棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白43表达的调节作用研究（可编辑）

棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白43表达的调节作用研究（可编辑） 棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白43表达的调节作用 研究 汕头大学 博士学位论文 棉酚对睾丸支持细胞间隙连接蛋白43表达的调节作用的研究 姓名:周德荣 申请学位级别:博士 专业:病理与病理生理学(男科与泌尿外科) 指导教师:蔡志明;桂耀庭 20090501汕头大学医学院博士研究生学位论文 摘要 棉酚具有显著的抗 男性生育 效果, 其作为男性避孕药的研究 己经进 行了将 近 三十年。 国内外对棉酚和有关化合 物作为避 孕药的 作用机理、体内代谢、 毒性 和 临床效果等方面进 行了广泛 系统的 研究, 但至今其具体 作用机制目前仍不 清楚。 鉴于以上原因,研 究棉酚的 男性抗 生育机制 是男科 学一项十 分有意 义的工作 。 支持细胞 ( S e r t o l i c e l l )是雄性哺 乳动 物 睾丸 曲细 精管 内 唯一 的体 细胞 ,可 以维持和调节正常 的生精过 程,在 精子发育 成熟的 过程中具 有极为 重要的作 用。 S e r t o l i 细胞的结构和功能 的完整性 对生精 细胞的增 殖和成 熟十分关 键,其改变 可 导致生精细胞的脱 落和死亡 。 间隙连 接 g a p j u n c t i o n , G J 是位于 细 胞胞 膜 上连 接 相 邻细 胞 间的 通 路 , 允许小 分子及离子物质交 换 , 其 主要生化成分为连 接蛋白 c o n n e x i n , C x 。 睾丸中最主 要 的连接蛋白是 c o n n e x i n 4 3 C x 4 3 , 主要 位于曲细精管的基 底 层 S e r t o l i 细胞之间 的 血睾屏障以及 S e r t o l i 细胞和生精细胞之 间。 近期有多个文献报 道,林丹、镉等 毒素能减 少 S e r t o l i 细胞的连接蛋白 , 并使 S e r t o l i 细胞上 C x 4 3 的数量减 少, 从 而影 响间 隙连 接 通讯 G J I C 的功能, 进一 步 影响到 睾 丸 S e r t o l i 细胞在 精 子发 生 过程 的 正 常功 能 ,并 对 睾 丸肿 瘤 的发 生 可能 也有影 响 。 因此, 我 们推 测 棉酚 对 雄 性生 殖 功能 的 影 响可 能 也首 先 从 S e r t o l i 细 胞开始。 本实验的目的是研 究棉酚对 睾丸支 持细胞的 毒性作 用, 检测支持细胞的间 隙 连接功能,进一步 探讨棉酚 作用下 睾丸支持 细胞膜 上间隙连 接蛋白 表达的变 化, 从而明确棉酚对支 持细胞间 隙连接 的影响。 对于研究棉酚的抗生育作 用具有 重 要 意义, 对于我们进一步开发低毒性 男性避 孕药有指 导意义, 同时也可为研究其 他 环境毒性物质机理 提供新思 路。 在 课题的第一部分, 采用 T M 4 细胞株, 通过 C C K - 8 实验 确定棉酚染毒剂 量 , 选定 不 同 浓度 ( 12 5 , 25 , 5 , 1 0m o l / L )棉 酚 分 别 处 理 细胞 ( 6 , 1 2 , 2 4 , 4 8 h ) , 应用 划痕标记荧光染料 示踪技术 检测 S e r t o l i 细胞 G J I C 的功能变化, 进一步采 用 R T - P C R 、 w e s t e r n b l o t 及细胞免疫荧光法 分别 从 R N A 水平、 蛋白表达水平及细 胞 分布变化来探讨棉 酚对支持 细胞间 隙连接的 影响。 课题的第二部分, 改进睾丸 支 I V汕头大学医学院博士研究生学位论文 持细胞的分离方法,在体外分 离培养 小鼠睾丸 支持细 胞。分别 用 F e u l g e n 染色法 及检测 F a s - L 表达等方法来鉴定 支持细胞 的纯度,并 用 R T - P C R 检测棉酚对原 代 培养 的 支 持 细 胞 上 间 隙 连 接 的 影 响 。 课 题 第 三 部 分 , 给 成 年 雄 性 小 鼠 胃 饲 1 5 m g / k g / d 棉酚后分别观 察 4 周、 8 周及 1 2 周睾丸的曲细精管,免疫组织化学方 法 检测支持细胞上间 隙连接的 变化。 - 5 实验结果表明,棉酚对 T M 4 细胞有抑制作用。当棉酚浓度 1 0 m o l / L 时, 细 - 4 胞存活率大于 9 0 % , 对 T M 4 细胞的存活率无明 显影响; 浓度 5 ×1 0 m o l / L 时, 对 S e r t o l i 细胞存活率的影响 随着剂量 增大而 降低, 并呈剂量 - 效 应 关 系 , E C 5 0 为 15 - 5 - 3 × 1 0 m o l / L 。 当棉酚浓度为 5 ×1 0 m o l / L 时, 存活率明显降低, 细胞存活率 3 % , 其差异有统计学意 义 P 00 5 。5m o l / L 棉酚作用 T M 4 支持细胞 2 4 小时结果与空 白对照组比较, 2 m m 长度 内划痕两侧绿色荧 光负载细 胞数目, 空白对 照组细胞 数 为 1 0 7 93 ?2 9 00 , 棉酚组为 3 0 56 ?1 3 42 。 