鱼类体液免疫因子研究进展

水 产 学 报 第 24 卷第 4 期 Vol . 24 , No . 4 Aug . , 2000 2000 年 8 月J OURNAL O F FIS HERI ES O F CHINA ( ) 文章编号 :1000 - 0615 200004 - 0376 - 06 综?述? 鱼类体液免疫因子研究进展 Humoral immune factors of f ish : a revie w 张永安 , 聂 品 ( 中国科学院水生生物研究所 , 湖北 武汉 430072) ZHAN G Yong2an , NI E Pin ( )Institute of Hydrobiology , CAS , Wuhan 430072 , China 关键词 :鱼类 ; 体液免疫因子 Key words :fish ; humoral immune f actor 中图分类号 :S917 文献标识码 :A 同高等脊椎动物一样 , 鱼类也是通过免疫系统来抵御外来病原生物的侵害 , 通过非特异性和特异性的免疫防御机制 来维持机体的正常功能及自身内环境的稳定 。但是 , 近年来鱼类病害发生频繁 , 其中某些疾病给水产养殖业造成灾难性 [ 1 ] 的危害 。这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。因此 , 对鱼类特别是重要的经济鱼类免 疫系统的研究受到国内外学者的广泛关注 。鱼类的免疫系统是鱼体执行免疫功能的机构 , 是产生免疫应答的物质基础 , 由免疫器官 、免疫细胞和体液免疫因子组成 。本文着重就鱼类体液免疫因子的研究进展作一概述 , 包括抗体和多种非特 异性的免疫分子 。 1 抗体 抗体是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中 , 由淋巴细胞产生的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的 球蛋白 。1964 年世界卫生组织决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白 。免疫球蛋 白是化学结构的概念 , 而抗体则是生物学功能的概念 。免疫球蛋白包括抗体和一些未证实抗体活性的异常免疫球蛋白 。 因此 , 抗体都是免疫球蛋白 , 但免疫球蛋白并非都是抗体 。不过 , 通常情况下抗体与免疫球蛋白作为同义词混用 。 抗体主要以分泌形式存在于血液和其它体液中介导体液免疫 , 还可作为抗原受体结合于 B 淋巴细胞膜上 , 即膜面 ( ) 免疫球蛋白 。根据重链 H 链恒定区化学结构的不同 , 可以将免疫球蛋白划分为多种类型 。从系统进化的角度来讲 , 地 位越低等的动物产生的免疫球蛋白的种类越少 。例如 , 哺乳动物具有五类免疫球蛋白 , 而鱼类是最早产生免疫球蛋白的 [ 2 - 4 ] 动物 , 可能仅有一类免疫球蛋白。 1 . 1 免疫球蛋白的分子结构 [ 5 , 6 ] 目前人们已从许多鱼类中分离得到免疫球蛋白 。无颌鱼类免疫球蛋白表达量很少 , 有关其特性目前尚有争议。[ 7 ] ( ) 有颌鱼类血清中主要免疫球蛋白类似于哺乳动物的 IgM 下文通称 IgM, 在血液中的相对水平较哺乳动物的高, 是由 μ(() ) μ等量的重链 链 , 分子量约 60,81kD和轻链 L 链 , 分子量约 20,30kD 组成 。其结构基本重复单元为L , 即单体形 22 ( ) 式 , 包含 2 个抗原结合位点 。软骨鱼和肺鱼高分子量 IgM 是五聚体 分子量约 900,1 000kD , 与高等脊椎动物的一样 , ( ) 含有 10 条重链和 10 条轻链 。硬骨鱼高分子量 IgM 却为四聚体 分子量约为 610,900kD , 含有 8 条重链和 8 条轻链 , 它[ 8 ] 们之间一般是 由 共 价 二 硫 键 连 接。