一种非常有效的方法。此后不久,采用孕妇年龄、 AFP、和FreeB―HCG筛查胎 LDS获得了广泛的接受和应用。 目前染色体异常出生缺陷较为成熟的产前干预方案为“中孕期母血清学筛查 一产前诊断’’的模式,即建议所有孕妇在中孕期 14-20+6周 进行血清学的产 前筛查,筛查方案主要为“二联筛查"及“三联筛查":即血清甲胎蛋白 AFP +血清游离BHCG FreeBHCG ;血清AFP+FreeBHCG+血清游离雌三醇 uE。 。 将以上血清学指标的水平,结合孕妇的年龄,体重,人种等其他影响因素,综合 计算得出胎儿患有唐氏综合征、18三体、13三体综合征等常见染色体异常的风险, 将筛查高风险的孕妇进一步行羊膜腔穿刺以获取羊水,培养离心后获取的羊水细 胞,进一步行染色体核型分析,从而通过产前诊断,建议确诊为怀有唐氏综合征 患儿的孕妇及时终止妊娠,以降低唐氏综合征患儿出生率。通过以上筛查和诊断, 唐氏综合征患儿的检出率可达到65,--70,,见表1。 北京协和医学院博士学位论文 表1 DS中孕期筛查检出率 DR。 Howard DR。 Wald DR 筛查方案 8 SURUSS5 etc6 etc4 AFP+t-HCG 59 66 56 AFP+f一一HCG 58 71 6l AFP+t―HCG+uE369 74 60 AFP+f-一HCG+uE368 77 65 AFP+t-HCG+uE3+inhibinA 76 81 67 AFP+f--HCG+uE3+inhibinA 75 83 71 a:假阳性率为5,。 但同时,由于静脉取血的筛查方法具有筛查成本偏高, 检测技术依赖性大、 标本不便于远距离寄送等固有的局限性,目前我国的产前筛 查覆盖率仍不足30,, 尤其在我国中西部地区及偏远农村,受到当地经济条件及运 输条件的限制,唐氏 综合症筛查难以得到广泛的开展。 并且由于血样无法转运, 只能当地检测,造 成我国目前产前筛查中心分布分散,设备重复,血样检测和质量控制及机构管理 的成本很大,因此,寻找一种经济有效、方法简便同时利于寄送的筛查方法对我 国建设良性的筛查网络,进一步广泛开展产前筛查极为重要。 血片法最早在1963年7由Guthrie等人首次用于代谢性疾病的大规模筛查,进 而应用于新生儿疾病的筛查。近年来,在美国超过95,的新生儿接受血片法新生 儿筛查,血片法并且逐渐应用在艾滋病毒、乙肝病毒及药物滥用者的快速诊断等 方面。血片技术具有血样采集方法简单、成本低廉、减少溶血和样本降解、不需 要离心、增强标本在高温情况下的稳定性、提高了对生物有害物的管理、减少了 运输和贮存费用等优势。 而61ennE等人9报道HCG纸片法的洗脱率在53,-67,之间。且血片法稳定性较 性。Alainm等人曾应用酶联免疫吸附法比较血清筛查及干血片法筛查的有效性。 实验证明干血片法相对于血清筛查法是一种经济有效的方法,适用于大规模的人 群筛查。Eduard011等人也曾应用时间分辩免疫荧光法验证了干血片法的有效性。 本研究拟建立的干血片产前筛查技术进行唐氏综合症等产前筛查的优点在 北京协和医学院博士学位论文 于血样采集方法简单、成本低廉、减少溶血和样本降解、不需要离心、增强标本 在高温情况下的稳定性、提高了对生物有害物的管理、减少了运输和贮存费用等。 使得产前筛查的标本采样甚至可以在乡镇一级的卫生所内进行,而检测可以在相 对集中的大筛查中心统一完成,这样减少了筛查实验室的重复建设,降低了检测 成本和质控成本,各级别的医院都可以开展唐氏综合症产前筛查,为进一步广泛 开展产前筛查奠定基础。 北京协和医学院博士学位论文 与方法 一、研究对象及标本的采集 一 研究对象 本研究收集2008年11月至2009年4月期间,于北京协和医院产科及海淀妇幼 保健院产前筛查中心接受唐氏综合征产前筛查的孕妇共计503例,每个孕周约100 例左右。 4 超声核对孕周准确; 5 孕妇知情同意,并签署知情同意书。 