组间差异 有统计学意义 P 00 5 , 提 示 棉酚用 药 后 T M 4 细胞间 隙 连接 功 能明 显 下 降。 5m o l / L 棉酚分 别 作用 T M 4 支持 细胞 6 小时 , 1 2 小时 , 2 4 小时及 4 8 小时后 R T - P C R 结果提 示 C x 4 3 m R N A 在各组细 胞中均有表达, 但随棉酚处理时间增加而逐 渐下降。 与空白组相比, 2 4 小时组 与 4 8 小时组 C x 4 3 m R N A 的量均显著下降 P 00 5 。 12 5 , 25 , 5 及 1 0m o l / L 棉酚分 别 处理 T M 4 支持细胞 2 4 小时后 W e s t e r n b l o t 结果提示 C x 4 3 蛋白 在各剂量组 均有表 达, 但表达量随浓度的 增加逐步 下降, 5m o l / L 及 1 0m o l / L 组中的表达量均明 显低 于空白组( P 00 5 ) 。 12 5 , 25 及 1 0m o l / L 棉酚作用 T M 4 支持细胞 2 4 小时后行 免 疫荧光细胞化学结 果可见, 棉酚作用组与对照 组表达相 比较, 阳性率和表达强 度 较正常 组 均降 低 ,且 随 剂 量增 加 C x 4 3 蛋白荧 光 表达 强 度逐 渐 减 弱。 12 5m o l / L 及 25m o l / L 组C x 4 3 表达阳性率和表达 强度均明 显降低,未见有 强 阳性 表达, 1 0m o l / L 组只有极少部分为 弱阳性表 达, 位于细胞浆, 呈淡绿色斑点状, 未见位 于 细胞膜。 在实验的第二部分, 成功 分离了的原代的小 鼠睾丸支 持细胞,纯度可 达 8 5 % 以上, R T - P C R 分析提示 棉酚 对 其也 存在 抑制 间 隙连 接蛋 白的 作 用。 实验 的 第三部分, 对小鼠进行 1 5 m g / k g / d 剂量棉酚处理实验 表明, 胃饲棉酚 4 周小鼠睾 丸 曲细精管的形态无 明显改变 ,但从 8 周开始,支持细胞 膜上的间 隙连接 蛋白的表 达减少, 1 2 周时间隙连接蛋白 明显减少, 提示棉酚对睾丸支持细胞连 接蛋白的 表 达有抑制作用。 V汕头大学医学院博士研究生学位论文 由此我们得 出结论 ,正 常 S e r t o l i 细胞存在大 量间隙 连接 通讯 ,主要 成分 为 C x 4 3 。 棉酚能抑制 S e r t o l i 细胞的间隙连接通 讯功能, 而细胞上 C x 4 3 表达的减 少 是其功能受损的物 质基础。 低剂量棉酚处理小鼠, 曲细精管上皮周期频率没 有 明 显紊乱, 精子发生过程没有被严重 破坏, 预示了其作用的可逆性。 但其可损伤 睾 丸 S e r t o l i 细胞上 C x 4 3 的表达, 进而可影响小鼠睾 丸 S e r t o l i 细胞的功能, 为棉 酚 导致雄性生殖功能 障碍的可 能机制 之一。 关键词 : 棉酚;睾丸;支持 细胞;间 隙连接 ;连接蛋 白 4 3 ;间隙连接通 讯 V I汕头大学医学院博士研究生学位论文 A B S T R A C T T h e c o n t r a c e p t i v e e f f e c t o f g o s s y p o l i n m a n h a d b e e n s t u d i e d f o r 3 0 y e a r sT h e m e c h a n i s m a n d t o x i c o l o g y o f g o s s y p o l a n d i t s a l l i e d c o m p o u n d h a d b e e n w i d e l y s t u d i e dH o w e v e r , t h e d e f i n i t e m e c h a n i s m w a s s t i l l u n c l e a rT h e s t u d y o f t h e r e p r o d u c t i v e t o x i c o l o g y o f g o s s y p o l w a s a v e r y i m p o r t a n t w o r k i n a n d r o l o g yS e r t o l i c e l l s w e r e t h e u n i q u e s o m a t o c y t e s i n s e m i n i f e r o u s o f t e s t i sI t p r o v i d e d m e c h a n i c a l a n d n u t r i t i o n a l s u p p o r t a n d p l a y e d a k e y r o l e i n s p e r m a t o g e n e s i sA l t e r a t i o n s i n S e r t o l i c e l l f u n c t i o n m a y l e a d t o a g e r m c e l l l o s s a n d d i s r u p t i o n o f t h e s e m