米非司酮对人早孕绒毛组织核转录因子-κB和E-钙粘素表达的影响（可编辑）

米非司酮对人早孕绒毛组织核转录因子-κB和E-钙粘素表达的影响（可编辑） 米非司酮对人早孕绒毛组织核转录因子-κB和E-钙粘 素表达的影响 4 10422 分类号:R71 单位代码: 2?713042 密 级: 学 号: 国厶紊只孥 硕士学位 Master’SThesis Shandong University 论文目:米非司酮对人早孕绒毛组织核转录因子一 KB和E一钙粘素表达的影响 Effectsof on ofnuclear Mifepristoneexpressions factor-?BandE--cadherininhumanvillus the duringearly pregnancy 作 专 导 201 5日 0年4月1 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本声明的法律责任由本人承担。 El 期: 论文作者签名: 边。复:l1 室趣缝 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 期: 论文作者签名:兰迸导师签名麴!!日 坐:茎J7 符号说 明„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 前日lJ 言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((6舌„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„” 材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((15 讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。16 结 仑„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((19 附 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米非司酮作为强有力的孕激素受体拮抗剂，已被临床广泛地应用于终止妊娠。对 其作用机理的研究，日渐深入，从组织学观察进至组织化学、分子生物学等角度，并 且还涉及到与着床、早期胚胎发育有关的各种因子，有的研究已 深入至基因水平。 胚胎的植入和胎盘的形成是正常妊娠的关键。而细胞滋养层细胞分化为绒毛外滋 养层细胞，进而对母体子宫黏附与侵入是植入与胎盘形成的前奏。已有研究表明细胞 滋养层细胞在增殖、浸润和转移方面与肿瘤细胞存在相似之处，核转录因子 factorKB，NF(心 、E一钙粘素与肿瘤细胞生长分化、侵袭转移密不可分， 一rd3 nuclear 同时它们也与胚胎发育及器官形成息息相关，并在植入、胎盘分化和形成过程中起重 要作用。 目的 1(检测人工流产组和药物流产组早孕绒毛组织中NF―r,B的表达。2(检测人工流产 组和药物流产组早孕绒毛组织中E一钙粘素的表达。3(探讨米非司酮对人早孕绒毛组织 中NF(r,B和E一钙粘素二者表达的影响。 选择2008年9至10月期间在山东大学省立医院妇产科门诊就诊，经尿妊娠试验 和B超检查诊断为早孕5"-'7周，拟行人工终止妊娠者40例，随机分为药物流产组 22 别测定两组早孕绒毛组织中NF(r(B、E一钙粘素mRNA和蛋白的分布与含量。 结果 1(两组NF(r(B蛋白和mRNA表达强度的比较 NF(r,B蛋白在正常早孕绒毛组织中呈阳性表达，主要定位于绒毛滋养层 细胞滋 山东大学硕士学位论文 养层和合体滋养层细胞 、绒毛间质细胞的胞核和胞浆。药物流产组细胞滋养层NF(1cB 蛋白表达强度明显低于人工流产组，组间差异有统计学意义 尸 0(05 。药物流产组 NF(r,(BmRNA明显低于人工流产组，组间差别有统计学意义 户4(604，P 0(01 。 2(两组E一钙粘素蛋白和mRNA表达强度的比较 E一钙粘素蛋白在正常早孕绒毛组织中呈阳性表达，主要定位于绒毛细胞滋养层细 胞，合体滋养层细胞和绒毛间质中不表达。药物流产 组细胞滋养层E一钙粘素蛋白表 达强度明显高于人工流产组，组间差别有统计学意义畔0(05 。药物流产组E一钙粘素 mRNA明显高于人工流产组，组间差别有统计学意义 t 9(819，P 0(01 。 