排除条件: 1 多胎妊娠; 2 孕周计算不准确者; 3 拒绝行血片法DS筛查 者; 4 无法随访妊娠结局者; 5 经辅助生育妊娠者。 二 标本采集 血清学标本采集:抽取静脉血3-5ml,置室温60分钟待血 液完全凝集后, 2000rpm离心10分钟并分离血清,避免溶血,将血清用一次性吸管装入血清保 存管中,保存管盖需拧紧,防止血清漏出,新鲜血清4。C保存。在血清保存管上 注明标本编号,申请单上均须注明孕妇的姓名和标本编号。同一标本血清管使用 同一编码,各血清标本统一编码。新鲜血清1周内于北京协和医院产前筛查中心 温度下保存,备TotalHCG检测,避免反复冻融。 于筛查同时收集符合要求的孕妇信息,包括姓名,病案号 或标本编号 , 出生日期,;月经史,末次月经,筛查抽血日期,筛查当日体重,筛查 孕周,孕周核对方式 LMP或B超 ;既往糖尿病史,烟酒史,既往不良孕产史; 孕期病史。 末梢血标本采集:血清学标本采集同时应用一次性采血针采集入组孕妇手指 末梢血,使血滴自然渗透至S&$903滤纸,采集3个血斑。将采集的血片置于清 洁空气中,避免阳光直射,自然晾干呈深褐色,并登记孕妇I临床资料;检查合格 的滤纸干血片,置于塑料袋内,保存在4"C冰箱中,1周内完成AFP等标记物的 检测。 末梢血标本采集注意事项: 1 本研究所有入组孕妇末梢血标本均为研究生 本人采集,减少不同采血人员造成的偏移; 2 采血前清洗双手并佩带手套; 3 北京协和医学院博士学位论文 自孕妇左手无名指侧采血,深度小于3毫米,用干棉球拭去第一滴血,取第二滴 血; 4 将滤纸片接触血滴,切勿触及指尖皮肤; 5 取血完毕,血片应在室 温中水平放置清洁干燥处自然晾干 2,4小时 ,然后装入密封塑料袋内,放置 4"C冰箱中保存。血片应避免潮湿、日照,不可烘烤。放置时应头尾交叉,避免 血标本互相污染。 6 滴在滤纸圆圈内的血液,必须从正面吸入并渗透到滤纸背 面。正反面的血斑直径要求一致。避免正反两面滴血及采集有大量组织液的血 液或凝固的血液。避免血斑血量不足,渗透不够,而出现梅花状、夹心状和直 径 8mm血斑。 7 未采血的滤片应放置在干燥处保存,滤纸表面必须保持清洁, 不能与手、奶、消毒液、清洁剂、水等物质接触防止污染。 合格血斑:?每个血斑直径要达到lOmm;?同时取3个血斑;?血液 必须完全渗透到滤纸背面;?无重叠;?无污染;?易洗脱。 二、实验材料 1主要仪器 一次性采血针 苏州施比尔塑料器械开发有限公司 研究用滤纸 英国whatman公司 打孔钳 北京金桥雅图有限公司 EP管 美国AXYGEN公司 加样枪 EPPENDORF公司 连续加样器 EPPENDORF公司 LDZ4-O(8离心机 北京医用离心机厂 Lifeand 振荡器PerkinElmerAnalytical Lifeand 洗板机PerkinElmer Analytical Lifeand 自动时间分辨免疫荧光测试系统PerkinElmer Analytical 移液器 BRAND CELL-DYN3700全自动血常规分析仪美国雅培公司 2主要试剂 Lifeand 2(1本研究用试剂盒均购自荷兰 PerkinElmerAnalyticalScience公司。 HCG 1 hAFP,FreeB双联检测试剂盒,批号:A067-101492152。 内含标准 品、示踪剂贮存液、缓冲液、浓缩洗液、增强液及包被抗体的96微孔板。 495886。 2 AFP检测试剂盒,批号:A083-301 一12?? 北京协和医学院博士学位论文 Total HCG检测试剂盒,批号:B082-301488027。两者均包含:标准品、示踪 剂贮存液、缓冲液、浓缩洗液、增强液及包被抗体的96微孔板。 3 uE3检测试剂盒,批号:A083-301495886,内含标准品、抗血清储存液、 示踪剂贮存液、缓冲液、浓缩洗液、增强液及包被抗体的96微孔板。 