i n i f e r o u s e p i t h e l i u m a n d i n t u r n w i l l l e a d t o i m p a i r e d s p e r m a t o g e n e s i sG a p j u n c t i o n s w e r e c o m p o s e d o f i n t e r c e l l u l a r p o r e s t h a t a l l o w t h e p a s s a g e o f s m a l l m o l e c u l e s b e t w e e n a d j a c e n t c e l l sT h e h a l f c h a n n e l c o n s i s t e d o f a h e x a m e r o f s p e c i f i c p r o t e i n s t h a t b e l o n g t o t h e g e n e f a m i l y o f c o n n e x i nC x 4 3 w a s t h e m o s t i m p o r t a n t c o n n e x i n i n t h e t e s t i s , w h i c h w a s l o c a l i z e d b e t w e e n S e r t o l i c e l l s , b e t w e e n L e y d i g c e l l s , a n d b e t w e e n S e r t o l i a n d g e r m c e l l sI t w a s r e p o r t e d t h a t s o m e t o x i c a n t s s u c h a s l i n d a n e a n d c a d m i u m c o u l d r e d u c e t h e c o n n e x i n s i n S e r t o l i c e l l a n d b l o c k t h e i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n b e t w e e n c u l t u r e d h u m a n a n d r a t c e l l sA l t e r a t i o n s i n g a p j u n c t i o n s m a y b e i n v o l v e d i n t h e i m p a i r m e n t o f s p e r m a t o g e n e s i s a n d t h e p a t h o g e n e s i s o f n e o p l a s t i c s e m i n o m a p r o l i f e r a t i o n a n d t h e n m a y d i s r u p t t h e c o n t r o l o f g e r m c e l l p r o l i f e r a t i o n b y S e r t o l i c e l l sW e p r e s u m e t h a t t h e m e c h a n i s m o f s u p p r e s s i n g s p e r m a t o g e n e s i s o f g o s s y p o l i s i n t h e s a m e w a yT h e p r e s e n t s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f g o s s y p o l o n S e r t o l i c e l l , d e t e c t t h e G J I C o n S e r t o l i c e l l a n d a p p r o a c h t h e m e c h a n i s m o f t h e C x 4 3 d e p r e s s i o nT h i s w o u l d b e a s i g n i f i c a n t w o r k i n t h e a n t i - f e r t i l i t y r e s e a r c h o f g o s s y p o l a n d w o u l d o f f e r a n e w i d e a f o r t h e s t u d i e s o f t h e o t h e r t o x i c a n t sI n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , a S e r t o l i c e l l l i n e , T M 4 , w a s t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f g o s s y p o l ,12 5 , 25 , 5 a n d 1 0m o l / L f o r 6 , 1 2 , 2 4 a