结论 人工流产组和药物流产组早孕绒毛组织中均存在NF(1cB和E一钙粘素的表达，组 间差异有统计学意义，且在药物流产组中两者之间表达具有显著相关性，推测NF(r,B 和E一钙粘素在早孕绒毛组织细胞滋养层中的变化，可能是米非司酮终止早孕的机理 之一。 关键词 核转录因子一心;E一钙粘素;绒毛;细胞滋养 层;米非司酮 2 。, 山东大学硕士学位论文 Effectsof on ofnuclearfactor-gB and Mifepristoneexpressions E??-cadherininhumanvillus the duringearlypregnancy Master:ZhengXiaojing TutorProf("Li Mingjiang ABSTRACT Background: Asa hasbeen powerful progesteronereceptorantagonist， mifepristonewidely applied in theterminationof mechanismofresearchis pregnancy(The graduallydeepening，from the tomolecular alsoinvolved organization histopathologicstudychemistry biology,and with ofvarious somerelated to implantation， earlyembryonicdevelopmentfactors，even research( genetic and is tonormal isa that Implantationplacentationkey pregnancy(Itprelude extravillous differentiatedfromvillous adheretoand cytotrophoblasts cytotrophoblasts invide uterusto and hasbeen thattherearethe implantationplacentation(It reported similaritiesbetweenthe and invasive of striking proliferative， migratorypropertiesplacental cellsandthoseof cancercells(NF??rBandE― cadherinare relatedtocancer closely cells， and also to and embryogenesisorganogenesis，and importantplacentationimplantation( objeetive: To intotheeffectsof on ofnuclear probe mifepirstoneexpression andE??cadherininhumanvillus the duringearlypregnancy( Methods: Our wasconductedatthe ofObstetricand of study Department Gynecologic Provincial Affiliatedto from to Shandong Hospital ShandongUniversitySeptember October Was of5―7weeksurine test 2008(Fortypatientsdiagnosedpregnancy by pregnancy andultrasoundandMan-madeterminationof in wererecruitedthe pregnancy 3 、 山东大学硕士学位论文 menstruation study(Patients、^，ithpreviouslyregular cycle， nonpuerperalpregnancy，were intotwo medicalabortion women separated groups(The group n 22 includedpregnant whodesiredmedicalterminationandfittedtheindication(Theabor tion surgical group n 1 who artificial abortion(The ofNF(1cBand 8 includedpatients undergone expressions E-cadherinonhumanvillus weredetectedin18 