小麦种子发芽率的测定及干旱胁迫

小麦种子发芽率的测定及干旱胁迫 2016-2017学年上学期 题 目 小麦种子发芽率的测定及干旱胁迫 对小麦部分生理生化指标的影响 姓 名 王晓云 学 号 1443204000306 院、 系 生命科学院学院 专 业 应用生物科学 2016年12月29日 小麦种子发芽率的测定及干旱胁迫对小麦部分生理生化指标的影响 王晓云，云南师范大学生命科学学院，14应用生物科学班，1443204000306 摘要:本论文主要研究了干旱胁迫对小麦以下生理生化指标:脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、抗氧化酶(PPO、POD)、谷 胱甘肽(GSH)的含量的影响。本实验选用小麦种子及其幼苗作为实验，用快速测定测定小麦种子的发芽率，同时在实验过程中设立对照组和实验组测定小麦幼苗干旱胁迫生理生化指标并对其抗旱性进行评估。 所有干旱胁迫下植物细胞内生理生化指标的含量都采用分光光度计测定;根据对照组和实验组所得的数据后明干旱对小麦的生理生化指标的含量都有一定的影响，经干旱胁迫后小麦中Pro、MDA、H2O2、PPO、POD、GSH的含量相比正常生长条件下的小麦含量都呈现上升的趋势。 总体而言，受干旱胁迫的小麦的抗旱性强于普通生长的小麦。 关键词:小麦、干旱胁迫、Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、POD 引言:植物生活的环境不是恒定不变的，我国幅员辽阔，地形复杂，气候多变，植物的抗逆性机理与农林业生产关系密切。对植物产生伤害的环境称为逆境，又叫胁迫。胁迫包括生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫(biotic stress)有病害，虫害和杂草;非生物胁迫(abiotic stress)包括寒冷，高温，干旱，盐渍，水涝等。[1] 小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近几年随着气候的变化，小麦产量安全问题日益突出。植物最常遭受的有害影响就是缺水，即干旱胁迫。干旱胁迫后，SOD、POD和CAT等组成的保护酶系在清除活性氧、保持细胞膜稳定性方面起着重要的作用。植物体内游离脯氨酸和可溶性蛋白可作为胞质渗压剂也对低温胁迫下的植物细胞起保护作用。[3]本试验进一步证实了前人研究的结果，同时发现干旱胁迫对细胞膜透性的影响较少。可见干旱对小麦的生理、生化都产生重要的影响，进而影响小麦的生长发育、产量和品质。因此，为了减小环境对小麦生产的影响，有必要从小麦的各项生理生化指标含量的变化，来研究干旱胁 迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。 1.材料与方法 1.1实验材料 小麦种子及小麦幼苗 1.2实验材料的选取和培养 小麦种子预先在25?的培养箱里于蒸馏水中吸胀12h。随机取60粒吸胀的小麦种子，用刀片沿胚的中线切成两半(严格区分两个半粒)，一半放入一只烧杯中，另一半放入领一只烧杯中进行下列实验: 其中30个半粒进行TTC染色(30?水浴 20 min) 另30个半粒进行曙红染色(室温染色10 min) 洗净后观察TTC染色组直接观察胚的着色情况，而红墨水染色组需用自来水漂洗种子至洗液无色为止，然后再观察胚的着色情况 取经上述发芽率快速测定的同一批次的小麦种子，以0.1% HgCl2消毒10 min后，漂洗干净，于26?下吸胀12 h，播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘中，每盘 下黑暗中萌发2.5~3天。选取长势一致的小麦幼苗待用。[3] 200~ 300粒，于26? 1.3干旱胁迫处理 把上述小麦幼苗分成实验组和对照组， 将实验组用PEG溶液浇灌处理; 对照组小麦苗仍然用蒸馏水浇灌继续培养。 处理结束后， 把小麦幼苗转移到26?下恢复培养7天， 每天光照12h， 观察对比实验组和对照组小麦苗生长差异变化情况。 1.4测定抗逆指标含量 (按照李忠光老师上课时在ppt上展示的操作方法进行实验。) 1.4.1测定抗逆指标脯氨酸(Pro)的含量 Pro的提取:分别取0.1 g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3 mL 3%磺基水杨酸(SSA)和少许石英砂，充分研磨后用2 mL 3% SSA冲洗研钵，用离心机5000 rpm离心10 min，取其上清液并记录体积。 