n d 4 8 h o u r sC e l l v i a b i l i t y w a s a s s e s s e d w i t h C C K - 8 a s s a yG J I C i n c e l l s w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e s c r a p e l o a d i n g a n d d y e t r a n s f e r S L D T a s s a y ; V I I汕头大学医学院博士研究生学位论文 t h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3 w a s d e t e c t e d b y R T - P C R , i m m u n o f l u o r e s c e n c e a n d W e s t e r n b l o t a n a l y s i sI n t h e s e c o n d e x p e r i m e n t , w e i m p r o v e d t h e m e t h o d f o r S e r t o l i c e l l s s e p a r a t i o n f r o m m o u s e t e s t i s i n o r d e r t o o b t a i n m o r e p u r e c e l l sC e l l s w e r e i d e n t i f i e d b y F e u l g e n s t a i n i n g a n d F a s L d e t e c t i o nR T - P C R w a s p e r f o r m e d t o d e t e c t e t h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3I n t h e t h i r d e x p e r i m e n t , a d u l t m a l e m i c e w e r e t r e a t e d w i t h 1 5 m g / k g / d g o s s y p o l f o r 4 , 8 a n d 1 2 w e e k sT h e m o r p h o l o g y o f t h e s e m i n i f e r o u s e p i t h e l i u m w a s o b s e r v e d a n d C x 4 3 w a s a n a l y z e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yT h e S L D T a s s a y s h o w e d t h a t G J I C b e t w e e n a d j a c e n t c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d b y g o s s y p o lT M 4 c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h D M S O f o r 4 8 h o r 5m o l / L o f g o s s y p o l f o r 6 h , 1 2 h , 2 4 h a n d 4 8 h , r e s p e c t i v e l yT h e d e c r e a s e i n C x 4 3 m R N A o c c u r r e d a s e a r l y a s 6 h a f t e r t h e t r e a t m e n t o f g o s s y p o l a n d t h e e f f e c t c o n t i n u e d t o 4 8 h P 00 5 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f c o n n e x i n 4 3 p r o t e i n w a s g r a d u a l l y d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s w h e n c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h 12 5 , 25 , 5 , o r 1 0m o l / L g o s s y p o l f o r 2 4 h P 00 5 T h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3 w a s g r a d u a l l y d e c r e a s e d w i t h t h e i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f g o s s y p o l , a n d t h e e f f e c t o c c u r r e d a s e a r l y a s 