abortionsand 22medical surgical abortionsRT-PCRand by Immunohistochemistryanalysistechnique( Results: andnuclei ofvillous andvillous stromafor 1(Cytoplasmic staining trophoblast NF-r,BWasdetectedinbothmedicalabortion andthe ofNF一1cB group expression protein in of themedicalabortion Was weaker cytotrophoblasts when group significantly tothatofthe abortion ofNF-rd3mRNA compared surgical group P 0(05 ， theexpression invillousofthemedicalabortionWas weakerwhen tothat groupsignificantly compared of the abortion surgical group P 0(01 ( 2(E-cadherinWas in of of expressedcytomembranecytotrophoblast(Theexpression E??cadherin invillous was increased when protein cytotrophoblasts significantly compared tothatofthe abortion ofE??cadherinmRNAinthe surgical group P 0(05 ，theexpression ofthemedical abortionwas increasedwhen tothat ofthe group significantly compared abortion surgical group P 0(01 ( 3(The ofNF-迎andE-cadherininthemedicalabortionhas the expressions group significantcorrelation P O(01 ( Conclusions: The ofNF??1cBandE―cadherininhumanvillus expressions irregulatedby Mifepristone beoneofthemechanismsof may antiearlypregnancy( words: Key Nuclear factor-r,B;E-cadherin;villi;villous 4 ‘、( 山东大学硕士学位论文 符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 RT-PCR Reverse ChainReaction TranscriptionPolymerase 逆转录聚合酶链反应 DEPC diethylpyrocarbonate 焦炭酸乙二酯 HE hematoxylin-eosin 苏木素一伊红 DAB diamininobenzidine 二甲联苯胺 P 概率 probability PBS bufferedsaline phosphate 磷酸盐缓冲液 APES 3-amino silane 3一氨丙基一乙氧基甲硅烷 propyltriethoxy TNF(a tumor necrosisfactor-a 瘤坏死因子一仅 RNA ribonucleicacid 核糖核酸 cDNA acid complementarydeoxyribonucleic 互补 脱氧核糖核酸 dNTP nucleotide deoxy 脱氧核苷三磷酸 triphosphate IFN吖 Interferon-丫 干扰素吖 m剐NA ribonucleicacid messenger 信使RNA NF―r(B nuclearfactor 核转录因子(1cB kappaB，NF―kappaB PR progesteronerec印tor 孕激素受体 H202 albone 过氧化氢 hydrogenperoxide IOD Integratedoptiondensity 积分光密度 OD optical 光密度值 density ’ MIF Mifepristone 米非司酮 P13K 磷脂酰肌醇一3一激酶 phosphatidylinostitol??