2(2质控品 MaternalSerum 质控品购flBIO-RAO Control公司。 Levels 各血清标志物质控品浓度范围如下表示: 表1 血清标志物质控品浓度范围 390701 390702 390703 AFP u,m1 7(82-10(34 23(5-29(1 54(8-71(6 FreeBHCG ng,m1 12(1-19(42 39(4-56(8 83-121 uE3 nmol,1 3(96-4(96 15(06-20(149(2-62(6 Total 6(9-12(8 22(8-40 50(4―75(6 UCG ku,1 注:AFP、FreeBHC6、uE3浓度范围取自北京协和医院产前筛查中心:TotalHCG浓度范围参 MaternalSerum 考BIO-RAD Control公司参考值。 三、实验方法 一 血清学检测 B 为对比分析血片及血清学检验方法,本研究对其中106例患 者行AFP、Free HCG及uE3血清学DS检测同时,行血清学检测TotalHCG。检测步骤如下。 标准 品复孔检测,每次检测均运行质控,待测样本单孔检测 l BHCG hAFP,Free 1(1将抗hAFP及抗FreeBHCG示踪剂贮存液按比例稀释。 1(2在96微孔板中分别加入200ul示踪剂稀释液及25ul标准品或待测品。 1(3室温慢速震荡2(5小时 最大温度30? 1(4洗板6次。 1(5在96孔板中加入200ul增强液,慢速震荡5分钟。 北京协和医学院博士学位论文 1(6Wallac DELFIA系统根据标准品运行标准曲线,计算待测品浓度。 2TotalHCG 2(1吸取25ui标准品或待测血清至血清保存管中,向其中加入ImlPBS溶液,充分 混匀 因孕妇TotalHCG血清浓度较高,稀释40倍 。 2(2在96微孔板中分别加入200ulbuffer及25ul标准品或待测品稀释液, assay 慢速震荡1h。 2(3洗板2次。 2(4在微孔中加入200ul抗HCG示踪剂稀释液。 2(5室温下慢速震荡0(5d,时。 2(6洗板6次。 2(7在96孔板中加入200ul增强液,慢速震荡5分钟。 2(8Wallac DELFIA系统根据标准品运行标准曲线,计算待测品浓度。 3uE3 3(1在96微孔板中加入lOOul抗血清液,室温下低速震荡15分钟。 3(2在微孔中分别加入50ul标准品或待测品及lOOul示踪剂稀释液。 3(3温下低速震荡1h( 3(4洗板6次。 3(5在96孔板中加入200ul增强液,慢速震荡5分钟。 3(6Wallac DELFIA系统根据标准品运行标准曲线,计算待测品浓度 二 血片法的建立 l标准及质控干血片的制备 以AFP血片为例 1(1肝素抗凝,采集男性健康志愿者静脉血 血清AFP?2ug,1 50ml。 1(2 复离心洗涤步骤三次。 1(3取制备完成的浓缩洗涤红细胞与试剂标准品溶液等量混合12’13。检测混合液 红细胞压积45,左右,将此混合液滴至滤纸片上,自然晾干,获得标准血片浓度 分别为0,0(5,5,50,250,500U,m1。 1(4将制备好的标准干血片4?冰箱保存。 北京协和医学院博士学位论文 1(5质控干血片的制备同标准血片,取浓缩洗涤红细胞与质控品等量混合制备而 成。 2打孔及洗脱 直径6mm标准品、质控品和样本血片放入相应的微孔中,加入lOOul复溶液l 具 体成分受产权保护,暂不予公开 ,室温下慢速震荡1h洗脱。 TotalHCG:Total HCG因在孕妇血中浓度较高,待侧样本需稀释40倍后检 测。用专用打孔钳尽量在血片相同部位打下直径3mm标准品、质控品和样本血片 放入相应的血清保存管中,加入lml复溶液2 具体成分受产权保护,暂不予公 开 ,室温下慢速震荡1h洗脱。 3余检测步骤同血清学检测方法 4结果计算 4(1根据标准血片洗脱液的平均荧光值,建立标准曲线,使用标准品的荧光值与 其相对应的浓度绘制标准曲线。