利福霉素高产菌株的诱变选育

利福霉素高产菌株的诱变选育 利福霉素高产菌株的诱变选育 ? 工程技术? 利福霉素高产菌株的诱变选育 李翠民 (漯河南街村药业集团制药有限公司,河南漯河462000) 摘要:以利福霉素SV自身耐受性菌株为出发菌株,经HNO!+uv和HNO+uv+Lic1 分别复合 诱变后,获得两株变异菌株.结果表明:其发酵单位大幅度提高,较出发菌株分别提 高了 17.8%和15.1%.并且其遗传稳定性较好. 关键词:地中海诺卡氏茵;利福霉素SV;诱变;变异 中图分类号:R282.7l文献标识码:A文章编号:1671—931X(2007)03—0084—02 利福霉素(Rifamycin)是具有抗分枝菌活性的安莎 霉素(Ansamyein)类抗生素,也是唯一的商业上投入生 产的安莎霉素.利福霉素SV是利福霉素类抗生素的主 要成员之一,是高效的抗革兰氏阳性菌和结核杆菌的 抗生素,广泛应用于结核病,麻风病和与艾滋病有关的 分枝菌感染的治疗.目前,国内利福霉素SV的发酵水 平为国外的1/3,其原因可能是SV对菌体生长和产物 合成的强烈抑制所致,为了打破产物自身抑制,先用利 福霉素SV梯度平板筛选出自身抗性菌株,再以此抗性 菌株为出发菌株,经HNO2,紫外线,Liel复合诱变,筛 选,分离纯化,筛选到高产菌株56—490#和56—465#,其 发酵单位较出发菌株分别提高17.8%和15.1%. 一 ,和方法 (一)菌种 1.地中海诺卡氏菌(Nocardia.mediterranei)168# 漯河南街村药业集团制药有限公司提供 2.藤黄八叠球菌(Sarcinalutea)28001 漯河南街村药业集团制药有限公司提供 (二)培养基和培养条件 1.斜面培养基(%) 蔗糖3.0,蛋白胨0.5,NaNO30.2,KC10.05,MgSO 0.05,K2HPO0.13,FeSO0.00l,琼脂2.0. 2.种子培养基(%) 葡萄糖1.5,淀粉1.5,蛋白胨1.0,豆粉1.0,CaCO 0.2,KNO30.5. 3.发酵培养基(%) 葡萄糖l0,蛋白胨1.0,豆粉1.0,鱼粉0.5,Ca— CO30.5,KNO30.8,KH2PO40.02,CoC121r/ml. 4.培养条件 母斜面28?培养10天,子斜面28~(2培养6.5天, 摇瓶种子28?培养48hr,摇瓶发酵28?120hr. (三)主要仪器设备 721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司生 产),摇床(四川长征制药厂). (四)筛选方法 1.初筛 初筛采用琼脂块法:当分离平板上的单菌落长到 一 定程度后,用打孔器打琼脂块,然后将打下的琼脂块 放在涂有藤黄八叠球菌的鉴定盘中,30~(2培养 l6一l8hr,挑选形成抑菌圈大的单菌落转接试管斜面. 2.复筛 复筛分两次,第一次采用一级发酵,第二次采用二 级发酵,用初筛所转接的斜面,接摇瓶进行一级发酵, 挑选发酵单位较高的菌株进行二级摇瓶发酵,验证其 产量 收稿日期:2007—03—12 作者简介:李翠民(1970一),女,河南临颍人,漯河南街村药业集团制药有限公司助 理工程师,主要从事利福霉素菌种的选育工作. 武汉职业技术学院二00七年第六卷第三期一总第二十七期一 (五)效价测定 ?生物法:用杯碟法生物测定,鉴定菌为藤黄八叠 球菌. ?化学法:用氧化——还原法测定效价. 二,菌种处理和选育方法 (一)菌种处理 将培养到对数期的菌丝悬液,倒入装有石英砂一 一 玻璃珠(15:4)的内壁凸凹不平的不锈钢试管中,于 旋涡混合器上旋转30min,用1O层擦镜纸过滤,得到用 于诱变处理的菌丝悬液. (二)利福霉素sv浓度梯度平板的制备 将不含利福霉素SV的培养基15ml倒入9em培养 皿制成斜面,再倒入含有一定量(0.1-0.2%)利福霉素 SV的培养基,平放,凝固后即为利福霉素SV浓度梯度 工程技术 EngineeringTechnology 平板. (三)诱变方法: 1.HNO2+UV复合诱变 采用15W紫外灯,波长253.7nm,距离30em,照射 30S,以0.1mol/L的NaNO溶液为诱变剂,处理4min. 2.HNO2+UV+LiC1复合诱变 LiC1浓度为0.5%(w,,,),紫外条件同上,HNO处 理2min. 