-3??-kinase EGF factor 表皮生长因子 Epidermalgrowth AKT Murine thymoma 致小鼠白血病V-Akt病毒 viral v-Akt oncogenehomolog 高度同源癌基因 5 、 山东大学硕士学位论文 正文 米非司酮对人早孕绒毛组织核转录因:rr--rm和E一钙粘素表达的影响 硕士研究生:郑晓静 硕士研究生导师:李明江教授 前 言 甾体类孕激素受体拮抗剂，与孕酮的化学结构相似，与孕酮受体结合能力是孕酮的3(5 倍，可与孕激素竞争受体，阻断孕酮与孕酮受体的结合和孕激素活性的出现。十几年 来，随着研究的不断深入，它不仅适用于终止早孕，还用于事后紧急避孕、引产，治 疗子宫内膜异位症、经前期紧张综合征、异常子宫出血，并在肿瘤治疗方面用于治疗 脑膜瘤、胶质瘤、前列腺癌、纤维肉瘤等。目前其用于早期终止妊娠的有效性和安全 性已得到肯定，其作用机制的研究不仅在受体水平拮抗孕激素的生理作用，而且对胚 胎及其支持组织的代谢和形态结构产生多方面的影响 n1。进一步研究发现，它可直接 作用于绒毛滋养细胞，并抑制它的增殖、诱导和促进其凋亡发生乜1。 研究表明细胞滋养层细胞在增殖、浸润和转移方面与肿瘤细胞存在相似之处，细 胞滋养层细胞分化为绒毛外滋养层细胞，进而对母体子宫黏附与侵入是植入与胎盘形 成的前奏。NF(r,B、E一钙粘素与肿瘤细胞生长分化、侵袭转移密不可分，同时它们也 与胚胎发育及器官形成息息相关，并在植入、胎盘分化和形成过程中起重要作用。 NF(KB是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子，是由Rel蛋白家族[包括 细胞因子如肿瘤坏死因子(仅、白细胞介素(1或其他如脂多糖 LPS 、氧化剂、病毒刺 多种靶基因的表达，多种信号均能活化NF(r,B，反之，NF(r,B可高效诱导多种细胞因 6 ‘、( 山东大学硕士学位论文 子，粘附分子，趋化因子，免疫识别受体和急性期反应蛋白 如C反应蛋白和D2(微球 蛋白 编码基因的表达，同时对参与炎症反应放大与延续的多种酶 一氧化氮合酶和环 氧化酶(2 基因的表达也具有重要的调控作用。NF(r(B通过调控上述基因的表达，进而 影响机体的炎症反应，调控T及B细胞的增殖、生长和分化，在体液和细胞免疫中 发挥重要的作用口1。NF(rub除调控与炎症反应和免疫应答有关的基因外，其在细胞增 殖和凋亡相关基因的调控中也起到关键作用。妊娠类似于半同种异体移植，而胚胎在 母体内存活直至分娩，是一个复杂的母体免疫耐受过程，有许多细胞因子的参与， NF(r(B的活化和抑制对妊娠的调控具有重要的作用。它是细胞控制许多基因表达的转 录因子，其在形态发生学和胚胎发育中起着中枢作用。早在1999年Nishikimi等就发 现，抑制NF(rJ3的活性可以导致91,的小鼠胚胎细胞阻滞于2(细胞期，表明胚胎植 入早期NF(rd3的激活是胚胎继续发育所必需的。过氧化氢是致使胚胎停止发育的一 个重要分子，而NF(r(B的激活部分性地阻断了其破坏作用。近期一个体外实验表明， 体外受精32h和120h有活力的小牛胚胎中过氧化氢浓度远低于无活力的小牛胚胎， 后者的凋亡细胞数明显增多。当加入NF(KB、p53与聚合酶(3的抑制剂时就更加触发 小牛胚胎细胞质或细胞核的碎裂，进而破坏线粒体，使其在植入前就停止发育H1。胚 胎和胚胎外组织过度凋亡是妊娠失败和先天畸形的主要原因，而凋亡是由细胞因子组 成的信号级联作为活性剂和效应器进行调节。从某种重要的意义上说，在胚胎和胚胎 微环境中，细胞因子又是作为特殊转录因子的活化剂，控制细胞的增殖，分化和凋亡。 这个特殊转录因子就是NF(rd3。事实上，所有NF(rd3 家族成员都按照特异的发育阶 段和细胞类型在胚胎、滋养细胞和子宫细胞中表达，NF(r(B介导的抗凋亡信号对于胚 胎发育及器官形成阶段是必不可少的;NF(rd3活性是与抵御应激导致的胚胎丢失和发 育障碍相关联的。因此，NF(kB抗细胞凋亡和激活细胞增殖的机制可能对胚胎有保护 作用[5-6]o E一钙粘素广泛分布于各种类型的细胞表面，为细胞间连接的主要成分，是介导同 种细胞间相互黏附的上皮细胞分布性黏附分子，主要参与胚胎发育以及正常组织中上 皮细胞层的形成和维持，其结构和功能的变化通过影响细胞的脱落与再附着而直接关 系到细胞生物学行为的改变。E一钙粘素对滋养细胞的侵袭行为起负调控作用，它在滋 养细胞分化过程中扮演重要角色。近年研究证实n1黏附分子基因上存在NF(r(B识别位 点，NF(rd3活化可影响细胞黏附性能。