浅谈阿斯匹林类药物和α┐晶体蛋白保护酯酶的失活

浅谈阿斯匹林类药物和α┐晶体蛋白保护酯酶的失活 浅谈阿斯匹林类药物和 α?晶体蛋白保护酯 酶的失活 【关键词】 布洛芬 关键词: α-晶体蛋白阿斯匹林布洛芬酯酶糖化氨甲酰化类固醇 摘 要:目的 研究阿斯匹林类 药物和 α-晶体蛋白对酯酶的保护作用. 方法 凝胶色谱分离牛 α-晶体蛋白，酯酶分 别与糖类、磷酸糖、氰酸钾和激素加阿斯匹林(Asp)、布洛芬(Ibu)、扑热息痛 (Para)和 α-晶体蛋白温育，采用分光光度法测定酶活性. 结果 糖化、氨甲酰化和 类固醇诱导酯酶失活的作用呈浓度依赖性，类固醇失活效应最快.10mmol L-1 Asp 可部分保护果糖和类固醇诱导酯酶的失活，尽管Ibu 抑制酶活性，但其羧基化(Ibu-1) 和羟基化(Ibu-2)代谢物有保护作用.α-晶体蛋白与酯酶摩尔比为 1 1 时，可完全 特异地保护果糖、果糖 6-磷酸和泼尼松龙-21-半琥珀酸诱导的酯酶失活而在 1 4 时，保护率分别为 67.0，55.0和 38.3. 结论 Asp 和 Ibu 保护酯酶免于失活的作用 机制可能不同α-晶体蛋白作为分子伴侣可保护酯酶免于失活. Keywords:α-crystallinaspirinibuprofenesteraseglyca-tioncarbamylationsteroid Abstract:AIM To investigate the protection effect of as-pirin-likedrugs andα-crystallin on inactivation of esterase by glycation.METHODSBovineα-crystallin was isolated by gel chromatography.Esterase wereincubated with sugars，sugar phosphate，potassium cyanate and steroid orwith as-pirin，ibuprofen，paracetamol andα-crystallin respectively.The ?tometer.RESULTSenzyme activities were assayed by the spectrophoInactivation of esterase was induced by glycation，carbamylation andsteroid in a concentration-dependant manner.Steroid displayed a morerapid inactiva-tion effect than others.10mmol L-1 Aspirin partiallypro-tected esterase against inactivation by fructose and steroid.AlthoughIbuprofen inhibited esterase，its carboxylated(I)and hydroxylated (II)metabolites showed a limited protec-tion.α-Crystallin fully protectedesterase against inactivation by fructose ， fructose6-phosphate andprednisolone-21-hemisucciate at a molar ratio of1 1，but only to theextent of67.0 ， 55.0and38.3of activity at a molar ratio of14respectively.CONCLUSION Aspirin and ibuprofen may play a differentrole in protection enzymes against inactiva-tion.α-Crystallin acts as amolecular chaperone to protect es-terase against inactivation. 0 引言 临床流行病和实验研究明阿斯匹林类 药物作为非甾体类抗炎药 ， 可 预 防 和 治 疗 白 内 障 等 一 类 结 构 性 疾 病 ( conformationaldisease).