DNA电泳步骤

DNA电泳步骤 DNA电泳 一，准备工作 1，实验器具与材料: (1)移液枪和枪头:100ul (2)三角烧瓶:50ml或100ml一个 (3)琼脂糖 (4)量筒或定量瓶:50ml或100ml一个 (5)微波炉或电炉 2，实验器具的处理与准备 (1)电泳板及电泳槽:用自来水冲洗晾干备用 (2)三角烧瓶、量筒或定量瓶洗刷干净 3, 试剂配制和准备: (1) 电泳缓冲液(TAE): 0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液: 将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。再用10M NaOH调节溶液PH值至8.0。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。 50×TAE溶液: 在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5mol/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。 (2)琼脂糖溶液(根据不同要求选择不同浓度，下以2.0,为例): 将50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解1g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，摇匀后再煮至沸腾。溶化的琼脂物冷却至60?左右时(即不烫手，注意不要过冷否则倒胶时易产生不均匀)加入25ul NA-Green(2000:1)，充分混匀后，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。 (3)加样缓冲液(Loading Buffer):一般为6×Loading Buffer。 (4)DNA Marker(ladder) 二，电泳鉴定时注意事项: 注意佩戴一次性手套，尽量避免皮肤接触染料。无论做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。 五，电泳步骤 1， 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解1g琼脂糖(2%)。电炉上煮沸后加入NA-Green 25ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。 2，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。 3， 加样:DNA Marker:1ul Marker，1ul Loading Buffer，4ul TAE或水混匀于塑料膜或一次性手套上，加入孔中。PCR样品:5ul 样品DNA，1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。(每孔点样的体积一般少于25ul，一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定) 4， 接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。(<12 V/cm) 5， 电泳约50min后，紫外灯检测。至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端1cm时，切断电源。 琼脂糖凝胶浓度 可分辨的线性DNA片段大小(kb) 0.4 5~60 0.7 0.8~10 1.0 0.4~6 1.5 0.2~4 1.75 0.2~3 2.0 0.1~3 常见问题: 问题 原因 解决办法 1) DNA降解 避免核酸酶污染 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能2) 电泳缓冲液陈旧 力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液 电泳时电压不应超过20V/cm，温度,30?;巨大DNA链电3) 所用电泳条件不合适 泳，温度应,15?;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲DNA带模糊 能力 4) DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量 5) DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 6) 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白 7) DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA 1) 对于λ/Hind III片段cos位点复性 电泳前于65?加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟 不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适 电泳电压不超过20V/cm;温度,30?;经常更换电泳缓冲液 3) DNA变性 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热 增加DNA的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏1) DNA的上样量不够 度稍高，上样量可适当降低 2) DNA降解 避免DNA的核酸酶污染 带弱或无DNA带 3) DNA走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 4) 对于EB染色的DNA，所用光源不合适 应用短波长(254nm)的紫外光源 5)忘记加染料，正负极弄反了 注意添加染料，将含样品一端置于负极(黑色) 1) 小DNA带走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 2) 分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 DNA带缺失 3) DNA 变性 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA 4) DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析 1)配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1~2mm即可 是同时配制的 可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较 Marker 扭曲 2)电泳时电压过高 漂亮了.然后再调电压，上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降 后再加电压. 3)胶太厚，胶孔太大，点样时把胶底层挫在温度不是过冷是倒胶，且倒胶时沿一侧缓缓倒入， 穿，胶面不平，胶未充分融化，里面有杂质