本实验通过对比观察米非司酮对人早孕绒毛组 7 、( 山东大学硕士学位论文 织中NF(r(B和E(钙粘素表达的影响，探讨其终孕的分子作用机制。 8 ‘, 山东大学硕士学位论文 1材料与方法 1(1主要实验仪器 1 超净工作台:江苏苏净集团安泰公司制造 2 低温冰柜:SANYO 3 PCR仪 9700型基因扩增仪 :Singapore 4 Eppendoff微量加样器:德国Eppendoff生物器材公司 5 Heraeus高速冷冻离心机:Germany J-20XP恒温水平离心机:美国贝克曼库特有限公司 6 Avanti IEC公司 7 Microwhx台式离心机:美国Thermo 8 XK96(A快速混匀器:中国 9 电子天平:Mettler 10 Galanz微波炉:中国 1 1 Alphamager2200凝胶成像及分析系统:美国 Alpha公司 12 DYY06C型电泳仪:北京市六一仪器厂 1 3 DY-W2型电泳槽:北京生物仪器厂 14 生物组织自动脱水机:湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司，型号ZT-12P 15 生物组织石蜡包埋机:YB-6LF型，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司 16 生物组织摊、烤片机:湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司 17 病理切片机:RM2135型，德国Leica公司产品 Works 1 8 S一6磁力搅拌器:IKAGuangzhou 19 恒温水浴箱:S(HH(W21(600S型，上海跃进产品 20 1810B自动双重水蒸馏器:上海 21 电热恒温箱:上海恒温设备厂 Ltd( 22 LeicaDM4000B显微镜:Leica Microsystems 23 图像分析仪:LEICAIM50，德国Leica公司产品 9 ‘, 山东大学硕士学位论文 1(2实验试剂 1 DEPC水 上游:TGTGTG从G从GCGGGACCT下 2 NF―rd3p65弓]物序列: 游:CTTGTCGGTGCACATCAGCT 物序列: 下 3 E一钙粘素引 游:GGATTATCGTTGGTGTCAGT 5 逆转录试剂盒:购自Fermentas公司 ( 6 PCR扩增试剂盒:购自宝生物有限公司 PBS 7 O(01M 8 4,甲醛 9 浓缩型鼠抗人NF(r,Bp65单克隆抗体:购自北京中杉金桥生物技术有限公司 10 E(钙粘素兔抗人单克隆抗体:购自abeam公司 11 链霉素抗生物素蛋白(过氧化氢酶 SP 试剂盒:购自北京中杉金桥生物技术 有限公司，包括:3,过氧化氢去离子水;封闭血清;生物素化二抗工作液;辣根酶标 记链霉卵白素工作液 12 浓缩型DAB试剂盒:购自北京中杉金桥生物技术有限公司 1(3主要试剂的配制 1M 1 0(0PBS PH 7(4 NaCL 99，Na2HP04??12H2069，NaH2P04??2H200(49用800ml去离子水溶解， 用水定容至1000ml 2 抗原修复液 枸橼酸盐溶液 : 储存液:A液:O(1M枸橼酸溶液 21(019枸橼酸+1000ml去离子水 B液:0(1M枸橼酸钠溶液 29(419枸橼酸钠+1000ml去离子水 工作液:9mlA液+41mlB液+450ml去离子水 PH:6(1+0(1 1(4研究对象 选择2008年9至10月在山东大学省立医院妇产科门诊就诊，经尿妊娠试验和B 超检查诊断为早孕5---7周，拟行人工终止妊娠者40例，随机分为药物流产组和人工 10 、 山东大学硕士学位论文 流产组。?药物流产组22例，患者自愿使用药物流产并符合药物流产适应症。口服 米非司酮25mg，每日2次，共3d，第4天早晨来院服米索前列醇600“g，并留院观 察，患者孕囊均在6h内排出;?人工流产组18例，行负压吸引术终止妊娠，均无异 常孕产史。两组平均年龄、平均孕期、平均产次及孕囊平均直径差异均无统计学意义 pO(05 ，见表1。40例既往月经规律，非哺乳期妊娠，均未置富内节育器，无生殖器炎 症及重要脏器疾病，近3个月内均未服用雌、孕激素。 1(5实验方法 1(5(1标本处理 组织标本用PBS缓冲液冲洗后，取约200mg立即放入(80?，其余全部置于10 ,福尔马林中固定12"--24h，常规石蜡包埋后制成4"-'-"51(tm厚的组织切片。 