【精品文献】左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用

【精品文献】左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用 论文范文 题目:左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外 激活的抑制作用 编辑:司马小 作者:周俊～刘景汉～邢颜超～王冬梅～欧阳锡林 【摘要】 本实验旨在研究左旋精氨酸,,和西洛他唑,cilostazol,在体外对血小板激活的抑制和功能保护作用～为可逆性血小板抑制剂在血小板保存中的应用提供依据。采用对血小板CD62p和表达及凝血酶激活后再表达率的流式细胞分析,FCMs,、血小板聚集试验以及血小板凝血活性等手段～观察血小板激活、血小板功能状态。结果表明～体外处理后血小板CD62p和表达率显著增加～西洛他唑和左旋精氨酸对这一过程CD62p和表达有较强抑制作用～且随浓度增加而递增。西洛他唑可抑制凝血酶激活后CD62p和的表达～左旋经氨酸仅抑制凝血酶激活后的表达。左旋精氨酸和西洛他唑对3种诱导剂诱导的血小板聚集呈现不同程度的抑制作用～抑制作用随浓度递增。左旋精氨酸?15 mmol/L时～血小板聚集时间延长甚至不凝集。西洛他唑在浓度1-4 mmol/L范围均 延长血小板聚集时间。结论: 5 mmol/L和10 mmol/L的左旋精氨酸均 可抑制血小板体外处理过程的激活～且血小板的聚集和再表达功能不 受影响～5 mmol/L作用更佳。1 mmol/L浓度西洛他唑抑制血小板体外 激活～可保留血小板部分聚集活性和再表达能力。 【关键词】 左旋精氨酸 Activation of Platelets In Vitro Abstract The purpose of study was to investigate the effects aggregation reserve in vitro, so as to provide proof for atelets lyophilization. Activation and function of platelets were investigated by using flow cytometry with the CD62p and thrombin, and by means of platelet aggregation reaction to thrombin, ADP and propyl gallate, as well as coagulation activity of platelets. The results showed that expression of expression and related with their concentrations. Cilostazol had an intensive inhibition effect on expressions of CD62p and cilostazol inhibited aggregation induced by thrombin, ADP and propyl gallate, and the inhibitions were related directly equal to 15 mmol/L, or cilostazol concentration was in range of 1-4 mmol/L, the aggregation time were prolonged so much or concentration is 5 mmol/L and 10 mmol/L, platelet activation can be inhibited, but aggregation ability and characters keep intact. Concentration at 5 mmol/L may be the best. 1 mmol/L of cilostazol can inhibit activation in vitro and retain part of platelet ability of aggregation and reexpression. Platelets preservation J Exp Hematol 2007; 15(5):1079-1083 左旋精氨酸,,为一氧化氮释放剂～抑制磷酸二酯酶活性～减少cAMP降解～可使细胞内外cAMP浓度升高。西洛他唑,cilostazol,是喹啉类衍生物～西洛他唑和它的代谢产物是 ,环磷酸腺苷,磷酸二酯酶III,抑制剂～可抑制PDE活性和阻碍cAMP降解,和转化,。这两种药物均可增加cAMP在血小板和血管内浓度～抑制血小板聚集和使血管扩张～防止血栓形成和血管阻塞。