但 事 实 上 , 许 多 硬 骨 鱼 IgM 多 聚 体 亚 单 位 间 在 某 种 程 度 上 存 在 非 共 价 连 接 收稿日期 :1999 - 08 - 26 ( ) 基金资助 : 中国科学院“九五“重大 B 资助项目 KZ951 - B1 - 111 ( ) 作者简介 : 张永安 1972 - , 男 , 陕西省西安人 , 博士 , 主要从事鱼类免疫学研究 。Tel :027 - 87647721 , E2mail : Fishdis @ihb . ac . cn [ 9 , 10 ] [ 11 ] 键。同哺乳动物一样 , 某些鱼类高 分 子 量 IgM 单 体 间 也 发 现 有 J 链 连 接, 但 是 另 外 一 些 鱼 类 IgM 可 能 缺 少 J[ 5 , 9 ] 链。鱼类免疫球蛋白 H 和 L 链分别包含数个独特的功能区 , L 链有两个 , 而 H 链有三个 、四个或五个 , 它们分为两 ( ( ) ) 类 :N 端为可变区 V H 和 VL , C 端为恒定区 CH1 - 4 和 CL 。V 区是抗体分子上可与抗原结合的部位 , 包含三个互补性 ( ) () 决定区 complementarity determining region , CDR1 - 3, 另外还有四个构架区 f ramework region , FR1 - 4。 1. 2 免疫球蛋白的基因结构 ( ) 鱼类两种形式 膜结合形式和分泌形式的免疫球蛋白是由相同的基因编码的 , 但信使 RNA 前体的加工过程决定着 [ 12 ] 哪种形式的免疫球蛋白将被合成与表达。硬骨鱼类免疫球蛋白 H 链基因座的组织形式与哺乳动物的一样 , 即数百个 ( ) ( ) 可变区基因区段 variable segment , V 位于多变区基因区段聚簇 cluster of diversity segment , D 的上游 , 紧接着是连接区 H () ( ) 基因区段 joining segment , J , 而在 3’端是编码恒定区 constant region , C的基因区段 。这种基因组织形式称为“易位 HH [ 13 - 15 ] ( ) 子”排列。板鳃亚纲鱼类免疫球蛋白 H 链和 L 链基因座是以另一种称为“多簇”排列的形式组织的 , 即 V , D ,J 和 [ 16 - 19 ] ( ) C 区段形成聚簇 , 它们在基因组中作为统一体可多次复制。硬骨鱼类 L 链基因座也是以 V- J- C多簇的形式 L L L [ 20 , 21 ] [ 22 ] ( 组织的 , 但进一 步 分 析 表 明 V区 段 与 J 和 C区 段 的 转 录 方 向 相 反。Amemiya 等报 道 了 腔 棘 鱼 L atimeria L L L ) chalumnaeV 和 D 区段形成聚簇 , 但 J 和 C的定位还不清楚 , 这可能是 H 链基因座的另一种组织形式 。基因座中 V H H HH [ 5 , 12 ] 区段为 Ig V 功能区的 CDR1 和 CDR2 编码 , CDR3 由 D 区段编码 ; 而 V功能区的 CDR1 - 3 都是由 V区段编码的。 H L L 1. 3 免疫球蛋白类和亚类的多样性 所有陆生脊椎动物都有不止一类免疫球蛋白 , 但是鱼类免疫球蛋白是否也具有类或亚类的多样性 , 目前还存在诸多 争议 。 [ 23 ] [ 24 ] L obb 和 Olson和 Killie 等分别用单克隆抗体检测出硬骨鱼类存在抗原性不同的高分子 量 IgM 。Ghaff ari 和 [ 25 ] ( ) L obb对斑点叉尾 Ictalurus punctatusIgM 肽谱及 N 端有限氨基酸序列进行比较分析同样表明硬骨鱼类具有不止一 [ 26 ] 类的高分子量 IgM 。Hordvik 等的研究也表明鱼类具有两类由不同基因座编码的四聚体 IgM 。但是这并不能排除单抗 是同重链可变区而非恒定区抗原决定簇作用的可能 , 而且被认为是编码另一类 IgM 的 DNA 序 列 并 不 一 定 是 功 能 基 [ 5 ] 因。因此 , 硬骨鱼类是否仅有一类多聚体 IgM , 还需进一步研究 。 [ 27 - 31 ] 一些鱼类血清或卵中存在低分子量的免疫球蛋白 , 其 H 链分子量或抗原性明显不同于高分子量 IgM 的 H 链。