1(5(2免疫组化方法 基本原理:免疫组化是应用免疫学基本原理――抗原抗体反应，即抗原与抗体特 异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 荧光素、酶、金属离子、同位 素 显色来确定组织细胞内抗原 多肽和蛋白质 ，对其进行定位、定性及定量的研究。 抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组织化学先将组织或细胞中的某些化 学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体， 再用这种抗体 第一抗体，简称为一抗 作为抗原去免疫动物制备第二抗体 简称为二 抗 ，并用某种酶 常用辣根过氧化物酶 或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将 抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于 组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来 常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒 。通 过抗原抗体反应，即呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看 见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的 分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、 多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 SP法即链霉素抗生物蛋白(过氧化物酶连结法，是采用生物素标记的第二抗体与链霉 菌抗生物素蛋白连接的过氧化酶及基质素混合来测定 细胞和组织中的抗原，其原理可 简单写为:一抗+生物素标记二抗+辣根酶标记链霉卵白素+辣根酶底物显色结果，SP 法将链霉卵白素和酶直接偶联在一起，减少了实验步骤，增加了敏感性。SP法是目前最 常用、可靠及最成熟的方法，特异性强，灵敏度高，方法简便快捷，易操作。 。、 山东大学硕士学位论文 实验步骤:分别以人类乳腺癌、鳞状细胞肺癌组织切片为阳性对照，PBS代替一抗 为阴性对照，每例组织石蜡块切片共7张，1张HE染色核实病理诊断，余6张行免疫组化染 色。载玻片用APES进行防止脱片处理，切片厚度为 4"--51xm。 1 将石蜡切片常规脱蜡水化;蒸馏水冲洗，PBS浸泡5mira 2 切片在95"--'98"C柠檬酸缓冲液中抗原修复15min; 5 滴加一抗NF―r,Bp65 1:500 ，E一钙粘素 1:700 ，4"C过夜; 孵育25min; 化后，中性树胶封片。 每例标本重复两次。 结果判断标准: 000 每份标本在LeicalM50显微镜下随机选取5个视野，每个视野高倍镜下计数1 个细胞。细胞结构清晰，胞浆或胞核内出现棕黄色颗粒为NF(rd3阳性表达;胞膜或 胞浆内出现棕黄色颗粒为E(钙粘素阳性表达。以着色深浅和阳性细胞比例计分:细胞 无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分;阳性细胞比例;0分:阳性细 ++ ， 4分强阳性 +++ 。 1(5(3逆转录一聚合酶链反应CRT-PC釉 用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或枪 测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。 i 1(5(3(1总RM的提取 采用Trzol一步法提取总刚^ 1 取少许组织，加10倍体积Trizol，置冰上用眼科剪将其剪碎。 12 、 山东大学硕士学位论文 2 冰上孵育 静置 5min。 4 4。C离心，120009x15min。 5 匀浆形成三相，转移含有RNA的上层水相至一 新离心管中。 7 4?离心，120009x10min。 750I(tl无水乙醇，2501alDEPCH20 。 9 4"C离心，75009×5min。弃上清，室温干燥沉淀5"-"10min。 10 加入适量DEPCH20溶液溶解RNA沉淀。 1 1 NanoDrop分光光度计测定RNA浓度及纯度。 1(5(3(2逆转录反应 育5min。 dNTP 2 短暂离心后，冰浴中加10mM mix2pl，5xreactionbuffer4Ltl，核糖核酸酶 抑制剂 20u,?1 1p1，共71al，混匀后37"C孵育5min。 