本研究针对这两种药物在体外对血小板的作用进行实验～结果如下。 材料和方法 血小板 采自无偿献血者～献血前1天内未饮含酒精类饮料～2周内未服用阿司匹林等抗血小板及抗凝血的药物。全血用ACD三联袋采集～用富含血小板血浆,PRP,分离法一次离心制备PRP。 左旋精氨酸,公司产品,～西洛他唑,cilostazol～大冢制药公司产品,～海藻糖,trehalose～南宁中诺生物工程有限公司产品,～二甲亚砜,DMSO～天津医药公司产品,。荧光素标记的特异性血小板膜表面抗体及相关多肽: ,FITC、CD62p,PE、CD61,PerCP、MIgGI,PE均为Becton Dickinson公司产品～RGDS肽和GPRP购自Sigma公司。 血小板聚集诱导剂 凝血酶,thrombin,～二磷酸腺苷,ADP,～丙基没食子酸酯,propyl gallate, ,Analytical Control Systems, In Co产品,。 主要仪器 型全自动血细胞分析仪,Nihon Kohden公司产品,～ 聚集仪,德国Lanbo公司产品,～FACSCalibur流式细胞仪,Becton Dickinson公司产品,和CellQuest分析软件～ Biofuge15R,Heraeus公司产品,。 实验分组及处理 实验分实验组～对照组和FPRP,富含新鲜血小板血浆,组。对照组和实验组依次加入冷冻干燥保护剂～1-4实验组加入左旋精氨酸～终浓度依次为5～10～15～20 mmol/L。5-8实验组加入西洛他唑～终浓度依次为1～2～3～4 mmol/L。均在体外进行保存前的预处理～包括37?水浴4小时～离心～洗涤～重悬等。 血小板聚集试验 选择thrombin～ADP和propyl gallate作为血小板激活诱导剂体外检测血小板的聚集功能。各诱导剂的作用浓度: thrombin 1 U/ml～ADP 225 μmol/L～propyl gallate 50 μl。以血小板浓度(250-300)×106/ml的FPRP为0～以PPP为100～正常对照为FPRP管。血小板浓度:(250-300)×106/ml～反应体积:250 μl。取预处理后血小 板～用原血浆重悬～孵育至37?后加入诱导剂～立即血小板最大聚集率,PAgT,及聚集曲线～根据公式计算药物对血小板的聚集抑制率。 聚集抑制率, ,,对照血小板聚集集-实验血小板聚集率,/对照血小板聚集率,×100% 膜表面标志CD62p～的表达率 加入荧光素标记的抗血小板单克隆抗体各10 μl～室温避光反应20分钟～立即加入1.0 ml 1%多聚甲醛,2-6?,混匀～4?保存～24小时内在流式细胞仪上分析。以CSC、FSC和CD61识别获取血小板～以速度300个/秒获取10 000个血小板,gate=R2,进行FL1和FL2分析。 膜表面标志CD62p ～再表达率 测定血小板在凝血酶激活后CD62p和的表达。分析方法同上。根据结果计算血小板再表达率,凝血酶处理后表达率,血小板表达率,1,。 血小板促凝血活性 采用玻片法,SPAT,检测血小板的促凝血活性,2,。在一树脂玻璃片上加100 μl SPAT试剂～再加100 μl PRP混合后计时检测～以秒 ,s,为单位～FPRP为正常对照。 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件～对配对进行t检验分析。 结 果 血小板最大聚集率,PAgT, 西洛他唑对血小板聚集抑制作用较强～实验中3种诱导剂对血小板聚集均有较强的抑制作用。血浆中西洛他唑2 mmol/L时～显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集～聚集抑制率达64,～且随浓度的增加抑制作用增强,1 mmol/L时～显著抑制ADP和丙基没食子酸酯诱导的血小板聚集～抑制率分别为100,和94.28,～,1 mmol/L时血小板对这两种诱导剂几乎无聚集反应。 左旋精氨酸对血小板的聚集抑制较西洛他唑温和～且随浓度升高对3种诱导剂均呈现不同程度的抑制作用。血浆中左旋精氨酸10 mmol/L显著抑制凝血酶和ADP诱导的血小板聚集～聚集抑制率分别为19.51,和39.84,～且随浓度递增抑制作用渐强,左旋精氨酸,20 mmol/L时对丙基没食子酸酯诱导聚集无显著抑制作用～但20 mmol/L时～聚集抑制率达100,,表1,。 血小板膜表面CD62p和的表达 西洛他唑和左旋精氨酸可显著抑制血小板激活～表现为血小板表面CD62p和表达受抑制。西洛他唑的作用随浓度增加～抑制表达作用增强,左旋精氨酸对血小板CD62p表达抑制作用与浓度不呈正相 关～但在5-20 mmol/L浓度范围～均抑制表达,表2,。西洛他唑在1-4 mmol/L范围内～对CD62p和显著抑制～左旋精氨酸在1-10 mmol/L浓度范围内～对CD62p和显著抑制,图1、2,。 