【doc】RP—HPLC测定促肝细胞生长素水溶液的化学稳定性

【doc】RP—HPLC测定促肝细胞生长素水溶液的化学稳定性 RP—HPLC测定促肝细胞生长素水溶液的 化学稳定性 第18卷第4期 2001年7月 沈阳药科大学 JoumalnfShenyangPharmaceuticalUniversity V0】.L8No.4 JI】1.200LP.235 文章编号:1006—2858(2001)04—0235—04 RP.HPLC测定促肝细胞生长素水溶液的化学稳定性 赵海英.王思玲, (1.沈阳药辑大学药学院,辽宁沈阳110016 袁树军,苏德森 2.河北永光制药有限公司.河北三河065201) 摘要:采用RP-HPLC浩,以促肝细胞生长素(PromotingHePatocyteGrowthFact.rlPHGF)不同组 分的相对含量变化为指标考察了pH,温度及光照对PHGF水溶液化学稳定性的影响,结果表明 PHGF水溶液在球箱条件下最稳定,其次是在偏酸性,中性,室温和偏碱性条件下.在光照条件下各 组分的含量变化最大.通过we-b_】l】方程求得PHGF水溶液在不同 pH值,室温和光照下降解 10%所需的时间. 关键词:促肝细胞生长索;高效灌相色谱法;化学稳定性 中囝分类号:R914文献标识码:A PHGF是从乳猪新鲜肝脏中提取的带正电荷 的小分子量的多肽类活性物质.临床上用于重症 肝炎(肝功能衰竭早期或中期),慢性活动性肝炎, 肝硬化的综合治疗_l.目前国内已有多家正在 生产其粉针剂,通常采用Folin-酚法l2测定其含 量,但该法不能表明PHGF在不同条件下化学稳 定性的变化.本文在文献l3的基础上采用RP- HPLC对其在不同条件下的化学稳定性进行考 察,从而为其在临床上的应用及PHGF制剂的进 一 步研究提供科学依据. 1仪器与材料 日立一705高效液相色谱仪(日本日立公司);日 立1)-7500积分仪(日本日立公司);超级恒温器(上 海市上海县实验仪器厂);pHS-2C型精密酸度计 (上海雷磁仪器厂);促肝细胞生长素原料液(长春 市生化制药厂);注射用促肝细胞生长素(长春市生 化制药厂);磷酸二氢钾(汕头市化学试剂厂). 2方法与结果 2.1紫外吸收光谱的测定 取PHGF原料液适量,加蒸馏水配制成 76g/mL溶液,以蒸馏水为空自在190,350Dm 扫描,得其吸收光谱,见图1.由图可知,PHGF 在261.4nm处有最大吸收,故选择261llm作为紫 外检测渡长. 2.2色谱条件 色谱柱:大连依利特ODS—柱(4.6midx 收稿日期:2000—11—21 200mm,5/*m);流动相:O.05mol/L磷酸二氢钾 溶液,凋pH至2.5;流速:0.8mL/min;检测渡 长:261nm;柱温:3S?;进样量:2O” Fig?lTI1eUVspectrumofpromotingllepat0cylegrowth factor(PHGF) 2.3曲线的绘制 精密量取PHGF原料液,加蒸馏水配制成 760~g/mL溶液,冷藏保存,备用.精密移取2.0, 4.0,6.0,8.0,10mI于10mI瘩量瓶中.加蒸馏水 稀释至刻度,摇匀.分别吸取20L进样,记录色 谱图及色谱蜂面积S.PHGF为多组分混合物, 其主要成分的色谱峰保留时间分别为4.88, 沈阳药科大学第18卷 8.07,9.56,14.88和21.78rain,分别对每个主要 成分的S,C进行线性回归,结果见表1和图2. 结果表明PHGF的各主要成分在152, 760ugtmL线性关系良好. Thb.1I5缸?da州cnreofPHGFatdifferentr叠f=3) 暑苎 i墨趣 Fig.2TheHPLCchromatogramofrawmalerialsolution ofPHGF 鉴于PHGF为多组分}昆台物,因此只选择其中 具有代表性的tR=9.56min的峰对PHGF的精密 度,回收率及在不同条件下的稳定性进行研究. 2.4精密度实验 Fig.3Thepeakarea.timecul~eofthecomponentwith fR4.88min ?一pH4.0;-一pH7.0;?一pH9.0;X--Refrigerator; ?一Ro0mtemperature;?一Iight 配制高,中,低3种不同浓度的PHGF原料 液各5份,置于冰箱内保存,测定日内相对标准偏 差与日间相对标准偏差,测定结果见表2. Tab.2TheccelTicientofvariancewithin-dayandhe~ween- dayCH:51 c0nCentratioa (旭?mL) 一 Within-day 一一,!! Me%RSDMeanRSD (g?mL’)(%)(g?mL,)(%) 2.5回收率实验 精密量取一定量PHGF水溶液,分别加入不 同浓度的PHGF原料液,混合均匀后,定容至 10mL,进样2OL,测定结果见表3. Thb.3Reco’-Hj帮ofPHGFsointinuf=3 2.6不同条件下PHGF的化学稳定性 分别取PHGF粉针剂3支,用pH2.5的磷酸 二氢钾溶解并稀释至5OmLI以1moI/IHC[或 1II10l/L氢氧化钠啁节pH值分别为4.0,7.0和 9.0;另取粉针3支.用蒸馏水溶解并稀释至 50mL,分别置于冰箱,室温和光照条件下进行考 察,分别于0…248,10,12和16h取样,记录各峰 的峰面积.以不同峰在不同条件下的蜂面积对 时间作图,见图3,4,5.6和7. 6…)r 4l】(1 1lI() 1}】! Fig.4Thepeakafea?timecui-veofthecoml~nentwith f?