荧光值为纵轴 Y轴 ,浓度为横轴 X轴 ; 4(2根据待测血片洗脱液荧光值与标准血片洗脱液荧光值的对应关系,计算待测 血片浓度值。 四实验步骤 一 干血片DS筛查方法技术条件的建立 l洗脱 分别在洗脱1h、2h、4h、8h、16h及过夜情况下检测洗脱液的浓度,以寻找 最佳洗脱条件 n 8 。 2打孔 分别在血片中心、边缘及中,L,1,2处、边缘处打孔,在同 一块微孔板上测定 其浓度,观察不同部位所取血片对洗脱液浓度值测定的影响,重复实验10次,以 统计学凇验处理数据,比较各取血部位有无显著性差异。 3温度稳定性 干血片分别在一20"C、4?、室温 约25? 及35?下保存4周,检测血片在各 温度下的稳定性 n 10 。 (15( 北京协和医学院博士学位论文 4血片法方法学评价 4(1血片法精密性评价 取低、中、高三个浓度血片通过8次试验,每次试验采用10复孔,采用方差 分析方法计算组内及组间变异系数 CV 、平均值及标准差等,并利用以下公式 将血片法方差与厂家给出的血清学测量方差进行检验。 X2_ n-1 slZ,s22 其中,s(2为血片法测量值的方差,s22为血清学测量值的方差。 4(2重吸收率计算 后,制备成干血片。通过实际测得血片浓度与期待浓度值计算血片重吸收率。 4(3灵敏度检测 取男性志愿者静脉血制各为干血片,测量其洗脱液浓度。灵敏度为测定平均 值以上3个标准差 平均值+3SD n 20 ( 4(4与血清学方法相关性 13 分别测量106例患者AFP、Free HCG、HCG及uE3血清及血片浓度,作散 点图,目测血清法与血片法测量的线性关系;并运用以下公式计算相关系数: ?8i’趸 @j。y- b2―L1r――――_?一 ?辱t一趸 2 并通过直线回归等计算得到回归方程。 甏:坠 2N 可:里垫 。 2N a 一Y-bX 得到线形方程:Y bX+a 5末梢血片与静脉血片相关性分析 对40例孕妇同时收集静脉血片 静脉采血同时直接由采血 器滴到滤纸片上 北京协和医学院博士学位论文 及末梢血片,分别检测两种血片,并对测量结果行一致性分析。 二 干血片法在DS产前筛查中的初步应用 6 应用血片法AFP+FreeHCG筛查方案完成对全部503份末梢血样本的检 测。将检测值和孕妇信息输入Lifecycle风险计算软件得孕妇MoM值和风险值, 将筛查结果与血清学方法对比,以初步探讨血片法中孕期DS筛查的有效性。而 血片法与血清学方法共享Lifecycle风险计算软件有如下两个方案。 1( 血片法测量值拟合转换为血清学测量值 Lifecycle风险计算软件内嵌高加索人群血清学DS筛查各孕周中位数值。 本研究发现血片法测量与血清学测量密切相关,因此可通过SPSS多重曲线拟合, 计算最佳拟合曲线,从而将血片法测量值直接拟合为血清学测量值。进一步结合 孕妇信息通过Lifecycle风险计算软件计算孕妇血片法筛查风险值。 2( 血片法DS筛查系统的建立 通过大规模血片法DS筛查的开展,建立针对中国人群的血片法DS筛查各孕 周中位数值,进一步结合孕妇信息通过Lifecycle风险计算软件计算孕妇血片法 筛查风险值。 2(1中位数值的计算 计算血片法DS筛查各孕周的中位数值,并与孕周行曲线拟合分析,建立中位 数一孕周拟合曲线方程,以之代替Lifecycle风险计算软件内嵌的高加索人群中位 数一孕周拟合曲线方程。 2(2中位数值的校正 B 检澳IAFP及FreeHCG由于母血中浓度值受诸多因素如孕妇体重、种族及有 无糖尿病史14等影响,因此需对其进行校正。 1 校正体重由于母血AFP水平随着孕妇体重的增加而降低,校正具体方 法如下: FreeB 2 校正II型糖尿病因素及种族因素 北京协和医学院博士学位论文 B 经过以上校正后,即可获得一个比较真实的AFP及FreeHCG中位数值。 