三,结果与 (一)自身耐受性菌株的筛选 将出发菌悬液涂布于含0.1%利福霉素SV浓度梯 度平板上,在高浓度区筛选到5株抗性菌株168--56#, 168--83#,168—12#,168--59#和168—65#,其摇瓶效 价与原始菌摇瓶效价比较如表1所示. 表15株抗性菌株与原始菌株比较 . 赫麓 摇瓶效价584264966383621558816466 提高百分O . OOl1.29.36.4O.71O.7率(%) 从表1可以看出,自身抗性菌株大多为高产菌株. (二)HNO2+UV复合诱变 以抗性菌株168—56#为出发菌株,通过对诱变剂 HNO+UV处理时间及终浓度对菌株致死率与诱变率 的分析,确定uV照射30S,HNO处理4min诱变效果 较好(见表2). 表2HNO2+UV诱变条件的确定 (,30S30S嚣Os:iss譬 HNO2(t)2nlin4min2min4min 致死率(%)9O.699.198.29O.O 正变率(%)0.4O.2 按此条件进行诱变,从4200个单菌落中筛选出17 个高产菌株,经复筛,其中56—465#表现最为突出,发 酵单位比原出发菌株提高15.1% (三)HNO+uv+LiC1复合诱变 仍然以抗性菌株168—56#为出发菌株,经过诱变 剂HNO+uV+LiC1的处理时间及终浓度对菌体的致 死率与诱变率的分析,确定LiC1终浓度为0.5%,uv ,诱变效果较好(见表 照射时间30S,HNO处理2min时 3). 表3LiC1+HNOz+UV诱变条件的确定 Licl(%)_0.黾5 UV(t)30S30S60S15S ttN0,(t)2min4min2min4min 致死率(%)99.899.961OO99.4 正变率(%)O.6O.2O.2 在此诱变条件处理下培养出的单菌落3500株,经 初筛选出21株产量较高的菌株,再经复筛,纯化,筛 选,最终得到3株高产菌株,结果如表4所示.其中,效 价最高者是56—490#菌株,发酵单位为6869u/ml.而 原始菌株发酵单位仅为5829u/ml,效价提高17.8%. 表43株高产菌株与原出发菌株比较 (四)传代稳定性 对56—490#菌株连续进行三代传代试验,以观察 其产量的稳定性.三代的发酵单位与对照组比较如表 5. 表5试验结果表明,56-490#菌株的传代稳定性较好. 0?鬟蕾童i鬣枣馘 发酵单位提高百发酵单位提高百发酵单位提高百 (u/m1)分率(%)(u/m1)分率(%)(u/m1)分率(%) CK57880.005856O.o05802O.o0 盼一490#6807l766904l7 .9681717.5 四,讨论 通过物理,化学诱变方法筛选利福霉素的高产突 变株,诱变剂的浓度与诱变处理时间对诱变频率及诱 变幅度均有较大的影响.对于复合诱变剂,复合成分一 经变化,其浓度与诱变处理时间也必须随之调整,在试 验中应掌握这一点.(下转第95页) 李翠民:利福霉素高产菌株的诱变选育 武汉职业技术学院二OO七年第六卷第三期一总第二十七期一 .防垢饭譬譬田 图4防垢板与箍紧圈 场前景.本文所介绍的换热与防垢方法,能保证海水淡 化装置在一次出海周期内稳定运行;在400马力的渔 船上,以3.5m加热面积,平均每小时可产淡水l20kg, 足以维持出海船员的生活需要. 工程技术 EngineedngTechnology 参考文献: [1]解利昕,李凭力,王世昌.海水淡化技术现状及各种淡化 方法评述[J].化工进展,2003,22(10):1081—1084 『2]王树刚,王如竹.船舶余热回收现状及吸附制冷应用前 景[Jj_中国修船,2003,(3):24—26 [3]陈孙艺.螺旋折流板结构与功能.化工设备与防腐蚀[J]. 2003.(6):23—25 [4]梁旭琴,陈其骥,龚正玮.螺旋折流板换热器制造技术[J] 石油化工设备,2005,34(9):50—52 [5]金跃,王学,李明义.连续型螺旋折流板式换热器的制造 [J].