凝血八因子安全性初探

凝血八因子安全性初探 一、天祸 人类的健康发展和微生物的感染息息相关，抗生素的发明阻止了细菌的肆虐，对病毒感染人类目前还没有彻底的解决之道，经血传播的病毒更是威胁着人类的健康，乙肝、甲肝、HIV和丙肝，一个接一个。不幸的是人类对灾害的认识往往迟于它的发生，法国和日本的八因子HIV污染事件导致社会的政治危机，但不知还有多少类似事故被无情的掩埋。但人类的恐惧不会被掩埋，作为血友病患者的您整天胆颤心惊，不知那天灾难降临。您也许会仰天长叹:同样是上帝的子民，为何我的灾难一重又一重。 二、祸之厉 目前经过多年的科学研究发现经血传播的病毒如下: 1(HIV 破坏人体的免疫系统，全球1000余万人死亡。----致命性，属于脂包膜病毒。 2(HBV 急慢性肝炎，有相当一部分人最终会转变为肝硬化肝癌,直至死亡。----致命性，属于脂包膜病毒。 3(HCV 和HBV类似。----致命性，属于脂包膜病毒。 4(HAV 急性肝炎，一过性，一次感染，终身免疫。----非致命性，属于非脂包膜病毒。 5(Parvo B19 是微小病毒中危害较大的一种，可能会导致孕妇流产，出血性紫癫，关节酸痛等。----非致命性，属于非脂包膜病毒。 当然我们发现还有很多经血传播的病毒对人类有潜在威胁，主要是一些微小病毒，但对 人类的危害很小。相关科技人员时刻在做这方面的研究，以前很少有厂家对Parvo B19进 行检测，1998年开始国外有部分公司将此作为一项常规检验，国内目前还没有开展。 三、祸起何因 1(八因子是血浆中最不稳定的，在制造工艺中提取它所需的低温不是最低且所 需的酒精浓度不是最高，较其它血制品它在分离过程中所受到的病毒灭活作用不够 充分。 2(八因子是最不耐热的，传统的用于白蛋白的加热灭活方法不能用于八因子，除非使用特殊的稳定剂。在SD技术发明以前，该类产品绝大部分没有经过特殊的病毒灭活处理。 (血友病患者是长期使用血制品，"中弹"机会较高。 3 4(技术和法律制定的延迟性，病毒的发现至检测的商用化有一过程，技术的使用从摸索到成熟有一过程，法律上不到强制性要求又有一过程。 以上几点足可以解释为何将八因子列入"高危血液制品"。 四、补天之道 我们真的是手足无措了吗,不是的。我们已经有了解决之道。 1(检测技术的进步 国际上较大厂商，在血浆筛选中均开始使用高灵敏度的试剂(如:PCR技术)检测经血传播的病毒，包括乙肝(HBV)、甲肝(HAV)、爱滋病(HIV)、丙肝(HCV)和Parvo B19病毒。PCR技术优点是假阴性率低，大大缩短病毒检测的窗口期，但缺点也是很明显，主要是它的假阳性率较高，费用昂贵，在医院临床上的使用颇多争议。但在血浆工业中的优势是不用怀疑的，血浆工业在筛选试剂方面更看重它的低假阴性率和低窗口期，也就是较小的漏检率。鉴于普通酶标法检测HCV有较大的漏检率(比较理想的试剂为2.5%-5%)，欧盟已制定相应的法规，对HCV强制性使用PCR检测。国内目前没有一家厂家将PCR检测作为血浆筛选的，包括HCV。 2(血浆管理的进步 ?国际上各大公司对献学血员有严格的筛查，不光检测，还包括询问献血员的一些 隐私，避免一些同性恋、吸毒者、性生活混乱者、接受器官移植者等的加入。一 次拒绝， 终身拒绝，全国范围内拒绝。有些国家也开始鸦片类物质的检测，避免吸毒者加入献血 大军。 ?国际上各大公司对采集的初次检验合格的血浆需存放一定时期，必需超过以上 五种病毒的最长"窗口期"，根据使用试剂的不同一般定为60天~90天，待献血员的第 二次检测合格后，第一次采的血浆才可以投入使用，此方法称"缓役"或"Look back System "或"Feedback System"。鼓励献血员重复多次定期采血，确保血浆最大限度的避免"窗口期"病毒的污染。 ?身份识别系统采用，全国献血点的计算机联网，确保献血员身份的真实有效。实现献血员数据共享。 我们国家在血浆管理方面方面有了长足进步，国内的厂家也实施以上的管理措施。1996年开始全国强制使用机器采血，避免了交叉污染的发生，该措施的意义在于直接保护了献血员，间接保护了血源，使我国的血浆管理从硬件上上了一个档次。目前国家正通过发行国债募集资金，改善基层血站的硬件设施，提升我们的检测和管理水平，最终提高我国血源安全性。现在举国上下对血源安全性的认识已经上升到一个战略高度。血源的安全不光和来源地有关，更重要是和总体管理有关。 3(病毒灭活的广泛使用 根据病毒的不同特性，如是否有脂包膜、是否耐热、是否耐酸、对辐射的敏感性和直径的大小等，开发了多种解决方法。根据统计，现在发达国家的任何血液制品必须至少使用以下?和?