2(3 DS筛查风险值的计算 以下步骤均由Lifecycle风险计算软件计算完成 1 计算年龄相关的危险率 age―specificrisk,asr asr l, O(000627+exp[一16(2395+ 0(286×age ] 一1 2 计算似然比 Likelihoodratio,LR LR是评价一个孕妇有多大可能受累 的一个指标。评估LR大小需首先建立受累孕妇与正常孕妇各个 指标的正态分布 曲线,再结合三项指标的均数,标准差和变异系数来进行计算: LR 某点未受累孕妇正态曲线的高度,某点受累孕妇正态曲线的高度 3 计算危险率风险值 风险值 1:asr×LR 以风险值?l:270为筛查高危 。 三 孕妇妊娠结局随访 由于我们血清样本的采集时间在2008年的12月至2009年4月,共收集到 的503例孕妇的妊娠结局将在2009年的下半年才能随访到,因此这将是本课题 此后重要的一项工作,届时根据随访的结局可以对现有第三部分结果进行修正, 进而使我们的结论更具科学性。 六、统计分析 1 所有统计分析采用SPSS2(O统计软件进行。 北京协和医学院博士学位论文 结果 第一部分 干血片DS筛查方法技术条件的建立 1(血片洗脱时间 干血片洗脱条件各文献报道不一””,为此(本研究就千血片的各种洗脱条 件进行试验。分别将干血片在洗脱液中慢速震荡洗脱1、2、4、6、8、16d,时, 或4"C过夜 n-8 ,实验结果如图1所示。 co#m鼻c口ucou 图1血片在不同条件下的洗脱 如上|呈|所示,宣温下慢速震荡洗脱与4?过夜洗脱效果均近似, 结果如表23所示。 表2不同洗脱时间下AFP测量值 AFP均数 u,m1 p值‘ lh组 2507?1(07 0(06l 2h组 22(83?0(46 0(055 4h组 24(03?0(61 0(424 6h组 26(65?0(87 0(001 25 88 0024 8h组 23?0 16h组 2453?0(62 0086 58 24h组 23(68?0 a吾组分别与洗脱24h组两两比较所得p值 北京协和医学院博士学位论文 8 表3不同洗脱时间下FreeHCG澳K]量值 Free13HCG均数 ng,m1 p值8 1h组 29(23?0(85 0(357 2h组 27(88?0(67 0(120 4h组 29(43?1(15 0(310 6h组 29(10?1(54 0(647 8h组 30(18?l-29 0(085 16h组 29(38?O(67 0(189 24h组 23(68?O(58 a:各组分别与洗脱24h组两两比较所得P值。 13 别在洗脱6h及8h时测量值高于洗脱24h澳lJ量值。而如表3所示,FreeHCG在各种 洗脱条件下测量值均无显著差异。综合考虑各项实验条件,本研究采用室温下慢 速震荡洗脱lh。 2(打孔位置对血片测量值的影响 分别在血片中心、中心与边缘1,2交界处及边缘处打孔 n 10 ,测量统计结 果如表4-5所示。 表4 不同打孔位置AFP澳t]量值SNK多重比较结果 AFP值,a O(05 1 2 中心处 22(77 交界处 23(87 边缘处 31(78 p O(29 1 由表4可知,血片中心及中,b-边缘交界处AFPi贝I]量值 无显著差异,而边缘处 AFP颡]I]量值高于前两者,差异有统计学意义 p O(05 。 Jb京西和医学院博士学位论文 袁5年同打孔位置FreeBHCG$9量值SNK多重比较结 果 Free BHCG值,a O(05 l 2 3 中心处 2448 交界处 27(67 边缘处 3I33 l l 1 由表5可知,血片中心、中心一边缘交界处及边缘处Free 卧 cG测量值均有显 著差异,其中边缘处FreeBllcG测量值最高,血片中心处最低。 3AFP及Free―日HCC,温度稳定性研究 3(1^FP温度稳定性 AFP分别在4?、室温 约25? 、35?及一20?下温度稳定性如下图所示。 ,、 onI霉i点口 Jo 欲 05 E口,辞 图2 AFP血片在不同温度下的稳定性 无统计学意义。