α-晶体蛋白分子伴侣(molecular chaperone)功能的发 现，为白内障发病机制的研究提供了新的理论依据.糖化、氨甲酰化和长期大量应用 激素等是白内障发病的主要危险因素〔1-3〕 .酯酶具有重要的生理功能，糖尿病患 者、实验性大鼠血浆及老年性白内障晶状体中酯酶活性下降，可能在糖尿病并发症 和老化病程中起重要作用〔4-7〕 .我们通过观察阿斯匹林类药物和 α-晶体蛋白对酯 酶的保护作用，探讨白内障的发病机制和潜在的治疗途径. 1 和方法 、核糖、 果糖、6- 1.1 材料 酯酶(猪肝脏羧酸酯酶 EC3.1.1.1) 、果磷酸葡糖(G6P) 糖 6- 磷酸、葡萄糖、氰酸钾、泼尼松龙-21-半琥珀酸(P-21-H)、阿斯匹林(Asp)、布 洛芬 (Ibu)和扑热息痛(Para)、牛血清白蛋白和鸡蛋溶菌酶等均为 Sigma 公司 产品.Ibu 的两种主要代谢物 2-〔4(2-羧丙烷基)苯基〕丙酸菌素酸(Ibu-1)和 2- 〔4(2-甲基-2-羟丙烷基)苯基〕丙酸菌素酸(Ibu-2)由 Shyadehi 等〔8〕 提供. 凝胶柱 Sephacryl S-300HR 为 Phamacia 公司产品. 1.2 方法 1.2.1 α-晶体蛋白分离 和纯化〔9〕 8 只 1.5 岁新鲜牛透明晶状体去囊膜， 匀浆 分离皮质和核， (0.05mol L-1 磷酸钠缓冲液、0.2mol L-1KCl，1mmol L-1 EDTA，1mmol L-1 EGTApH6.7)， 混合物以 22440g离心 40min.采用凝胶柱 Sephacryl S-300HR 分离晶状体结构蛋白(凝 αL胶柱 100cm×2.3cm，速 25mL h-1 )根据色谱图分别收集 αH ， ， 流 ，βH ，βL 和 γ-晶体蛋白，透析 24h，低温冷冻干燥，-20?储存备用.SDS-PAGE 检测 α-晶体蛋白的纯度. 1.2.2 酶温育和活性测定〔7〕 酯酶(5IU，30.3μg)溶解于 50mmolL-1 磷酸钠缓冲液 ， (pH6.8) 首先与果糖(0.45，0.9， 10 和 20mmol 5，L-1 )温育，其中 20mmol L-1 为糖基化适宜浓度，并分别与 20mmolL -1 的核糖、G6P、葡萄糖、果糖 6-磷酸(5， 和 20mmol L-1 ) 10 氰酸钾(10，20，50 和 100mmol L-1 )，P-21-H(1，2，5 和 10mmolL-1 )混合并通过 0.2μm 微孔过滤器，分装于消毒小玻璃瓶，37?水孵箱振动温育 1,13d.酶活性测定以酯酶催化 p-硝基苯醋酸(PNPA)的水解率来表示.首先将 PNPA 溶解于乙腈中配成 60mmol L-1 的储备液，以防止水解.1mL 的 PNPA 与 50mmol L-1 磷酸钠缓冲液(pH6.8)19mL 混合，取 1mL 稀释液与 0.2mL 酶溶液混合于 1.4mL 的比色杯中，28?下，通过检测 100s 内 400nm 光吸收酶水解降率来测定酯酶的活性〔7〕 . 1.2.3 阿斯匹林类药物与酯酶的温育 10mmol L-1 的 Asp，Ibu和 Para 与酯酶混合，分别加或不加 20mmol L -1 果糖、1mmol L-1 P-21-H 和 50mmol L-1 氰酸钾水振动孵育7d酯酶与 10mmol L-1 Ibu，5 或 10mmol L-1 Ibu-1 和 Ibu-2 混合温育. 冲第 6 日，在微过滤前用 50mmol L -1 磷酸钠缓冲液(pH6.8) 洗 1,4 次，离心(6000g，5min)，并分别检测酶活性. 1.2.4 α-晶体蛋白与酯酶的温育 α-晶体蛋白(3.4，6.7 和 13.4mgL-1 )和对照蛋白分别与酯酶混合后，加或不加 20mmol L-1 果糖、10mmol L-1 果糖 6-磷酸、50mmol L-1 氰酸钾、1mmol L-1 P-21-H，10mmol L-1 Ibu 和 Para 水振动温育 7d，分别检测酶活性，并与正常对照比较，以百分比表示 α-晶体蛋白的分子伴侣活性. 统计学处理:结果均采用 Student t 检验. 2 结果 1 酯酶的稳定性 酯酶(30.3μg)溶解于 50mmol L-1 磷酸钠缓冲液(pH6.8)，室温下放置 1d，酶活性稳定37?水孵箱振动温育 6和 10d，酶活性分别下降(8.2?3.6)和(9.4?2.8). 