这似乎说明了低分子量抗体代表另一类免疫球蛋白 。但是也有人认为低分子量的抗体是 IgM 的单体或二聚体形式 , 它 们看来并非多聚体形式的前体或降解产物 , 可能是生理上需要这种更易扩散的分子 。而且 , 高等脊椎动物免疫应答过程 [ 6 , 12 ] ( ) 中由 IgM 转变为低分子量免疫球蛋白 哺乳动物为 IgG的现象在鱼类中几乎不存在。因此根据现有资料尚不能确 切回答这类低分子量免疫球蛋白与高分子量 IgM 的关系 。 [ 32 , 33 ] 硬骨鱼类皮肤和肠粘液中发现有抗体存在 , 它们似乎是由局部组织淋巴细胞产生的 , 而并非来自血清。但斑 [ 34 , 35 ] ( ) ( 点叉尾 和草鱼 Ctenopharyhngodeon idellus皮肤粘液中仅发现一类与血清中相同的免疫球蛋白。而羊头原鲷 Ar2 [ 36 ] ) chosargus probatocephalus皮肤粘液中存在两类免疫球蛋白 , 一类与血清免疫球蛋白相似 , 另一类为二聚体。鱼类胆汁 中免疫球蛋白的研究十分有限 。对于羊头原鲷的研究表明 :胆汁中免疫球蛋白在生理条件下为二聚体 , 在变性条件下解 [ 36 ] [ 37 ] ( μ) 离为单体 , 具有典型的轻链 , 但其重链比链小 约为 55kD, 并非来自血清的四聚体 IgM 。而杨桂文等通过对鲤胆 汁和血清中免疫球蛋白的某些理化性质和免疫原性进行比较研究 , 推断二者具有一定的同源性 。至此鱼类粘膜免疫系 统抗体特性及其与血清抗体间的关系尚不十分清楚 。 [ 38 - 40 ] 某些硬骨鱼类免疫球蛋白经还原 SDS - PA GE 分析呈现多条轻链蛋白质带 , 分子量 22,29kD 。用单抗及肽谱 ( ) 分析同样可以区分出斑点叉尾 和硬头鳟 S almo gairdneri免疫球蛋白中存在两类 L 链 , 这可能反映了硬骨鱼类 L 链的 [ 41 , 42 ] 不同种型。但是这一推测还有待于更精确的分子免疫学手段加以验证 。 1. 4 影响免疫球蛋白表达水平的因素 [ 43 ] ( 大多数鱼类的胸腺随着年龄的增长发生退化现象 , 这势必会对鱼体的免疫应答产生影响 。Tatner 等用 HGG 胸腺 ) ( ) 依赖性抗原和胸腺非依赖性抗原 Aeromonas salmonicida注射切除胸腺的成年硬头鳟 , 9 个月后 , 注射 HGG 的实验鱼抗 体滴度低于对照鱼 , 而实验鱼对胸腺非依赖性抗原的应答与对照鱼相当 。这说明随着鱼类年龄的增长 , 鱼体对胸腺依赖 性抗原的体液免疫应答水平有所下降 。激素在鲑科鱼类从幼鲑到初次由河入海的小鲑的转化中起着重要作用 , 而且在 [ 44 ] 此过程中血清总蛋白和 IgM 水平降低 , 入海后免疫球蛋白水平又恢复如初。 水 产 学 报 24 卷 378 [ 45 ] 环境胁迫也可影响鱼类免疫球蛋白表达水平 。如 , 运输使斑点叉尾 对有丝分裂原或抗原刺激不能产生应 答。 [ 46 ] 季节变化同样会影响免疫球蛋白在鱼体内的表达水平 , 夏季最高 , 冬季较低。这不仅仅是由环境温度变化引起的 , 可能还与光周期等因素有关 。 ( 影响鱼类免疫球蛋白表达水平的因素远不止这些 , 总而言之来自三个方面 : 抗原方面 包括抗原性质 、剂量 、免疫方 ) ( ) ( 式等、机体方面 包括性别 、年龄 、体长 、体重 、生长率 、营养状况以及激素水平等和环境方面 包括胁迫 、季节 、温度 、光 ) 照以及水体中的有机或无机物等。 2 非特异性免疫因子 在鱼类的体液 、组织和卵中存在多种非免疫球蛋白的蛋白质或糖蛋白分子 , 它们在鱼类非特异性防御机制中发挥着 重要作用 。根据它们对入侵病原微生物的效应可以将这些免疫因子分为以下几类 。 2. 1 微生物生长抑制物 ( ) 微生物生长抑制物 microbial growth inhibitory substance能够夺取微生物生长所需的基本养分 , 或在细胞内阻断其代 [ 47 ] 谢路径 , 从而可以干扰病原微生物的代谢作用。鱼类中微生物生长抑制物包括转铁蛋白 、血浆铜蓝蛋白 、金属硫蛋白 和干扰素等 。 [ 47 ] 转铁蛋白是由单一多肽链组成的糖蛋白 , 分子量约 80kD 。铁是微生物代谢和繁殖所必需的基本元素 。转铁蛋白 [ 6 ] 具有很高的铁结合能力 , 因此当它存在时 , 微生物的生长和繁殖便会受到抑制。转铁蛋白的抗菌活性还表现在直接作 [ 48 ] 用于病原菌的膜蛋白而实现杀菌作用。 血浆铜蓝蛋白是由单一多肽链组成的蓝蛋白 , 可以螯合铜和其它的二价阳离子 。血浆铜蓝蛋白又称为亚铁氧化酶 () f erroxidase, 因为它可以将亚铁离子氧化为高铁离子 , 后者将结合到转铁蛋白上 ; 在此过程中 , 血浆铜蓝蛋白可以加速周 [ 47 ] 围铁的转运 , 从而降低微生物获取的机会。 [ 47 ] 金属硫蛋白是一种低分子量 、热稳定的蛋白质 , 含有丰富的半胱氨酸用以结合铜 、锌 、镉和汞等金属离子。在环 境金属离子污染和机体炎症反应中 , 金属硫蛋白含量增加 , 能够特异性结合到巨噬细胞膜上 , 并引起巨噬细胞呼吸爆发 [ 6 , 49 ] ( ) respiratory burst和信号传递 , 其结果是巨噬细胞释放活化产物以杀灭细胞外环境中的细菌或寄生蠕虫。 (α) β干扰素能够抑制病毒的复制 , 是鱼类重要的抗病毒感染防御因子 , 分子量约 20kD 。包括 ?型 - 或- 干扰素和 [ 50 ] (γ) ?型 - 干扰素。 ?型干扰素是由白细胞和成纤维细胞产生 ; ?型干扰素可以在细胞分裂素刺激下由 T 淋巴细胞 [ 51 ] ( ) 产生 , 除了抗病毒作用外 , 还可以激活巨噬细胞 , 是一种重要的巨噬细胞活化因子 macrop hage activation f actor , MA F。2. 2 酶抑制剂 ( ) ( ) ( 在鱼类血清中存在多种酶抑制剂 enzyme inhibitor, 主要为蛋白酶抑制剂 , 包括 a 丝氨酸蛋白酶抑制剂 serine p ro2 ( ) ( ) ( ) ( ) ) teinase inhibitor、b半胱氨酸蛋白酶抑制剂 cysteine p roteinase inhibitor、c金属蛋白酶抑制剂 metallop roteinase inhibitor( )α(αα( ) ( ) ( ) ( ) ) dabcd和 2 - 巨球蛋白 2 - macroglobin , 2 - M。其中 和 能够特异性地与相应的酶结合 , 而 则能与所有的蛋 [ 47 ] 白酶结合。酶抑制剂的基本功能是维持机体血液和其它体液的内环境稳定 , 还可以调节补体系统和凝结机制的活 α性 。它们能够抑制许多病原微生物胞外酶的活性 , 能够调节抗原呈递作用 , 从而参与特异性免疫 。另外 ,2 - 巨球蛋白 () () 还能够与转化生长因子 transf orming growth f actor , TGF和血小板衍生生长因子 platelet derived growth f actor , PD GF等蛋 [ 50 ] 白质形成共价连接。 2. 3 细胞溶素 细胞溶解作用可以通过补体系统介导 , 也可以通过单一的细胞溶素来完成 。鱼类的细胞溶素有水解酶 、蛋白酶和一 些非特异性溶素 。 鱼类组织和分泌物中具有三类水解酶 , 分别是溶菌酶 、壳多糖酶和壳二糖酶 。它们作用于微生物表面的糖苷部分 。 [ 47 ] 溶菌酶可以破坏细菌细胞壁并对真菌细胞壁和昆虫的外骨骼进行有限的水解。壳多糖酶和壳二糖酶可以破坏外膜[ 52 ] 具有壳多糖的微生物或寄生虫。 鱼类皮肤粘液以及鳃和肠的表皮和上皮细胞层中都检测到蛋白酶 , 它们具有类似胰蛋白酶的活性 , 能够破坏革兰氏 [ 53 , 54 ] 阴性细菌。 鱼类血清中存在一种天然溶血素分子 , 它可能是一种酶 , 能够溶解异源红细胞和各种细菌 。在环境胁迫时 , 某些热 [ 47 ] 带海洋鱼类粘液中发现有毒素释放 , 属于胆碱酯 、小肽或低分子量碱性蛋白 , 可能具有抗寄生虫的作用。2 . 4 凝集素和沉淀素 ( ) 同其它脊椎动物一样 , 鱼类也具有相对非特异性自发产生的固有凝集素 agglutinin。