6 h a f t e r t h e t r e a t m e n t a n d c o n t i n u e d u n t i l 4 8 hT h e c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h 12 5 , 25 a n d 1 0m o l / L o f g o s s y p o l f o r 2 4 hT h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3 w a s d e t e c t e d b y i m m u n o f l u o r e s c e n t a s s a yT h e i n t e n s i t y o f C x 4 3 i m m u n o s t a i n i n g w a s d r a m a t i c a l l y d e c r e a s e d a t a l l d o s e s u s e d P 00 5 I n t h e s e c o n d e x p e r i m e n t u s i n g t h e c o m b i n a t i o n e n z y m e d i g e s t i o n m e t h o d , t h e p u r i t y o f s e r t o l i c e l l s r e a c h e d a b o v e 8 5 %T h e R T - P C R a s s a y s h o w e d g o s s y p o l s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d C x 4 3 m R N AI n t h e t h i r d e x p e r i m e n t , m i c e w e r e t r e a t e d w i t h 1 5 m g / k g / d g o s s y p o l , t h e m o r p h o l o g y o f t h e s e m i n i f e r o u s e p i t h e l i u m w a s o b s e r v e d a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3 w a s d e c r e a s e d a s e a r l y a s 8 w e e k s a f t e r t h e t r e a t m e n t a n d c o n t i n u e d u n t i l 1 2 w e e k sI n s u m m a r y , C x 4 3 c o m p o s e d g a p j u n c t i o n s f u n d a m e n t a l l y , w h i c h w e r e o b v i o u s l y p r e s e n t e d b e t w e e n a d j a c e n t S e r t o l i c e l l sG o s s y p o l c o u l d r e p r e s s t h e G J I C b y d e c r e a s e d t h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3 a n d i m p a i r t h e f u n c t i o n o f S e r t o l i c e l l sT h e s e m i n i f e r o u s t u b u l e s o f m i c e d i d n ’ t s h o w a n y d i s o r d e r u n d e r t h e t r e a t m e n t o f l o w d o s e o f g o s s y p o lT h e r e s u l t s s u g g e s t e d t h e r e v e r s i b i l i t y o f t h e c o n t r a c e p t i v e e f f e c t o f V I I I汕头大学医学院博士研究生学位论文 g o s s y p o lH o w e v e r , g o s s y p o l c o u l d r e p r e s s t h e e x p r e s s i o n o f C x 4 3 i n S e r t o l i c e l l s , w h i c h i s o n e o f t h e m e c h a n i s m s o f t h e r e p r o d u c t i v e t o x i c o l o g y o f g o s s y p o lK K e e y y w w o o r r d d s s : : K K e e y y w w o o r r d d s s : : g o s s y p o l ; t e s t i s ; S e r t o