测定:取上清液各2 mL，分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂，水浴煮沸15 min， 冷却后再5000 rpm离心10 min(若没沉淀可略此步骤)， 分别测定A520。(运用紫外分光光度法测定。) AV总520-1，V显(,mol.gFW) Pro content = ,，L，WV用 1.4.2测定抗逆指标可溶性糖和丙二醛(MDA)的含量 提取:分别取0.1 g实验组和对照组小麦幼苗，加入3 mL 10%TCA和少许石英砂充分研磨后用2 mL 10%TCA洗研钵，5000 rpm离心10 min， 取其上清液并记录体积。 测定: 分别取上清液各2mL，加入0.5%TBA(用10%TCA配制)3mL， 水浴煮沸15 min，冷却后用离心机5000 rpm离心5 min (视沉淀有无)，分别测 (运用紫外分光光度法测定。) 定OD450和OD532。 ， OD450=C185.4 ，， OD532=C17.4+15500C2 求解方程得: C1/(mmol/L)=11.71OD450 C2/(umol/L)=6.45OD532 - 0.56OD450 中C1为可溶性糖的浓度; C2为MDA浓度。 1.4.3测定抗逆指标H2O2的含量 H2O2提取:分别取0.1 g实验组和对照组小麦幼苗，加入3mL 0.3%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂，充分研磨后用2mLTCA 洗研钵，用离心机5000 rpm离心10 mi，取其上清液并记录体积。 测定:分别取上清液各4mL， 加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] 0.2mL， 摇匀， 用离心机 5000 rpm离心10 min ， 测定OD410。(H2O2) 410AV总-1，V显，(,mol.gFW) HO content = 22,，L，WV用 1.4.4测定抗逆指标抗氧化酶(POD)的含量 抗氧化酶的提取: 分别取对照组和实验组小麦幼苗0.1 g作为实验材料，加入少许石英砂和3 ml提取液(50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.1mmol/ LEDTA, 1%PVP)， 充分研磨后完全转入离心管中，再用2 ml提取液洗研钵，5000 rpm离心10 min ， 记录上清液体积，用于测定POD和PPO酶活性。 POD测定:取POD反应混合液(10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解)2.95 ml，加入酶液50 ml(空白调零用PBS取代)，立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A470。 PPO测定:取PPO反应混合液(20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解)2.9 ml，加入酶液0.1 ml(空白调零用提取液取代)，立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A410。 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位(U)， 则: 470AV总 ，V显，-1-1POD activities = (,mol.gFWmin,，W，tV用 )) 410总AV -1，PPO activities = (U.gFW 0.01，W，tV用 )) ) ) 1.3.5测定抗逆指标GSH的含量 GSH的提取:分别取0.1 g实验组和对照组的小麦幼苗，加入3mL 5%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂，充分研磨后用2mL 5% TCA洗研钵，5000 rpm离心10 min ，上清液并记录体积。 测定:上清液各1mL (空白用3%三氯乙酸代替)，分别加入0.4mlM NAOH、1mL 2mM DTNB，然后于25 ?下5 min，测定A412。 AV总412-1，V显，(,mol.gFW) GSH content = ,，L，WV用 [2] 2.实验结果及分析 对小麦种子发芽率及经干旱胁迫后小麦中Pro、MDA、H2O2、PPO、POD、GSH的含量的测定，与正常生长的小麦做比较，得出干旱胁迫对小麦部分生理生化指标的影响。 计算分析中需要用到的各项指标单位: -1Pro含量单位:umol.gFW; 可溶性糖含量单位:mmol/L; 丙二醛含量单位: umol/L。 -1H2O2含量单位: umol.gFW; -1-1POD活性单位: mol.gFWmin; -1PPO 活性单位: U.gFW; -1GSH含量单位: umol.gFW; 2.1.小麦种子发芽率测定 2.1.1.小麦种子发芽率的测定结果和计算 随机抽取六十粒种子，对半切开，每组染色60半粒。 TTC染色:具有生命活力的有60半粒(胚红色，胚乳颜色较浅甚至发白); 曙红染色:具有生命活力51半粒(胚乳没被染红)，不具生命力的9半粒(胚乳和胚一起被染红)。 表一 TTC染色和曙红染色测定小麦发芽率结果 活性小麦(半粒) *发芽率 TTC染色 60 100 曙红染色 51 85 注: *占计数种子的百分比。 2.1.2.小麦种子发芽率结果分析 从表一实验数据可以看出，用TTC染色测定的小麦发芽率要比用曙红染色的 发芽率高。但是在实验中我们是将同一颗种子分成两半，应该不存在发芽率的差 异。可能是在实验过程中，由于曙红染色的个体较难分辨而产生结果的误差。两 组种子的发芽率都超过了85,，说明这一批种子的生命活力较高。 在实验中，TTC染色中胚被染红和胚乳颜色有一定的差异，而这个差异比较 明显。TTC(2,3,5—氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感复合物,1894年首次合 成用来检测种子的生存能力,1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗 塞。它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体,与正常组织中的脱氢酶反 应而呈红色,而缺血组织内脱氢酶活性下降,不能反应,故不会产生变化呈苍白。 曙红染色液进行染色时小麦种子胚乳被染红是死种子的标志。因为胚乳上也 有胚乳细胞，每一种活细胞膜都具有一定的选择透过性不易把外界的放进来，但 是如果小麦种子失去了活力胚乳细胞死亡，则其细胞膜失去选择透过性胚乳就会 被染红。 2.2干旱胁迫对小麦幼苗脯氨酸(pro)含量的影响 2.2.1.干旱胁迫对小麦幼苗Pro含量测定结果 现象:提取液经过离心以后会变红，无沉淀产生。 实验结果和数据处理: 表二 小麦幼苗脯氨酸(pro)含量 OD520 pro含量 实验组 2.892 0.089 对照组 0.049 0.002 2.2.2干旱胁迫小麦幼苗Pro含量变化的影响的分析 实验中经离心后变红，无沉淀产生，可能是因为在本次试验脯氨酸被3 mL [3]3%磺基水杨酸(SSA)酸化而变红。 从表二可以看出，小麦在干旱胁迫下时的脯氨酸的含量很高，为正常植株中的脯氨酸含量的44.5倍，这说明正常情况下小麦胚芽鞘内脯氨酸含量较低，但当遇到干旱胁迫时小麦胚芽鞘内的含量可以增加数十倍甚至几百倍。这一结果与山东农业科学洪法水李樊和在研究自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱 [4]性的关系所得到的结果一致。 2.3.干旱胁迫下小麦幼苗可溶性糖，MDA的含量测定 2.3.1.干旱胁迫下小麦幼苗可溶性糖，MDA变化情况的结果数据 现象:无悬浮物，无沉淀产生，无明显颜色变化。 实验结果及数据处理 表三 小麦幼苗MDA含量及可溶性糖含量 小麦 MDA含量 可溶性糖含量 实验组 0.116 24.693 对照组 0.070 2.728 2.3.2.干旱胁迫对小麦幼苗可溶性糖，MDA的影响分析 实验说明无沉淀产物产生，对测量其含量无影响。 从表三可以看出，通过对照组对比，实验组可溶性糖和MDA的含量明显增加。在干旱的胁迫下会使植物叶片MDA和可溶性糖大量积累。 PEG模拟干旱胁迫使可溶性糖含量大幅提高。可溶性糖是生物体内重要成 [5]分之一,是生物体中的重要能源和碳源。可溶性糖作为渗透调节物质可以降低细 [6]胞的渗透势以维持细胞的膨压,防止细胞内大量的被动脱水。 MDA在逆境胁迫条件下，植物往往发生膜脂过氧化作用.质膜相对透性的大小是膜伤害的重要标志之一。MDA 是脂质过氧化的产物之一，其积累是活性氧毒害 [7]作用的表现。MDA 含量通常被作为判断膜脂质过氧化作用的指标。细胞膜透性和MDA含量的的变化是植物细胞膜脂透过反应的表现，MDA能与细胞内各种成分发生反应，从而引起细胞内各种膜的损伤，当MDA含量大量增加时，表 [8]明体内细胞受到严重的破坏，膜透性增加，细胞内物质外渗，细胞功能下降。小麦幼苗在PEG溶液干旱处理后其MDA大量积累以增加其抗旱能力。 2.4.干旱胁迫下小麦幼苗H2O2的含量的测定 2.4.1.干旱胁迫下小麦幼苗H2O2含量测定的结果和现象 现象:无明显变化 结果和数据处理: 表四 小麦幼苗过氧化氢的含量 OD410 H2O2含量 实验组 1.155 0.006 对照组 0.475 0.002 2.4.2.