它们属于蛋白质或糖蛋白 , 在 理化 、生物学和抗原特性方面均不同于抗原刺激产生的免疫球蛋白 。凝集素能够与碳水化合物和糖蛋白结合 , 从而使异 源细胞或微生物发生凝集 , 或使各种可溶性糖结合物发生沉淀 , 被认为是机体自然防御机制中原始的识别分子和免疫监 [ 47 ] 督分子。 () ( () ) α沉淀素 p recipitin包括 C - 反应蛋白 C - reactive p rotein , CRP、血清淀粉样 P 成分 serum amyloid P - comp onent 和 α(( ) - 沉淀素 - p recipitin。前二者是关系密切的血清蛋白 , 具有广泛的同源氨基酸序列 , 都是五聚体 , 作为急性期蛋白 a2 ) cute p hase p rotein反应时都需要钙离子 。但是 CRP 在组织损伤 、发炎或感染后浓度迅速增加 , 而血清淀粉样 P 成分并不 [ 47 ] 受此影响。CRP 存在于鱼类血清 、卵和精子中 , 其中卵和精子中的 CRP 可能来源于血清 。在钙离子存在时 , CRP 能够 与含有 C - 多糖或磷酸胆碱的大分子反应 , 而这些分子普遍存在于细菌 、真菌和寄生蠕虫等病原生物的细胞壁或其它表 面结构中 。作为调理素 , CRP 能够单独或通过经典途径激活补体系统来影响吞噬细胞的迁移 、吞噬和呼吸爆发 , 能够辅 [ 47 , 50 ] ( ) α助补体依赖性溶解作用并对自体衰老细胞的组分 尤其是染色质进行清除。- 沉淀素的防御功能可能表现在它 ( ) α们 包括 13 种蛋白成分能够与真菌等微生物表面的糖和糖蛋白发生反应 ; 另外 ,- 沉淀素也能与可溶性淀粉 , 特别是 [ 48 ] 支链淀粉反应。 2. 5 补体 [ 55 ] 补体系统是脊椎动物抵抗微生物感染的重要成分 , 由存在于体液中的数十种具有酶活性的球蛋白组成。随着有 颌鱼类的进化和免疫球蛋白的出现 , 补体激活通过经典途径得以实现 。与高等脊椎动物相同 , 有颌鱼类补体的生物学活 ( ) ( ) ( ) ( ) 性主要显示于以下两个方面 : a由替代 抗体非依赖性途径或经典 抗体依赖性途径激活的细胞溶解作用 ; b由被激 [ 6 , 55 , 56 ] 活的补体组分释放的片段所行使的调理作用。但是 , 鱼类补体对热更不稳定 , 具有更低的最适反应温度 , 更难于 [ 48 , 55 ] 保存 , 抗微生物活性更高 , 而且具有更明显的种或种群特异性。无颌鱼类的 C3 仅通过替代途径激活 , 其补体系统 [ 57 ] 的主要作用是促进细胞吞噬 , 而不是细胞溶解。软骨鱼类补体系统经典途径是由六种功能不同的成分组成 , 即 C1n, [ 58 ] [ 59 ] [ 60 ] C4n , C8n 和 C9n 。硬骨鱼类中发现有 C1, C9 等补体成分。而且虹鳟 C3和 C9 成分cDNA 序列已被测定与哺乳 动物相应成分具有很大的同源性 。 ( ) 硬骨鱼类补体因子是通过多糖 如脂多糖或免疫球蛋白 Fc 区糖基部分的存在来激活的 , 能够通过攻膜复合物完成 [ 50 ] 细胞溶解作用。包括血细胞溶解作用 、杀寄生虫活性 、杀菌和溶菌活性 、细菌胞外毒素灭活作用 、杀病毒活性和可能 的脱毒作用 。这些作用可能属于鱼类补体活性的同一机制 。补体激活过程中释放的片段具有广泛的调理作用 , 包括对 [ 48 , 55 ] ( ( ( ) ) ) 白细胞的化学吸引作用 C5a, 过敏作用 C3a和促进细胞吞噬活性的作用 C3b。攻膜复合物对细胞吞噬也具有 [ 6 ] 调理作用。可见 , 作为抗体和吞噬细胞间连接的中介 , 鱼类补体能够增强体液和细胞介导的特异性免疫 , 而且在宿主 [ 6 , 55 ] 非特异性自然防御机制中发挥重要作用 , 其中 C3 是补体系统的关键成分。 参考文献 : () 1 ] 李亚南 , 陈全震 , 邵健忠 , 等. 鱼类免疫学研究进展J . 动物学研究 , 1995 , 16 1: 83 - 94 . 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