10分钟 3 加入RevertAidTM 至4?。 4 逆转录合成cDNA，置冰浴或(20。C保存。 1(5(3(3聚合酶链式反应 PCR 上述反应完毕后，快速离心，加入下列成分进行PCR反应。 1 PCR扩增反应体系 总反应体积20I(t1 10xPCRBuffer 2pl dNTP10mM 1(6I(tl eDNA 2pl 上游引物0(2,0(5pl 下游引物0(2,0(5“l 0(I,0(2 “l TaqDNA聚合酶 5u,p,1 13(9,1 灭菌三蒸水 3(21al 、 山东大学硕士学位论文 2 引物 3 PCR反应条件 NF(r(B扩增条件94"C30s，59"C30s，72"Clmin， 35个循环;E一钙粘素扩增条件 94?30s，52?30s，72?lmin，35个循环。 4 电泳并图像分析 NF(rd3和E一钙粘素的光密度与其相应的内参照光 密度相比，其比值作为它们的相对 表达量。 1(6统计学处理 采用SPSSl3(0进行统计学分析，计数资料用矛检验或成组两样本比较的秩 和检验进行比较，计量资料以;C4-s表示，用两独立样本的均数t检验进行比较，两变 量相关分析采用Pearson相关分析，P 0(05为差异有统计学意义。 14 , 山东大学硕士学位论文 结;口7―果 1(两组NF(v(B蛋白和旅M表达强度的比较 NF(1cB蛋白在正常早孕绒毛组织中呈阳性表达，主要定位于绒毛滋养层 细胞滋 养层和合体滋养层细胞 、绒毛间质细胞的胞核和胞浆。药物流产组细胞滋养层NF(1cB 蛋白表达强度明显低于人工流产组，组间差异有统计学意义 尸 o(05 。药物流产组 2(两组E-钙粘素蛋白和哝M表达强度的比较 E一钙粘素蛋白在正常早孕绒毛组织中呈阳性表达，主要定位于绒毛细胞滋养层细 胞，合体滋养层细胞和绒毛间质中不表达。药物流产组细胞滋养层E一钙粘素蛋白表 达强度明显高于人工流产组，组间差别有统计学意义俨 O(05 。 药物流产组E一钙粘素 mRNA表达为0(675 素mRNA明显高于人工流产组，组间差别有统计学意义0 9(819，P 0(01 。 3(药物流产组中NF(r,B和E一钙粘素旅M表达之间具有显著相关性 fr O。-759。P 0(01 山东大学硕士学位论文 讨 论 米非司酮作为强有力的孕激素受体拮抗剂，已被临床广泛地应用于终止妊娠，其 作用机制的研究也已发展到基因水平。随着深入研究发现，它除了与孕激素受体结合 使蜕膜发生变性、坏死，导致绒毛滋养细胞变性、胚胎死亡终止妊娠外，还可直接作 用于绒毛滋养细胞，并抑制它的增殖、诱导和促进其凋亡发生心1。同时本文研究对象 早孕绒毛中的细胞滋养细胞在细胞增殖、侵袭、转移方面，与肿瘤细胞表现出惊人的 相似性，并且在此过程中NF(rd3信号转导途径起主要作用阳叫。 NF(r(B是一类能与多种基因启动子部位的lcB位点发生特异性结合促进转录的 任意两种蛋白所组成的同源或异源二聚体，其中以p50,p65最普遍。目前，发现受 NF(r,B调控的基因至少有180种之多，包括维持妊娠的许多因子如生长因子、粘附因 的凋亡，与局部免疫动态平衡密切相关，是妊娠局部微环境平衡的重要调节因子n四2|。 本研究发现NF(r(B广泛表达于正常早孕绒毛组织中，并且在细胞滋养层细胞和绒毛 间质中存在一定的活化，说明NF(r(B与维持妊娠关系密切。 近年研究NF(r(B信号转导途径与肿瘤细胞凋亡息息相关，它可以通过多种途径抑 亡基因 Bcl一2、Bcl―X、survivin 、细胞周期调控基因 cyclin 的表达。本研究对象早孕绒毛滋养细胞类似于肿瘤细胞，研究结果中药物流产组早孕 绒毛细胞滋养层细胞NF(rd3蛋白的表达比人工流产组显著下调，推测与NF(r,B的抗 凋亡作用减弱有关。BegAA等在剔除RelA基因的胎鼠发育到妊娠中期时死于大片肝 细胞凋亡的实验中首次发现了NF(r(B具有抑制细胞凋亡作用n 31。TorchinskyA在研究 应激所致的胚胎丢失和发育障碍与NF(r,B活性关系中表明，NF(r(B的抗细胞凋亡和 激活细胞增殖机制可能对胚胎有保护作用瞄吲。近期Hou Y指出IKKl3,NF(r,B信号通 路在胎肝窦状脉管系统形成过程中起到举足轻重的作用，内皮细胞IKKl3的缺失会导 致13(5,15(5天的胚胎死亡n引。Ge C等发现NF(vd3p65信号途径可促进EGF等诱导 鸡原始生殖细胞增殖n516|。这些都从不同方面说明NF(r,B的抗凋亡在胚胎发育中具有 重大影响。 