=8.07min ?一pH4.0;_pH7.0;一pm.0;×Rdrigemtor; ?一 R?mtemperature;?一lJight 第4期赵海英等:RP-HPLC测定促肝细胞生长索承溶渣的化学稳定性 Fig.5TheDeakare8?nn_ecurveofthecomponentwith fR=956rain ?一pH40;_一pm0;一pm0;X--Refrigerator; ?-- Roomtemperature;?一LLght ,/ Fig.7TheDeakarea-tlm~curveofthecomponentwith t?=2178min ?一pH4.0;_一pH7.0;A—pH90;XRefrigerator; ‘一R0.[IItemperature;?一Ljght 从上述5个图的比较结果可知,在放置的前 Fig6Thepeaka8’timecurVeofthecomponentwith fRH.髓min ?一pH40;_一pm.O;一pH9.0;X--Refrigerator; -一R0眦ntempexatazre;?一Ligbt 4h,溶液基本稳定,从8h后,溶液开始有明显的 变化,随着时间的延长,溶液开始出现浑浊. PHGF水溶液在光照条件下最不稳定,其次在偏 碱性和室温条件下,在偏酸性较中性稳定,在冰箱 中放置最稳定.在放置的过程中,各个峰的变化 不一致,有的峰面积增加有的峰面积减少. PHGF水溶液是具有生物活性的多肽类物 质,室温放置伴随着活性的改变,峰面积减少的峰 有可能反映其活性的变化,而峰面积增加的峰可 能是PHGF的降解产物,这些须进一步的活性实 验证明.因此我们只选择了峰面积减少的t= 956n峰,呈现反S型递减,所采用Weibull 拟合法处理,计算PHGF水溶液在不同条件下降 饵10%所需要的时间结果见表4. Tab.4TheWeibullequationandt0. ,underdifferentconditions 3讨论 PHGF是I~recque等最初从断乳大鼠肝 脏中提取的多肽类物质,后来国内从乳猪肝脏中 提取,具有同样的疗效由于采用的提取工艺不 同所得的分子量不同,一般分子量在8000, 15000.本文利用Folin一酚法对PHGF定量的基 础上,尝试用HPLC法,选取色谱峰面积较大的 峰对PHGF水溶液的化学稳定性进行了研究. 根据临床用药的,80,120mgPHGF加 入10%葡萄糖液250mL中静脉滴注,故此浓度 为基础,选择高,中,低3个浓度进行了精密度实 验. 由表4可知,PHGF水溶液在不唰口H值,室 温和光照条件下,降解10%所需的时间顺序为 pH40>pH7.0>室温>pH9.0>光照.采用 一 238沈阳药科大学第18卷 RP-HPLC法对PHGF水溶液的化学稳定性进行 了研究,结果表明PHGF水溶液在光照下放置是 最不稳定的,这样就要求临床输注及其制剂制备 工艺条件要特别注意保持PHGF的稳定性. 参考文献 [IJ傅建明,陈玲.注射用促肝细胞生长索[J].中国新药 杂志,19976(1):40—41. [2]LoweryOH,RosebreoughNJ,LewisLA,etalProtein measurementwiththeFohnphenolreagent[J].JBid (3hem,1951,193:265—275 [3]张海橙,张宜俊,孔祥平,等.促肝细胞生长索人体内 药代动力学的研究[J]中国生化药物杂志,1997,18 (2):8688. [4]gaBrecqueDR,PeschLAPreparatfonandpartialchar— acterizationofhepaticregenerativestimulatorsubstance (SS)fromratliver[J].JPhol,1975,248(2):273— 284. Thedeterminationofthechemicalstabilityofthe promotinghepatocytegrowthfactorsolutionby RP.HPLC ZHAOHai—ying,WANGSi—ling,YUANShu-jun,SUDe—sen (ColLegeofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110 016,China) Abstract:AmethodhasbeenestablishedtoexaminetheeffectofpH,temperat ureandlightonthePromot— ingHepatocyteGrowthFactor(PHGF)solutionbyRP—HPLC,accordingto thecontentvariationofthe mainpeaksTheresultsindicatedthatithadbeststabilityunderrefrigeratorconditions,secondlyunder acidicconditions,neutralCOnditions,l’Y3omtemperature,alkalescentconditions,andthenworststabilityun— derlightconditionsbytheWeibul1equationto9ofPHGF. Keywords:promotinghepatocytegrowthfactor(PHGF);HPLC;chemicalstability