干旱胁迫下小麦幼苗H2O2的含量的影响分析 环境胁迫可降低植物叶片对光能的利用能力, 使其吸收的光能中过剩的程度加大而引发光抑 制, 也可诱发植物体内活性氧积累而造成氧化胁迫[6]。由表4可知，小麦在干旱胁迫下，H2O2的含量剧增。经H2O2胁迫锻炼的小麦遭受干旱胁迫时,能使体内O2-及H2O2的含量维持在较低的水平,因而保护了膜、叶绿素、蛋白质等免受氧化伤害。 从表四可以看出，干旱胁迫下小麦的H2O2含量有较大增加，实验组为对照组的三倍，由此，初步判断H2O2胁迫锻炼,提高了小麦幼苗的抗氧化能力,增强了其抗旱性。 2.5.干旱胁迫下小麦幼苗抗氧化酶的测定 2.5.1.干旱胁迫下小麦幼苗抗氧化酶的测定的现象及结果 现象:有茶褐色物质生成 结果及数据处理: 表五 小麦幼苗对抗氧化酶POD含量 OD470 POD含量 实验组 1.122 8.072 对照组 0.030 1.985 2.5.2.干旱胁迫下小麦幼苗抗氧化酶的含量变化分析 过氧化物使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质。 由表五可以看出，实验组的POD含量比对照组增加了接近四倍。植物机体内存在抗氧化防御系统，而过氧化酶(POD)则是该系统的主要物质之一。逆境胁迫下，活性氧自由基增加，使植物细胞遭受氧活化胁迫。而POD对于消除细胞的活性氧对细胞膜的伤害，减少膜脂质过氧化，稳定膜的稳定性起到重要作用。此外，在轻度和中度胁迫下。POD活性保持增加，在严重胁迫下POD活性则会开始下降，活性氧的清除系统受到抑制。本实验结果表明，干旱胁迫下的POD活性比正常水平的POD活性强，从而也证明了试验中小麦幼苗处于轻度或者是中度干旱胁迫之下。 2.6.干旱胁迫下小麦幼苗GSH含量的测定 2.6.1.干旱胁迫下小麦幼苗GSH含量测定的现象和结果 现象:无明显现象 结果和数据处理: 表六 小麦幼苗GSH含量 OD412 GSH含量 实验组 0.962 6.083 对照组 0.132 0.835 2.6.2.干旱胁迫下小麦幼苗GSH含量变化的分析 由表二的实验可以看出，干旱胁迫下的GSH大量增加，实验组是对照组的90倍。在干旱胁迫下也一定程度上造成了GSH的积累。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质。GSH含量的增加，在一定程度上，反应了玉米苗在干旱逆境中，也能合成一些产物，增加其抗旱性，以便植物能在干旱逆境中生长。 3.讨论和思考 本次实验通过测量了小麦种子的活性、测定了小麦干旱苗和正常苗的脯氨酸 含量、过氧化氢的含量、PPO和POD的含量、GSH的含量及细胞内的可溶性糖和MDA的含量。通过干旱胁迫下的苗和正常苗的各种物质含量的对比和分析，说明小麦幼苗在干旱的条件下，细胞内的POD和PPO的活性增强和H2O2的含量明显增加，致使小麦幼苗细胞内的ROS动态平衡破坏，使其不能消除ROS对自身的伤害;H2O2的含量增加，细胞的组织会受到破坏，所以小麦幼苗会表现出萎焉，枯卷，干黄等现象。但是在小麦细胞受到伤害的同时，细胞内的脯氨酸、GSH、可溶性糖和MDA的含量也会增加，它们的含量增加能增强细胞的保水能力，维持植物的生命，增强植物的抗旱性，便于植物在干旱条件下生长。 在自然界中，不仅仅是小麦在干旱条件下会发生这一系列的变化，其他的植物也会在干旱条件下发生POD、PPO、GSH和MDA等物质的含量增加，增强保水性和抗旱性。除此之外，植物在其他的逆境中细胞内的相应物质也会发生变化，以便于其在逆境中维持生命，增加抗性。 本实验表明在干旱胁迫下，pro大量积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干早环境的一种保护性适应。植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如O2-、H2O2、OH-等直接或间接地清除，防止了活性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛(MDA)是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗干旱胁迫的过程中起着重要的作用。 参考文献 [1] 王忠主编.植物生理学[M].北京:中国农业出版社.2008.9(526) [2] 李忠光，龚明等.植物生理学综合性和设计性实验教程[M].武汉:华中科技大学出版社，2013.12. 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