妊娠期间孕酮通过孕酮受体 PR 使子宫处于休眠状态是妊娠成功的关键，而大部 16 山东大学硕士学位论文 分孕酮靶组织也都表达调整NF(r(B的细胞因子受体。孕激素降低子宫内膜间质细胞 的NF(1出活性n7|，米非司酮作为孕激素受体拮抗剂，可导致蜕膜中NF―rd3的表达升 高n刖，而对绒毛中NF(r(B表达和功能的影响，目前尚未有报道。本研究结果提示正 MJ 体外研究米非司 常妊娠的绒毛组织中适度的NF(1cB表达和活化是必需的，Gallego 酮等拮抗剂抑制人胚胎干细胞分化成具有三胚层胚盘的胚状体，表明与激素分泌联系 密切的滋养层对诱导囊胚和神经胚形成起重要作用n9。。而细胞滋养层细胞是分裂增殖 迅速、生长活跃的细胞，合成孕激素、HCG等重要激素的合体滋养细胞由它分化而 蛋白表达减弱，推测与NF(r,B及其调控基因的功能减弱或异常有关，如抗凋亡作用 减弱，细胞分化增殖受阻;基因调控下的生长因子和粘附分子等表达异常，从而影响 了胚胎的正常生长发育，导致流产。这与前面所述的NF(r,B的异常改变可以影响胚 胎发育的观点一致。 钙粘素是一组钙离子依赖性的细胞单链跨膜糖蛋白，既是受体，又是配体，主要 介导特定组织或器官同型细胞间的粘附，因只在Ca2+存在时才能发挥粘附作用，故而 得名。E一钙粘素分子量124kD，是其家族中经典成员，E一钙粘素在细胞外的氨基末端 与相邻细胞的E一钙粘素的氨基末端，在cE+存在下形成“拉链样’’结构，使细胞之 间紧密连接;而细胞内的羧基一端则通过粘连素 catenin 与细胞质中的肌动蛋白丝相 连，使E一钙粘素间接地附着于细胞骨架。E一钙粘素主要参与胚胎发育以及正常组织 中上皮细胞层的形成和维持，其结构和功能的变化通过影响细胞的脱落与再附着而直 接关系到细胞的生物学行为的改变。 近年研究表明E一钙粘素表达下降或缺失使瘤细胞丧失接触抑制而无限制增生， 失去分化，细胞间连接松散易于脱落，并获得较强的侵袭能力，极易扩散和转移啪3。 滋养细胞与肿瘤细胞存在许多共同特性，其中E一钙粘素在调节滋养细胞侵袭过程中 同样起到重要作用。ChristosCoutifaris等的研究结果表明在一定程度上时空表达规律 的E一钙粘素调控着细胞滋养细胞聚集融合并分化为合体滋养细胞的过程心?。Fahimeh 细胞保持侵袭转移性的关键心刳。E一钙粘素对滋养细胞的侵袭行为起负调控作用，可见 它在滋养细胞分化过程中扮演重要角色。滋养层入侵缺陷将导致 体外受精 3,7w 的 失败和妊娠并发症的发生，包括先兆流产、胎儿生长受限、早产、胎盘早剥和死胎。 17 山东大学硕士学位论文 本实验中药物流产组早孕绒毛细胞滋养层细胞E一钙粘素蛋白和mRNA的表达比人工 流产组显著升高，通过重建基底膜进而影响了滋养细胞的迁移和侵袭能力。病理妊娠 先兆子痫中E一钙粘素在不同孕周细胞滋养层细胞中表达升高，是异常的细胞滋养细 胞增殖和受损细胞滋养细胞分化改变的潜在致病的基础乜引。 多个信号转导途径可影响E一钙粘素细胞及亚细胞水平的 异常分布。如P13K的下 游因子AKT可调控E一钙粘素mRNA和蛋白水平，即在分子水平AKT抑制E一钙粘素 基因的转录:Criswell 在一定程度上通过抑制NF(r,B介导的E一钙粘素的表达而起到肿瘤抑制的作用。通过 统计软件分析显示，NF(r,B与E一钙粘素mRNA表达呈显著负相关，即早孕绒毛组织 强。近年研究证实黏附分子基因上存在NF(1cB识别位点，NF(r,B活化可影响细胞黏 附性能。NF(r,B信号通路的激活和多种肿瘤的肿瘤进展和转移有关，而E一钙粘素是 转移抑制蛋白乜41，因此，推测米非司酮可能通过抑制NF(r,B的表达，进而增加其靶 基因E一钙粘素的表达，从而达到抑制滋养细胞增殖，促进凋亡的作用。这与ChuaHL 等对乳腺癌的研究结果一致口51。另外在研究黑色素瘤细胞中，E一钙粘素再表达可使 NF(1出活性显著下调心6。271，而结直肠癌中E一钙粘素表达缺失可导致NF(r,B激活啪3。 由此可见NF(r,B和E一钙粘素之间的相互作用复杂，其具体作用机制仍需进一步研究。 可进一步扩大样本和设计实验证实此相关性。 综上所述，米非司酮引起早孕绒毛细胞滋养层细胞NF―r(B表达下调，E一钙粘素 表达升高，且在药物流产组中NF(r,B和E(钙粘素表达之间具有显著相关性，两者表 达异常，可能是药物流产的机理之一。 18 山东大学硕士学位论文 结 论 人工流产组和药物流产组标本均存在NF(rd3和E一钙粘素的表达，其表达具有显 著性差异，从分子水平推测NF(r,B和E一钙粘素的变化可能是米非司酮终止早孕的机 理之一。 19 山东大学硕士学位论文 附 图