l i c e l l ; g a p j u n c t i o n ; c o n n e x i n 4 3 ; g a p j u n e t i o n a l i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n I X汕头大学医学院博士研究生学位论文 缩略表 S C S e r t o l i c e l l 睾丸支持细胞 B S A B o v i n e s e r u m a l b u m i n 牛血清白蛋白 D M S O D i m e t h y l s u l f o x i d e 二甲基亚砜 c D N A C o m p l e m e n t a r y D N A 互补脱氧核糖核苷 酸 D A B 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d e n e 二氨基联苯胺 D E P C D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 焦炭酸二乙酯 G A P D H G l y c e r a l d e h y d e s - 3 - p h o s p h a t e 甘 油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶 d e h y d r o g e n a s e H E H e m a t o x y l i n - e o s i n 苏木素-伊红 H R P H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 m R N A M e s s e n g e r R N A 信使核糖核苷酸 O D O p e t i c a l d e n s i t y 光密度 P B S P h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e 磷酸盐缓冲液 R T - P C R R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n P C R 逆转录 P C R R N a s e R i b o n u c l e a s e 核糖核酸酶 S D S S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e 十二烷基磺酸钠 T r i s T r i s h y d r o x y m e t h y l 三羧甲基氨基甲烷 a m i n o m e t h a n e T a q T h e r m u s a q u a t i c u s D N A 栖热水生菌 D N A 聚酶 p o l y m e r a s e F a s L F a s l i g a n d F a s 配体 G J I C G a p j u n e t i o n a l i n t e r c e l l u l a r 细胞间 隙连接通讯 c o m m u n i c a t i o n C x C o n n e x i n 连接蛋白 E G F E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r 表皮生长因子 S L D T S c r a p e - l o a d i n g d y e t r a n s f e r 划痕标记 荧光染料 示踪 技术 X汕头大学医学院博士研究生学位论文 学位论文原创性声明 本论 文 是 我 个 人 在 导 师 指 导 下 进 行 的 工 作 研 究 及 取 得 的 研 究 成 果。 论 文 中除了特别加以 标注和致谢的地 方外, 不 包含 其他人或其 它 机构已经 发表或撰写过的 研究成果。 对 本 文的研究做出贡 献的个人 和 集体, 均 已在论文中以明 确方式标明。 本 人完全意识到本 声明的法 律 责任由本 人承担。 作者签名 : 日期: 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕 头大学 保存 本学 位论文 的电 子和 纸质文 档, 允许 论文 被查阅和 借阅; 学 校可 将本学位论文的 全部或部分内容 编入有关数 据 库进行检索,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文; 学校可以 向国家有关部门 或机构送交论文 并授权其保存、 借 阅或上 网 公布本学 位论文的全部或 部分内容。 对 于 保密的论文, 按 照保密的 有 关规定和 程序处理。 本论文属 于:保密( ) , 在 年解密后 适用本授权声明 。 不保密( ) 。 (请在以 上括号内打 “?” ) 作者签名 : 导师签名 : 日 期 : 年 月 日 日 期 : 年 月 日 I I汕头大学医学院博士研究生学位论文 实验内 实验内 容 容 实验内 实验内 容 容 第一部分 棉酚对 TM4 支持细胞系 Cx4 3 表达的影响 棉酚 g o s s y p o l ,又称为棉籽醇, 分子式为 C H O ,系萘的衍生物, 是一 30 30 8 种黄色的酚类化合 物, 天然存在于锦葵科的某些植 物中。 