2 糖化诱导的酯酶失活 温育 5d，果糖(0.45，0.9 和 5.0mmolL-1 )并未明显导致酶失活.20mmol L-1 果糖和核糖具有快速糖基化作用，温育 2d，残留酶活性分别为(70.7?4.7)(P0.0019)和(60.8?5.7)(P0.0099).G6P 和葡萄糖为缓慢抑制作用，温育 7d，酶活性分别为 和 (65.7?3.5) (P0.0043) (87.6?5.2) (P0.0564) (Fig1).果糖 6-磷温育 13d，葡萄糖组才有统计学意义(P0.0039)酸表现为时间浓度依赖性酶失活效应，温育 3d，10mmol L-1 果糖 6-磷酸已使酶失活差异具有显着性. 图 1 糖化诱导酯酶的失活 略 3 氨甲酰化和激素诱导酯酶失活 P-21-H(5 和 10mmol L-1 )迅速失活酶，甚至 1 和 2mmol L-1 在温育 2d 时，已显着失活酶，残留酶活性分别为 和 (75.6?7.2) (P0.0278) (74.2?3.9) (P0.0074) (Fig2).尽管使用较高浓度(20，50 和 100mmol L-1 )，氰酸钾对酶失活作用仍较弱.50mmol L-1 氰酸钾温育 2 和 4d，残留酶活性分别为(59.4?9.8)(P0.0470)和(39.5?4.6)(P0.0002). 4 Ibu 和 Para 抑制酯酶活性 温育前 10mmol L-1 的 Ibu 已表现抑 ，这制酶活性，与对照比较残留活性为(46.3?3.2)(P0.0012) 种抑制作用进展缓慢温育 5d，酶活性为(31.7?0.4)(P0.0001).温育 6d，过滤后仍保留 40.0的酶活性，冲洗 1 或 4 次之间无统计学差异.Para 表现为时间依赖性抑制效应，温育前和温育 1，2 和 3d，10mmol L-1 的 Para 使酶活性仅剩余(85.7?8.5)(P0.0991)，(52.4?3.1) (P0.0042) (16.7?5.9) (P0.0017) (10.8?2.2) ， 和 (P0.0002). 而 10mmol L-1 的 Asp 温育 5d，并未造成显着的酶活性丧失. 5 Asp，Ibu?1 和 Ibu?2 对酯酶的保护作用 Asp，羧化的 Ibu-1和羟化的 Ibu-2 可保护果糖和 P-21-H 诱导酯酶的失活(Tab1).温育3d 后，10mmol L-1 的 Asp 保护 P-21-H 诱导酯酶的失活有显着性差异(P0.0024)10mmol L-1 的 Ibu-1 和 Ibu-2 分别保护果糖和 P-21-H诱导酯酶的失活具有统计学意义. 图 2 氨甲酰化和皮质激素诱导酯酶失活 略 表 1 Asp 和 Ibu-1/Ibu-2 对果糖和 P-21-H 诱导酯酶失活的保护作用 略 图 3 α-晶体蛋白保护果糖 6-磷酸诱导酯酶的失活 略 6 α-晶体蛋白保护酯酶的失活 与对照蛋白比较，α-晶体蛋白与酯酶分子摩尔比为 1 1 时，可特异地完全保护果糖、果糖 6-磷酸和P-21-H 诱导酯酶的失活，而在 1 4 时，保护率分别为 67.0，55.0和 38.3.温育 4d 时，α-晶体蛋白(1 4)可保护果糖 6-磷酸诱导的酯酶失活(Fig3) P-21-H 组酶活性分别为 .在温育 3 和 5d 时， (70.4?2.9)和(44.5?4.9)加 α-晶体蛋白 4) 分为 (83.8?7.1)(P0.0301) (1 后，别 和(75.2?5.3)(P0.0038).α-晶体蛋白无保护氰酸钾诱导酯酶失活的作用.α-晶体蛋白(1 2)部分保护 Para 抑制酯酶的失活，但对 Ibu抑制作用无效，尽管温育 5 和 9d，牛血清白蛋白分别部分保护果糖和果糖 6-磷酸诱导酯酶失活，但均无统计学意义. 3 讨论 1974 年首次报道酯酶存在于晶状体，并已在人血清中分离出 4种类型酯酶，但由于其生理功能复杂，因而作用机制尚不确切.Kamei(1996)从正常人晶状体可溶性蛋白质中分离纯化出两种酯酶，它们有不同的最适 pH 值、温度和 Km 值.其中酯酶?的 Mr 为 200000，酯酶?的 Mr 为 30000.随着老化酶活性显着下降老年性白内障晶状体酯酶活性与正常同龄人比较也明显降低，提示晶状体中酯酶活性下降与白内障形成有密切关系〔6〕 .糖尿病患者外周血淋巴细胞和血浆酯酶活性的下降与感染机率的增加有关〔4〕 .