而在35?下保存结果经SNK多重比较,如下表所示。 一21- 』匕京办羊u医学院博十学位论文 表6 AFP35?下保存SNK多重比较结果 a O(05 1 AFP均数u,R 2 第1天 10(9I 第2天 12(23 第3天 10(93 第6天 978 第12天 11(63 第18天 8(99 第24天 8(50 p 0(79 0(3 0 天与第18天测量均数差异有统计学意义 p018,a O05 ,因此(本 研究认为 的降解所致。 3(2Free―BBe6温度稳定性 Free―B 硝。 f,,,,一 , , , , 罩熏5 lo暑#重水 g么一 图3 Free―B K舄血片在不周温度下的稳定性 北京协和医学院博士学位论文 由图可知,Free一13 HCG血片4"C及一20" 2下均可保存28天,差异无统计学意 Free-13 表7 HCG室温保存SNK多重比较结果 a O(05 1 2 2 4 第l天 13(70 第2天 14(23 16(23 第3天 14(25 14(25 第6天 15(35 15(35 第12天 16(23 16(23 第18天 17(75 17(75 第24天 18(28 p 0(18 0(07 O(07 O(51 如表7所示,Free一13 HCG血片室温下可保存6天,测量值差 异无显著意义 形式所致。 表8 Free一13 HCG在35"C保存SNK多重比较结果 a O(05 l 2 3 第1天 14(23 第2天 15(90 15(90 第3天 16(23 16(23 第6天 17(23 第12天 17(80 19(97 第18天 20(33 第24天 p O(07 O。15 O(5l 如表8所示,Free一13HCG血片35* 2下可保存3天,测量值差异无显著意义 北京协和医学院博士学位论文 p O(07 。3天后测量值较前逐渐升高。 4血片法方法学评价 4(1血片法检测精密度评价 精密度 precision 指测定同一匀质样品的一组测量值彼此 符合的程度。常 of 用相对标准 偏 差,也称变异系数 coefficient 括组内及组间Cv及总cV 。 HCG、uE3及FreeB HCG四种标记物进行了血片 4(1(1本研究对AFP、Total 法精密度检测,样本1、2、3分别代表低、中、高浓度样本,下同。统计结果见 表9-12。 表9 血片法检测AFP的精密度评价 重复检 组内差异 组间差异 总差异 复孔数 均数 U,m1 测次数 ,CV ,CV ,CV 样本1 10 8 4(57?0(41 6(35 22(6 8(97 10 8 7(7l 13(5l 8(36 样本2 13(54?1(13 样本3 10 8 32(46?2(626(52 18(09 8(08 血片法检测组内差异应小于10,,组间差异小于15,。如上表所示,3个样 本组内差异均符合标准,而组间差异仅中浓度样本 样本2 符合标准,样本1 和3均大于15,,考虑本研究采用手工法操作,Cv可能相对较大。 表lO血片法检测TotalHCG的精密度评价 重复 组内差异 组间差 总差异 复孔数 检测 均数 ×103U,L ,CV ,CV 异 96CV 次数 样本1 10 8 6(38?O(66 6(2 27(96 10(29 样本2 10 8 20(82?3(6 12(40 37(88 17(31 样本3 10 8 31(0l?2(69 8(89 6(38 8(69 北京协和医学院博士学位论文 如表10所示,其样本2组内差异大于10,,而样本1及2组间差异也远大 于15,。仅样本3组内及组间差异均小于10,。考虑TotalHCG浓度较高,测量 时需稀释40倍,稀释操作是导致CV增大的可能原因。 表11 血片法检测uE3的精密度评价 重复
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