棉酚是非甾体男用口 服 避孕药物, 具有显著的抗男性生育效 果, 它的抗生育作用的研究由来 已久。 不 同 的学者从不同的方 面对棉酚 进行了 广泛的研 究,包 括 D N A 链的断裂、对细胞 内 酶和蛋白质的影响、 阿米巴沙门氏菌的突变 检测、 染色体突变、 姐妹染色单体 交 换、 微核形成、 异常精子形成、显性致死效应、对皮肤癌变发生的影响等,根 据 [ 1 ] 得到的结果,目前 普遍认为 棉酚是 通过一个 非遗传 毒性机制 完成其 作用机制 的 。 支持细胞 ( S e r t o l i c e l l ) 是雄性动物睾丸曲 细精管内 唯一的 体细胞,可以 维 持和 调 节 正 常 的 生 精 过 程 , 在 精 子 发 育 成 熟 的 过 程 中 具 有 极 为 重 要 的 作 用 。 S e r t o l i 细胞的结构 和功能 的完 整性 对生精 细胞 的增 殖和成 熟十 分关 键,其 改变 可导致生精细胞的 脱落和死 亡。 环境中的毒物或其 代谢产物 要作用 于生精细 胞,必 须要通过 血睾屏 障,在 与生精细 胞接 触 前, 首先 要作 用 于 S e r t o l i 细胞,或 者通 过 S e r t o l i 细胞而发 挥 作用。任何影响支 持细胞发 育、损 伤支持细 胞功能 的因素都 将会对 精子发生 产 [ 2 ] 生严重影 响。 大 量研 究证 实, 支 持细 胞是 多种 有 毒物 质作 用的 靶 细胞 ,是体 [ 3 ] 内、体外 实验 中 评价 男性 生殖 系 统毒 性损 伤的 良 好模 型 。在一些 化学 毒 物及 物理因素对雄性生 殖产生毒 理作用 时,支持 细胞功 能及结构 的破坏 均早于其 他 [ 4 ] 损害 。而且越 来越 多 的研 究表 明, 多 种生 精功 能障 碍 与支 持细 胞功 能 的改变 [ 5 ] 有很大的关联性 。 间隙连接 g a p j u n c t i o n , G J 是位于胞膜上连接 相邻细胞 间的通 路。 目前已知 , 除了红细胞,血小 板、骨骼 肌和成 熟精子外 ,其他 组织中均 存在间 隙连接。 它 们 允许 相对 分 子 质 量 为 1 0 0 0 - 1 6 0 0 以下 的离 子 或 分 子 直 接通 过 ,如 代谢 产 物, 营养物质和第二信 使, 参与信号的传递和 保持代谢 的连续 性。 参与多个细胞活 1汕头大学医学院博士研究生学位论文 动过程:内环境平 衡、新陈 代谢、 电偶联、 提高组 织反应性 ,以及 对胚胎形 成 和细胞增殖分化的 控制等。 [ 6, 7] 近期有多个文献报 道 六氯环己烷、滴滴 涕、林丹 、五氯 苯 酚、二硝 基苯和雌激素样因 子等毒素 能减 少 S e r t o l i 细胞的连接蛋白 , 并使 S e r t o l i 细胞上 C x 4 3 的数量减少, 从而影响间隙连接通讯( G J I C ) 的功能, 进一步影响到睾 丸 S e r t o l i 细胞对精子发生的 正常功能, 并对睾丸肿瘤的发生可能也 有影响。 因此 , 我们推测棉酚对雄 性生殖功 能的影 响可能首 先从影 响 S e r t o l i 细胞的间隙连接 蛋 白开始。 T M 4 细胞是美国 A T C C 公司生产的永生小 鼠睾 丸 S e r t o l i 细胞系, 本研究 通 过棉酚 染 毒 T M 4 细胞, 探 讨棉 酚 对 S e r t o l i 细胞间 隙 连接 通 讯功 能 的 影响 ,对 于研究棉酚的抗生 育作用具 有重要 意义。对 于我们 进一步开 发低毒 性男性避 孕 药有指导意义,同 时可为研 究其他 环境毒性 物质机 理提供新 思路。 1 实验 细胞 T M 4 细胞株 A T C C 公司 C R L - 1 7 1 52 主要 仪器 M i n i T r a n s - B l o t S y s t e m 转印系统 B I O - R A D 公司 M i n i P R O T E A N 3 S y s t e m 电泳系统 B I O - R A D 公司 B i o p h o t o m e t e r 核酸蛋白分析仪 E p p e n d o r f 公司 台式高速低温离心 机 E p p e n d o r f 公司 小型离心机 E p p e n d o r f 公司 低温冰箱 S A N Y O 公司 凝胶成像系统 W E A L T E C 公司 2汕头大学医学院博士研究生学位论文 电泳仪 W E A L T E C 公司 紫外分光光度计 W P A 公司 P C R 仪 B I O - R A D ,E p p e n d o r f 公司 光学显微镜 L e i c a 公司 荧光影像扫描仪 B I O - R A D 公司 细胞培养箱 C O R e v c o r c o 公司 2 倒置显微镜 L e i c a 公司 3 主要 试剂 D M E M / F - 1 2 G I B C O 马血清 H y c l o n e C C k - 8 细胞 增 殖 及 细 胞 毒 性 检 测 试 同仁试剂 剂盒 丙烯酰胺 上海生工 B B I 分装 亚甲叉双丙烯酰胺 上海生工 T r i s b a s e u l t r p u r e 华美生物 S D S u l t r p u r e 上海生工 A M R E S C O 分装 P M S F 上海生工 A