炼油与化工,2004,(3):37 [责任编辑:刘骋] SolutionforHeatTransferandAnti-scaleinDesaltingEquipment UsingFlueGasofFishingVessels YINGWen——baoLUHong-sheng (WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430074,China) Abstract:Howtointensifyheattransferandpreventscalingaretwodifficulttechnicalproble mstobesolvedin desahingseawater.Thispapersuggestsinstallingcontinuoushelicalshapebafflesintheheate randsettingupanti— scaleontheworkingsurface. Keywords:fluegasoffishingvessels;desalt;continuoushelicalshapebaffles;anti-scale - /'.51:1:.,lt1.1,-11,1}1111 (上接第85页) 目前,在抗生素高产菌株选育中,诱变育种仍然是 普遍应用并且十分有效的方法.本文采用利福霉素SV 浓度梯度平板理性化筛选出抗性菌株,在以此抗性菌 株为出发菌,对其进行HNO:+UV+LiCI复合诱变,进行 高产菌株的筛选,效果良好,不仅增加了育种的方向 性,而且也加快了菌种选育的进程. 参考文献: [1]Rinehart.K.L.JrShieldLSChemistryoftheansamycinan tibiotics[J].FortschrChemOrgNatwyst1997,33,231 l2JGiancarloLancini,FraneeseoParenti,GranGnalbertoGallo. 抗生素一多学科研究入门[M].北京:人民卫生出版社, 1998. [3]徐积恩,朱明珍.抗生素[M].北京:科学出版社,1982. 14JSepkowitzKARafalliJRileyLetalTuberculosisinthe AIDSera[JJ.ClinMicrobiolReus.1995,8(2),180. 15JJIN.Yu—Kwneta1.RationalSelectionofRifamyein—Priducin Strains.ChineseJournalofAntibiotics,1991,l6(4):241— 245(inChinese). [责任编辑:刘骋] StudyonBreedingofRifamycinProducingHigh-yieldStrain LICui——ming (PharmaceticalCo.,LtdSubsidiarytoPharmaceuticalGroupofLanjieVillage,LuoheCity,L uohe462000,China) Abstract:theexperimentinthepaperchoosesauto— tolerancestrainofRifamycinSVasstartingstrain,after compoundinductionsbyHNO2+UVandHNO2+UV+Liclrespectively,twomutatedstrainsarerendered.Theresult showsthatitsfermentunitgetsaggrandizeddramaticallyby17.8%and15.1%respectively.a ndthisadvantagecan passonconsistently. Keywords:NocardiaMediterranean;RifamycinSV;induction;mutation 应文豹,卢洪胜..渔船尾气余热淡化海水装置换热与防垢问题的解决 武汉职业技术学院二00七年第六卷第三期一总第二十七期一