两种病毒灭活方法中的一种才有可能通过所在国卫生部门的批准上市。现在逐一介绍: ?加热法 A.巴氏法 60?10小时的水浴加热, 对脂包膜病毒有效，如HIV、HBV和HCV,对部分非脂包膜病毒有效，如HAV,对一部分非脂包膜病毒无效，如Parvo B19。巴氏法是一种比较全面广谱的病毒灭活方法，几乎所有厂家用此作为比较 耐热的白蛋白的病毒灭活，但由于技术掌握的关系，例如稳定剂的使用等，该方法较少用于不耐热的免疫球蛋白和凝血因子，包括八因子，掌握 不好会影响蛋白分子结构。本人记忆中，用该方法处理八因子的国外厂家不超过2家，主要 是几家老牌大公司。 B.干热法 主要为80?72小时干热，也有100?1小时快速干热法。 C.蒸汽加压加热法，10小时60?压力190mbar +1小时80?压力370mbar。 ?SD法 全称为溶剂和去污剂法。首先我们要谈以下一个奇怪的现象，甲肝病毒一般通 过消化道传播，乙肝病毒一般不通过消化道传遍，但胆汁分泌障碍的人通过消化道 感染乙肝的概率较高，有科学家发现这和胆汁溶解乙肝病毒的脂包膜有关。通过以上原理，科学界用磷酸丁三脂(TNBT)和聚山梨脂(Tween 80)来溶解脂包膜破坏病毒结构起到病毒杀灭作用，实验和临床观察，对脂包膜病毒有非常高的灭活作用，对蛋白分子结构的影响也很低，但美中不足，对非脂包膜病毒无任何效果。一般用于免疫球蛋白和凝血因子，也有用于血浆的灭活。 自从八十年代HBV和HIV的发现，1985年开始各国法律血制品必须经过有效的病毒灭活方可上市，十多年的历史经验和科学实验证明加热法和SD法可以有效灭活致命性的HIV、HBV和HCV，临床上也没有发现一例使用以上灭活方法的血制品而感染以上病毒的。国外有的厂家在1985年以前已开始使用加热法灭活血液制品，回顾性访问，也没有发现一例感染上述病毒。国内1996年开始使用SD灭活八因子，八十年代开始使用加热法灭活白蛋白，也没有发现问题。国内外大量的数据证明，加热法(巴氏法)和SD法对致命性的HCV、HBV和HIV的灭活是安全可靠的。当然我们也必须认识到SD技术对HAV和B19无任何灭活作用，SD技术的不足显而易见，它对非脂包膜病毒的灭活效果几乎没有。尽管血浆经过HAV筛选，但还是不够，必须还有有效的灭活，美国一家公司1996年就因为八因子被HAV污染被迫召回全部产品。国外的专家建议长期使用只经SD灭活的八因子，本身HAV抗体阴性的血友病患者，最好接种 HAV疫苗，以获得主动免疫。在我国由于特殊的饮食和卫生习惯，健康成人人群中HAV抗体阳性率很高，血友病患者中的情况可能也类似，但对儿童接种HAV疫苗是一项不错的选择。SD技术的不足催生了SD加"干热法"或加"蒸汽加压加热法"的应用，也就是我们经常提到的"两步法"。 ?亚甲蓝加紫外光C段照射。 用一定波长和一定量的紫外光照射光敏剂亚甲蓝会产生一系列反应(光激活作用)， 起到灭活病毒作用，主要针对非脂包膜病毒和耐热病毒等，一般作为以上2种方法的补充。 上海血液中心已经成功开发此项技术，相信不久的可将来可大规模的使用。亚甲蓝作 为"国家医保"目录中的一种常用药，在临床上广泛使用，主要用于氰化物和亚硝酸盐 中毒的解救和手术中的导引剂等，据临床医生介绍常用剂量无明显近期副作用，过大量使用可引起恶心、腹痛、心前区疼痛、眩晕、头痛、出汗和神志不清及变性血红蛋白血症等，尤其是对儿童。长期使用的远期副作用不得而知。从血浆中去除它也需要一定技术，据称目前去除率约85%，还有相当的残留量。 ?纳米过滤 纳米技术是一个时髦的话题，按照国际上通行的说法只有10nm-100nm的技术才可称纳米技术。在血液制品工业中，只有使用直径为10nm-100nm的过滤器才可称纳米过滤。我们现在所看到的国内各血制品厂家宣传资料上宣称的直径最小的过滤器为200nm或只写使用纳米技术不介绍滤器直径的大小。一般病毒如HIV和HBV等的直径均小于100-150纳米，甲肝病毒才27nm，直径200nm的过滤器只能过滤细菌，而不能过滤绝大部分病毒。真正的钠米技术在有些国外的厂家使用，它的优点非常明显，对血制品的活性无任何影响，但它也存在一次性使用价格过高，监测困难等缺点等。该技术也只能成为以上?和?种方法的补充，单独作为一种灭活方法风险较大。 ?单克隆抗体免疫亲和层析 在生产过程中，利用特定的抗体和特定的蛋白结合并与其它物质分离的特点 来提取和提纯八因子，同样它也可使所结合的蛋白和病毒分离。它的物理性分离实质上也起到了病毒灭活作用，且对脂包膜和非脂包膜病毒都有效。由于它是?和?种方法的补充，对非脂包膜病毒灭活的意义远大于脂包膜病毒。由于具有一举两得的功效，在八因子的生产过程中大量使用，包括基因重组八因子。 ?低PH孵放 利用某些血制品在生产过程中必须将PH拉低和某些病毒不耐酸的特点，将PH拉低至4同 时孵放21天的技术灭活病毒。该技术在免疫球蛋白生产中大量使用，但也有专家提出不 同看法，国内外大量实验明孵放14天仍检出病毒。好在八因子的生产过程中不用该 项技术。 病毒灭活技术很多，还有很多方法在试验中，病毒灭活技术再先进，也不能完全 杜绝病毒污染的可能性，但它的好坏决定了发生可能性的大小，选择了理想的病毒 灭活方法，发生的概率低至可以忽略不计，也就是说理论上有可能性，但事实上不会发生，我们也可以说经过此方法处理的血制品是安全可靠的，是值得信赖的。但仍有一些人信赖血浆和冷沉淀，由于血浆和冷沉淀是一个献血员对一个接受者，也就是所谓的"一对一"，而八因子可能是5000份以上血浆的混合生产，所谓的"多对一"，有人认为前者可能更安全，染上病毒的概率更低，但不要忘记前者无"Look Back System",无法避免"窗口期"病毒污染，也无法避免检测试剂的漏检率，无有效的病毒灭活工艺，退一步说血友病患者需终身使用血制品，多次使用来源于不同人的血浆，"一对一"的概念其实是不存在的，这种所谓的相对安全是站不住脚的，尤其在我国还没有病毒灭活血浆上市。国内外的经验证明使用经过有效病毒灭活的血制品大大安全于没有经过处理的血浆或冷沉淀。 五、禍兮福所倚 人类从发现血友病到利用血浆补充治疗，发展到冷沉淀，到粗提取八因子到精制免疫层析八因子，从没有病毒灭活到多种灭活技术广泛应用，从必须从血浆 中提取，到基因重组，整个技术的走向是追求更安全的八因子。但我们看到尽管重组八因子避免了从血浆中提取，但它还是需要人或动物的细胞作为培养基，部分产品还是要添加人血白蛋白作为稳定剂，理论上的风险已经是很小了，但还是存在的。但在最好的技术没有来临之前我们只能选择当前最好的产品，从安全性由高到低来看，基因重组产品>加热法或"两步法"人血八因子>单一的SD灭活人血八因子>未经灭活处理的血浆和冷沉淀。 转基因技术的研究也是如火如荼，上海科学家曾一繁教授将人的八因子基因片段植入牛的 胚胎细胞，待牛长大以后，利用牛奶作为表达方式，可以大量生产八因子。尽管目前表达率 较低，提纯方法也是问题，但前景还是被看好，主要是价格的低廉。 真正的终极解决方法是基因治疗，美国有一家公司以人肝的或肌肉细胞作为靶细胞的 血友病乙基因治疗方法已通过FDA批准开始临床二期试验，血友病甲的基因治疗方案正 处于临床试验前期(Preclinical)。如果到最终成功的那天，血友病将成为一种治 疗方法极为简便的疾病，如同治疗一次普通的肺炎且一劳永逸，这是实实在在的可 能，不是空想，但愿那时费用也不是问题。 美国批准可上市的治疗血友病甲的药物 ------------------------------------------------------------------- 商品名 生产公司 来源 病毒灭活 稳定剂 备注 ------------------------------------------------------------------- 一. 重组八因子 Helixate Aventis Behring 基因重组 免疫亲和层析 蔗糖 Kogenate Bayer 基因重组 免疫亲和层析 蔗糖 Recombinate Baxter Hyland Immuno 基因重组 免疫亲和层析 白蛋白 ReFacto Genetics 基因重组 免疫亲和层析/SD 蔗糖 二.单克隆抗体层析高纯度的浓缩人血八因子 Hemofil Baxter Hyland Immuno 人体血浆 免疫亲和层析/SD Monarc-M American Red Cross 人体血浆 免疫亲和层析/SD Monoclate Aventis Behring 人体血浆 免疫亲和层析/巴氏 三.适用于VW因子缺乏的浓缩八因子 Alphanate Alpha Therapeutics 人体血浆 亲和层析/SD/干热 Humate-P Aventis Behring 人体血浆 巴氏 唯一经过FDA批准用于VWF缺乏的患者。 Koate DVI Bayer 人体血浆 SD/干热 四.其它 Hyate-C Speywood Biopharm 猪血 无 用于产生抗人八因子抗体的患者 中国批准上市的八因子 -------------------------------------------------------------- 海莫莱士 上海莱士 人体血浆 SD技术/干热(100?0.5小时) 康斯平 河南华兰 人体血浆 SD技术/纳米过滤