M R E S C O 分装 N P - 4 0 华美公司 二巯基乙醇 上海生工 B I 分装 甘氨酸 华美生物 A M R E S C O 分装 T w e e n - 2 0 上海生工 A M R E S C O 分装 E D T A u l t r p u r e 上海生工 A M R E S C O 分装 E G D A 上海生工 A M R E S C O 分装 溴酚兰 上海生工 A M R E S C O 分装 3汕头大学医学院博士研究生学位论文 丽春红 上海生工 A M R E S C O 分装 甘油 上海生工 A M R E S C O 分装 D T T u l t r p u r e 上海生工 B B I 分装 二甲苯青 F F 上海生工 A M R E S C O 分装 考马斯蓝 G 2 5 0 上海生工 A M R E S C O 分装 考马斯蓝 R 2 5 0 上海生工 B B I 分装 P V D F 膜 M i l l i P o r e 兔抗 C x 4 3 Z y m e d F I T C - c o n j u g a t e d a n t i - m o u s e I g G 晶美公司 T r i z o l r e a g e n t I n v i t r o g e n T a q D N A 聚合酶及缓冲液 F e r m e n t a s d N T P F e r m e n t a s B S A S i g m a D M S O S i g m a T r i s ? H C l A m r e s c o T w e e n 2 0 A m r e s c o T r i t o n X - 1 0 0 A m r e s c o D N A m a r k e r F e r m e n t a s P r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t M a r k e r F e r m e n t a s P B S 粉末 博士德 枸橼酸盐 粉末 博士德 S S C 粉末 博士德 T M R e v e r t A i d M - M u l v 逆转录试剂盒 F e r m e n t a s 免疫组化检测试剂 盒 D A B m o u s e Z y m e d 4 实验 步骤 41 T M 4 细胞培养 配制细胞培养基 : 1 : 1 m i x t u r e o f H a m ' S F 1 2 m e d i u m a n d D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m ( D M E M ) , 12 g / L 碳酸氢钠 和1 5 m M H E P E S , 9 25 % 小牛血清 , 4汕头大学医学院博士研究生学位论文 5 % 马血清 , 25 % 胎牛血清 。培养温度: 3 70 ? 空气: 9 5 % ; C O , : 5 % 。常规复 2 苏冻存的 T M 4 细胞,每天观察细 胞生长情 况, 1 - 2 天换液一次。 4 - 5 天 传 代 一 次 。 42 细胞毒性 实验 取T M 4 细胞在 9 6 孔板上培养, 每孔细胞数 5 0 0 0 0 , 不同浓度棉酚进行细胞毒 性 试验:选取 00 1 , 01 , 1 , 1 0 , 1 0 0M / L 5 个浓度棉酚,测定 不同浓度 下细胞 的 E C , 50 确定最佳实验浓度 。 1 原代培养支持细胞, 取对数生长期细胞, 用 D M E M 培养基漂洗细胞 1 次 , 04 % 台盼兰进行活细胞 检查, 活细胞率大于 9 5 % 。 并 用 1 0 % 胎牛血清 D M E M 培养 4 基将细胞稀释至密 度为 3 × 1 0 / m l 。 2 取 9 6 孔板,每孔加入 02 m l 稀释好的细胞悬液 , 3 7 ? 5 % C O 细胞培养箱中培 2 养。 3 用 D M S O 液溶解棉酚,配成 浓度为 1 0 m m o l / L 工作液。 4 培养 2 4 h ,待细胞贴壁后去 掉旧培养 基,向 各孔中加 入含有 不同剂量 的待测 棉酚溶液 ,使 终 浓度 00 1 , 01 , 1 , 1 0 , 1 0 0M / L 5 个浓度组 , 1 个空白组 ,并 保证 D M S O 浓度 00 5 % v / v , 每个剂量设 3 个平行样。 5 3 7 ? 下孵育 2 4 小时。 6 向各孔中加入 1 0l 的 C C K - 8 溶液。 7 3 7 ? 下孵育 4 小时。 8 测定 4 5 0 n m 处的 O D 值。 9 计算:根据公式 ?,通过细胞吸光度 O D 计算棉酚对细胞的 抑制率, 并应 用 G r a p h P a d 软件 计算 出 半 数 有 效 浓度 E C 5 0 ,选 取远 离 E C 5 0 的剂 量作 为 后 续实验的最 高剂量 组, 然后 依次做 2 倍稀释,分 别作为 中剂 量、 次低剂 量和 低剂量。 细胞活力(% ) [ A 加药 - A (空白) ] / [ A (0 加药) - A (空白)] × 1 0 0 ? A (加药) :具有细胞、 C C K - 8 溶液和棉酚溶液的 孔的吸光 度 A (空白) :具有培养基和 C C K - 8 溶液而没有细胞的 孔的吸