血小板膜表面CD62p和的再表达 西洛他唑抑制血小板经凝血酶激活后CD62p和表达～抑制作用随浓度增加而增加～在0-20 mmol/L浓度范围内～左旋经氨酸对凝血酶激活的血小板膜CD62p表达无抑制作用～?15 mmol/L～对表达有显著抑制作用(表3)。 再表达率变化曲线见图3、4。西洛他唑强烈抑制血小板CD62p和 再表达～浓度为1 mmol/L时～再表达率仅分别为16.38,和1.96,。左旋精氨酸浓度大于10 mmol/L时～再表达率下降。 血小板促凝血活性 FPRP于37?水浴4小时～血小板聚集时间显著延长,p<0.05,。45 mmol/L海藻糖加入后～血小板聚集时间恢复正常,p<0.05,。西洛他唑抑制血小板聚集反应～表现为聚集时间显著延长～浓度为0-4 mmol/L～血小板聚集时间依次为56.8、119.8、111.4、174.4和223.8秒,表4,。左旋精氨酸在15 mmol/L时～血小板聚集时间延长至111.0秒～20 mmol/L时～血小板300秒内不凝集,表4,。 讨 论 在血小板保存中～应最大限度地保存血小板功能。但血小板激活使血小板功能降低～甚至丧失。因此需要添加血小板激活抑制剂～我们在抗血小板药物中筛选这类抑制剂。环核苷酸系统,环磷酸腺苷cyclic adenosine monophosphate～cAMP,是调节血小板功能的重要环节之一～左旋精氨酸和西洛他唑均作用于血小板环核苷酸系统～抑制 ,环磷酸腺苷,磷酸二酯酶,活性～减少cAMP降解～使cAMP浓度升高。有研究表明～西洛他唑可在体外显著抑制纤维蛋白原受体,,和CD62p的表达～西洛他唑是一种较强的抗血小板活化药物,既可抑制FIBR的表达而降低血小板的聚集性,又可抑制血小板的释放反应而降低其促凝血活性,3,。左旋精 氨酸是一氧化氮释放剂～抑制PDE活性。近年来一些学者发现～NO可抑制血小板的活化和聚集～被 称为内源性血小板聚集和黏附抑制物,4,～其作用机制与扩血管作用相似～也是通过刺激腺苷酸环化酶造成血小板内cGMP增加～导致细胞内Ca2+浓度降低的串连反应。有实验证实～在离体的血小板上清液中～加入类NO物质硝酸盐时可见到血小板活性的抑制现象,5,。 血小板被激活时～颗粒膜和质膜融合为颗粒膜蛋白～如CD62～CD63在质膜上表达～成为活化血小板的分子标志。血小板质膜表面变化的糖蛋白表位～如GPIIb/IIIa,CD41/CD61,的的表位～仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。使用这些表位的荧光单克隆抗体能精确地检测到血小板的活化,6,因此选择CD62p和PAC1作为血小板活化检测指标。研究中测定不同条件下血小板CD62p和PAC1的表达～它们可定量地反映血小板活化及血小板对刺激物的反应性。采用足够浓度的凝血酶充分激活血小板后～CD62p再表达的能力更能反映保存血小板功能状态,7,。 在实验中～西洛他唑在1 mmol/L时～血小板对凝血酶诱导的聚集反应仍明显存在～但对较弱的诱聚剂无反应。在实验的浓度范围内～西洛他唑能抑制血小板的激活～但血小板的功能也受到抑制。左旋精氨酸在5-10 mmol/L范围内～血小板的聚集反应保存较好～聚集抑制率小于40,。在该浓度下～实验组血小板未见明显激活～且有较高的糖蛋白再表达能力。此结果提示～添加小于10 mmol/L的左旋精氨酸在体外可以抑制血小板激活并且使血小板仍具有较好的聚集功能和反应状态。 有研究报道加入血小板激活抑制剂～添加的血小板激活抑制剂包括有阿米洛利,amiloride,、腺苷,adenosine,和硝普钠,sodium nitroprusside,SNP,,8-10,～可以将低温保存血小板中DMSO的用量降低至2,～保存的血小板在体内体外均有较好的功能特性。在Wolkers等,11～12,冻干人及动物血小板研究中～以PGE1作为保护剂负载和冻干过程的血小板功能保护剂～冻干血小板仍保持对浓度的凝血酶、胶原、ADP和瑞斯托菌素等诱导剂的聚集反应。 因此～结合本实验结果～针对血小板体外激活不同途径～选择可静脉 注射的可逆性血小板抑制剂用于血小板低温和冷冻干燥保存研究是切 实可行的。 【参考文献】 1欧阳锡林, 刘景汉, 高大勇. 流式细胞术测定保存血小板再表达 CD62p方法的建立及应用. 中国输血杂志～ 2002, 15:77-81 2欧阳锡林, 刘景汉,孙桂香等. 不同血小板激活剂在薄片法聚集实验 中的应用比较. 中国实验血液学杂志～2004, 12:680-683 3王建中,曹凌,袁家颖等. 三种抗血小板药物在体外对血小板活化的抑 制作用研究. 中华检验医学杂志～2002, 25:8-11 4Loskove JA, Frishman WH. 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