糖化、氨甲酰化和激素作为白内障致病因素可诱导酯酶失活，可能是通过与赖氨酸基团N-端游离 α-氨基或 ε-氨基反应，以降低其电荷.若该反应位于或靠近酶活性位点，可直接失活酶或通过结构性改变间接失活酶〔1，10〕 .晶状体蛋白周围存在许多活性小分子，包括糖、来源于尿中的氰酸盐、糖皮质激素和具有活性的代谢产物等，这些均可在非酶环境下攻击蛋白质. 糖化是糖的碳基团与蛋白质氨基(通常是赖氨酸或 N-端氨基)反应，形成 Schiff 碱基，进而蛋白质交联，通过复杂的通路转变成不可逆转的高级糖化最终产物.本实验中糖化失活酯酶的程度与其他酶学研究类似〔10〕 ，即糖化强度依次为核糖果糖 G6P 葡萄糖.英国牛津和印度的流行病调查研究表明，严重的腹泻是白内障发病的高危因素〔2〕 .腹泻造成血中异氰酸盐的增高可能是主要原因.异氰酸是氨甲酰化的活性物质，生理性 pH 条件下，氰酸盐可逆地与蛋白质巯基或不可逆地与氨基(主要是赖氨酸的 ε 氨基)共价结合.随着人的老龄化，血中的异氰酸含量逐渐增加.P-21-H 的失活作用较糖和氰酸钾显着，可能由于泼尼松龙的侧链有活化的碳酰基和醌-A 环，可与蛋白质氨基 C-20 的活性碳基团反应形成 Schiff 碱基(类似糖化)，并重组为更稳定的加合物有关〔10〕 .本实验结果表明，阿斯匹林可能通过氨乙酰化作用部分保护果糖和类固醇诱导酯酶的失活.而 Ibu 抑制酶活性，但其羧基化(Ibu-1)和羟基化(Ibu-2)代谢物有保护作用，Ibu-2 的作用略强于 Ibu-1，但差异无显着性，可能是代谢产物增加了其亲水性的原因.Ibu 是 2-手性芳基丙酸的衍生物，主要的代谢物是 Ibu-1，有 2 个非对称中心和 1 个立体同质异构体而 Ibu-2 有 1 个非对称中心和 1 对镜像体.尿中含微量 1-和 2-羟基化 Ibu.po Ibu 后约80.0的两种代谢物以成对或非成 对形式存在于尿中〔11〕 .Ibu 可减少氰酸钾和半乳糖与晶体蛋白的结合量〔2〕 ， 尽管 Ibu 和 Para 与晶 但体蛋白结合量小， Ibu 的亲水性较强，因而其结合紧密. 酶学研究提示 Ibu 和 Para 无保护类固醇诱导苹果酸脱氢酶、氨甲酰化诱导 6-磷酸 葡糖酸脱氢酶和类固醇诱导过氧化氢酶失活的作用，并可抑制延胡羧酸酶和 3-磷酸 甘油醛脱氢酶〔10〕 .但动物实验和临床研究提示阿斯匹林类药物可防治白内障， 它们之间存在不同的保护机制，Ibu 和Para 可能是通过其药物前体发挥作用. α-晶体 蛋白作为晶状体主要的结构蛋白，其分子 伴侣活性表现为在其他蛋白处于易感状态 时，可保护它们免受损伤，主要是抑制各种蛋白质的凝聚和失活.目前认为 α-晶体 蛋白为非对称的环形四价聚合体，中央有较大的空洞，表面密度低.在空洞的内或外 表面，C-端序列和伸展性的变化是维持 α-晶体蛋白伴侣活性的重要因素〔10〕 .本 结果提示 1 分子的 α-晶体蛋白可部分保护 4 分子的酯酶.特异性保护作用可能是 通过酯酶或变性的酯酶进入空洞中央，粘附于 α-晶体蛋白的外表面而起作 用.Harding〔1〕 提出包括白内障的一类结构性疾病具有相同的病因，就可能存在 共同的治疗.17 项流行病学研究表 明 ， 若 全 部 老 年 人 应 用 阿 斯 匹 林 类 抗 炎 药 物 ， 约 50.0 的Alzheimer’s 病可预防.因而阿斯匹林类药物，具 有潜在的治疗白内障和 Alzheimer’s 病等结构性疾病的作用. 致 谢 英国牛津大学 眼科医院 Shyadehi AZ 和 Harding JJ 对本研究给予帮助. 参考文献: 〔 1 〕 Harding JJ.Cataract ， Alzheimer’s disease ， and otherconforma-tional disease 〔J〕.Curr Opin Ophthal，19989(1):10-13. 〔 2 〕 Harding JJ.Cataract:Biochemistry ， epidemiology andpharma-cology M〕.London:ChapmanHall，1991:219-249. 〔3〕Yan H，Zhang DG，Yang XG.The effects of aspirin-like drugson prevention of cataract 〔J〕.Zhongguo Shiyong 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